Afsløring af cytoskeletal Organisationen af invasive kræftceller i 3D
Summary
Denne artikel præsenterer en metode til fluorescens mærke kollagen, der kan yderligere bruges til både fix og live imaging af 3D cellekulturer. Vi tilbyder også en optimeret protokol til at visualisere endogene cytoskeletproteiner af celler dyrket i 3D-miljøer.
Abstract
Cell migration er traditionelt blevet undersøgt i 2D substrater. Imidlertid er det blevet stadig mere klart, at der er behov for at studere cellemigrering i mere hensigtsmæssige 3D-miljøer, som bedre ligner dimensionalitet de fysiologiske processer i pågældende. Migrerende celler kan være meget forskellige i deres morfologi og funktion af migration, alt efter om de bevæger sig på 2D-eller 3D-substrater. På grund af tekniske vanskeligheder og uoverensstemmelser med de fleste standardprotokoller, strukturelle og funktionelle analyse af celler indlejret i 3D matricer stadig ualmindelige. Denne artikel beskriver metoder til forberedelse og billeddannelse af 3D kræft cellekulturer, enten som enkelte celler eller sfæroider. Som en passende ECM substrat for kræft cellemigration, bruger vi nonpepsinized rotte hale kollagen I polymeriseret ved stuetemperatur og fluorescensmærket at lette visualisering hjælp af standard konfokale mikroskoper. Dette arbejde omfatter også en protokolol til 3D immunofluorescent mærkning af endogene celle cytoskelet. Ved hjælp af disse protokoller vi håber at bidrage til en bedre beskrivelse af den molekylære sammensætning, lokalisering og funktioner cellulære strukturer i 3D.
Introduction
Feltet af cellevandring har trodset ind i helt nye tredje dimensionelle verden. Det er intuitivt at studere celle migration i et miljø, der mest ligner den fysiologiske én, og derfor, tre-dimensionelle (3D). Men på grund af tekniske begrænsninger, har de fleste cellevandring undersøgelser blevet udført analysere cellebevægelse tværs stive to-dimension (2D) substrater, enten ubehandlet eller belagt med passende ekstracellulære matrix (ECM) proteiner.
De første undersøgelser dedikeret til celle migration i tredimensionelle collagen gitre går tilbage over 20 år 1-3. Det er dog kun de seneste 5 år er det blevet klart, at migrerende celler væsentligt kunne variere i deres morfologi og funktion af migration afhængig dimensionalitet af underlaget. I 2D, kun celler kontakte underlaget med deres ventrale overflade ved hjælp fokale adhæsioner, resulterer i dannelsen af brede flade fremspring (lamellipodia) medindlejrede finger-lignende fremspring (filopodia) ved deres forkant. Disse strukturer, sammen med stress fibre, der forbinder cellen front til bagkanten, menes der at være afgørende for celle bevægelse i 2D. I 3D matricer, er celler generelt mere langstrakt, med hele celleoverfladen kontakt ECM, der forårsager betydelige ændringer i formationen og funktionelle relevans af mange af disse strukturer. Omvendt, andre cellulære funktioner vinde relevans i 3D migration, såsom nukleare deformation og strukturer involveret i ECM remodeling 4..
På trods af disse kendte morfologiske forandringer, samt forskelle i migration modes 5-7, som kan variere afhængigt af ECM og celletyper, strukturelle og funktionelle analyse af celler indlejret i 3D matricer stadig usædvanligt. Arbejde med tykke og tætte 3D matricer bærer tekniske vanskeligheder, såsom høj opløsning mikroskopi imaging, og uoverensstemmelser med de fleste standard protokoller optimeret til 2D kulturer, ligesom immunofluorescent mærkning af endogene proteiner. Også, fordi brugen af 3D matricer er en forholdsvis ny tilgang, er forskerne stadig undersøger de bedste betingelser for nøje ligner specifik in vivo situationer, såsom den normale stromalt arkitektur forskellige væv organer eller ECM organisationen omkring en tumor. Uoverensstemmelser i resultater ved de forskellige grupper om, for eksempel, har kræftcelle former for migration eller eksistensen af fokale sammenvoksninger, der genereres nogle kontroverser 8.. En stor indsats er for nylig blevet dedikeret til at nå til enighed i form af ECM kemisk art, porestørrelse, fiber tykkelse og matrix stivhed. Mange forskellige typer af 3D ECM'er er i øjeblikket anvendes, varierende fra celle afledte matricer til kommercielt tilgængelige Matrigel, pepsinized bovint kollagen I, eller nonpepsinized rotte hale kollagen I. Hver af disse matricer har specifikke fysiske og kemiske egenskaber, og et behov for at relate matrix af valg til den fysiologiske proces, der undersøges. Desuden kan porestørrelse og fiber tykkelse afhænger polymerisationsbetingelser betingelser, såsom pH og temperatur 9,10. Binding til og afstand fra stive substrater, såsom glas, kan også ændre de elastiske egenskaber af matricen 10,11.
Denne artikel beskriver metoder til forberedelse og billeddannelse af 3D kræft cellekulturer, enten som enkelte celler eller sfæroider. Fremgangsmåder til fremstilling kræftcelleproteiner sfæroider er tidligere blevet beskrevet, de mest populære er den hængende dråbe metode 12,13 og agarose-overtrukne plade metode 14.. Som en passende ECM substrat for kræft cellemigration er nonpepsinized rotte hale kollagen I polymeriseret ved stuetemperatur anvendes ved 2 mg / ml. Nonpepsinized syreekstraherede kollagen I fra rotte hale bevarer både N-og C-terminale telopeptider, nonhelical dele af kollagenmolekylet ansvarlige for nativt kollagen intermolecular tværbinding og fibrilar stabilitet 15.. Tilsammen udgør disse forhold tillader dannelsen af kollagen netværk, at de fleste ligner dem observeret in vivo 10.. At tillade visualisering af collagenfibre, både i faste og levende kulturer, er en detaljeret protokol billede til fluorescens mærke kollagen in vitro 10 under anvendelse af 5 – (og-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), succinimidylester. Denne protokol er blevet tilpasset fra Baici et al. 16,17, hvor fluoresceinisothiocyanat bruges til at mærke opløselige kollagen molekyler. Som fluorescein, er TAMRA en amino-reaktivt fluorescerende farvestof, der reagerer med protoneret alifatiske aminogrupper i proteiner, såsom den frie aminogruppe ved N-terminalen og, endnu vigtigere, den side aminogruppe af lysiner. Denne reaktion forekommer kun ved basisk pH, når lysin aminogruppe er i protoneret form,. Ud over at TAMRA være mere stabil end fluorescein løbettid, dens emissionsspektre falder på den orange / røde område (ex / em = 555/518 nm), der med fordel kan kombineres til levende celler af GFP-mærkede proteiner. Brug opløselige collagen mærkede molekyler med amino-reaktive farvestoffer påvirker ikke polymerisationsprocessen eller tæthed, porestørrelse og tværbinding status kollagenmatrixen 10,16,18,19.
Denne protokol omfatter også en fremgangsmåde til 3D immunofluorescent mærkning af endogene proteiner, som er blevet yderligere optimeret til at mærke cytoskelettet eller cytoskelet associerede proteiner. Den endelige fokus i denne protokol på metoder til at erhverve høj opløsning billeder af 3D-kulturer ved hjælp af konfokal mikroskopi med reduceret tilskud fra stive dækglas på collagen matrix spænding.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her til fluorescens mærke kollagen I bruger TAMRA giver en fremragende metode til at give nem visualisering af kollagen nettet organisation, ved hjælp af en standard konfokal mikroskop udstyret med en 561 nm laser. En fordel ved denne teknik sammenligne reflektans konfokal mikroskopi er evnen til billede collagenfibre dybere ind på 3D matrix. Intensiteten og kontrast fibre refleksion reduceres væsentligt med dybden på grund af laserlys absorption og spredning. Desuden kan orienteringen af ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Vasily Gurchenkov (Institut Curie) for billedet erhverve og forarbejdning i figur 3, og PICT-IBISA Imaging Facility (Institut Curie). Dette arbejde blev støttet af ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 og PIC 3D – Complex in vitro cellulære modeller.
Materials
| TAMRA, SE | Invitrogen | C-1171 | |
| Rat tail Collagen High Concentration | BD Biosciences | 354249 | |
| Rat tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Phalloidin | Sigma | P2141 | |
| Taxol (Paxitel) | Sigma | T7402 | |
| Mouse anti-alpha Tubulin antibody | Sigma | T9026 | |
| Alexa 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A21052 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting media | Fisher Scientific | 106 226 89 | |
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis Cassette | Pierce | 66380 | |
| Glass bottom dishes | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Imaris 7.2.3 | Bitplane |
References
- Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells. Cell. 67 (2), 403-410 (1991).
- Klein, C. E., Dressel, D., et al. Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils. J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).
- Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Zänker, K. S. Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44. Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).
- Fraley, S. I., Feng, Y., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Harunaga, J. S., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesions in 3D. Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).
- Raub, C. B., Suresh, V., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
- Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?. Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).
- Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering. J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), (2011).
- Haji-Karim, M., Carlsson, J. Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin. Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).
- Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. Cross-linking in collagen and elastin. Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).
- Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., Böni, A. A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils. Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).
- Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels. J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).
- Sabeh, F., Ota, I., et al. Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP. J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).
- Jawerth, L. M., Münster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks. Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).
- Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy. J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).
