3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya
Summary
Bu makalede, floresan daha düzeltme ve 3D-hücre kültürleri canlı görüntüleme için kullanılabilir kollajen etiketlemek için bir yöntem sunar. Ayrıca 3D ortamlarda kültür hücrelerinin endojen iskelet proteinleri görselleştirmek için optimize edilmiş bir protokol sağlar.
Abstract
Hücre göçü geleneksel 2 boyutlu yüzeyler çalışılmıştır. Bununla birlikte, daha iyi bir soru olarak fizyolojik süreçlerin boyutluluk benzer daha uygun 3D ortamlar, hücre göçü incelemek için bir ihtiyaç olduğu giderek daha belirgin hale gelmiştir. Göçmen hücreleri ölçüde onlar 2D veya 3D yüzeylerde hareket ediyor olmasına bağlı olarak kendi morfolojisi ve göç modunda farklı olabilir. En standart protokoller, 3D matris içinde gömülü hücrelerin yapısal ve fonksiyonel analiz ile teknik zorluklar ve uyumsuzluklar nedeniyle hala yaygın olmaya devam etmektedir. Bu makalede, tek bir hücre ya da sferoidlerinde hazırlanması ve 3D-kanser hücresi kültürlerinin görüntüleme yöntemleri açıklanır. Kanser hücresi göç için uygun bir ECM substrat olarak, I oda sıcaklığında polimerize ve floresan standart konfokal mikroskop kullanarak vizüalizasyon etiketli nonpepsinized, fare kuyruk kolajeni kullanın. Bu çalışma aynı zamanda bir protoc içerirendojen hücre hücre iskeletinin 3D immunofluorescent etiketleme için ol. Biz moleküler kompozisyon, lokalizasyonu ve 3D hücresel yapıların fonksiyonları daha iyi bir açıklama katkıda bulunmayı umuyoruz bu protokolleri kullanarak.
Introduction
Hücre göçü alanında yepyeni üçüncü boyut dünyasına braving edilmiştir. Bu en yakından andıran bir fizyolojik ve (3 boyutlu) bu nedenle, üç boyutlu bir ortamda hücre göçü çalışma sezgiseldir. Ancak, teknik sınırlamalar nedeniyle, çoğu cep göç çalışmaları işlenmemiş veya uygun hücre dışı matriks (ECM) proteinleri ile kaplanmış ya, sert iki boyutlu (2D) yüzeyler boyunca hücre hareketi analiz yapılmıştır.
Üç boyutlu kollajen kafesler içinde hücre göçü adanmış ilk çalışmalar 20 yıl 1-3 geçirin. Ancak, son 5 yılda bu göçmen hücreler önemli ölçüde kendi morfolojisi ve yüzey boyutluluk bağlı olarak göç modunda farklı olabilir netlik kazandı. 2D, hücreler yalnızca geniş düz çıkıntılar oluşumu (lamellipodia) ile sonuçlanan, fokal yapışıklıklar kullanarak ventral yüzeyi ile yüzeye temasonların öncü gömülü parmak şeklinde çıkıntılar (filopodia). Bu yapılar, bir araya firar kenarı için hücre ön bağlantı stres lifleri ile, 2 hücre hareketi için önemli olduğuna inanılmaktadır. 3D matrisleri olarak, hücre formasyonu ve bu yapıların birçok fonksiyonel önemi önemli değişikliklere yol açan, ECM ile temas eden tüm hücre yüzeyi ile birlikte, genel olarak daha uzun vardır. Tersine, diğer hücresel özellikleri, ECM yeniden 4 dahil nükleer deformasyon ve yapıları gibi 3D göç alaka, kazanmak.
Bu bilinen morfolojik değişiklikler, hem de ECM ve hücre tipleri, 3 boyutlu matris içinde gömülü hücrelerinin yapısal ve fonksiyonel analizi bağlı olarak değişebilir 5-7 geçiş modları farklılıklara rağmen yine de alışılmadık kalır. Kalın ve yoğun 3D matrisler çalışma teknik, yüksek çözünürlüklü mikroskopi görüntüleme gibi zorluklar, ve en sta uyumsuzluğa taşırndard protokolleri endojen proteinlerin immunofluorescent etiketleme gibi, 2D kültürler için optimize edilmiş. 3D matris kullanımı nispeten yeni bir yaklaşımdır çünkü Ayrıca, araştırmacılar hala yakından farklı doku organların normal stromal mimarisi veya tümör etrafında ECM örgütü olarak in vivo durumlarda, belirli benzemeye en iyi koşulları araştırıyor. Ilgili farklı gruplar tarafından sonuçlarında farklılıklar, örneğin, kanser hücresi göç modları veya fokal yapışıklıklar varlığı, bazı tartışmalara 8 yarattı. Çaba Bir çok yakın zamanda ECM kimyasal yapısı, gözenek boyutu, lif kalınlığı, ve matris sertlik açısından bir uzlaşma ithaf edilmiştir. 3D ECMlerin birçok farklı türde anda hücre türetilmiş matrislerden ticari olarak temin Matrigel pepsinized sığır kollagen I ya da nonpepsinized, fare kuyruk kolajeni I. Bu matrislerden her biri belirli fiziksel ve kimyasal özelliklere sahiptir ve gerçek bir ihtiyaç değişen, kullanılante fizyolojik sürecine tercih matris çalışılmaktadır. Buna ek olarak, gözenek boyutu ve lif kalınlığı, pH ve sıcaklık gibi 9,10 polimerizasyon koşulları, bağlıdır. Cam gibi sert yüzeyler, dan ve mesafe bağlama da matris 10,11 elastik özelliklerini değiştirebilirsiniz.
Bu makalede, tek bir hücre ya da sferoidlerinde hazırlanması ve 3D-kanser hücresi kültürlerinin görüntüleme yöntemleri açıklanır. Kanser hücresi parçacıklarının üretilmesi için yöntemler, daha önce Asılı damla yönteminde, 12,13 ve agaroz kaplı plaka yöntemi 14 olan en popüler olanlar tarif edilmiştir. Kanser hücresi göç için uygun bir ECM substrat olarak, oda-sıcaklığında polimerize nonpepsinized, fare kuyruk kolajeni 2 mg / ml 'de kullanılmıştır. Nonpepsinized asitle ekstre kollajen sıçan kuyruk her ikisi de N-ve C-terminal telopeptid, doğal kolajen intermolec sorumlu kollajen molekülü nonhelical bölümleri korurular çapraz ve fibriller istikrar 15. Bununla birlikte, bu, in vivo koşullarda en yakın 10 gözlenen benzer olanlar kollajen ağların oluşmasına izin verir. Sabit ve oturma kültürlerde hem kolajen lifleri, görselleştirme izin vermek için, ayrıntılı bir protokol floresan 5 kullanılarak in vitro 10 kolajen etiketlemek için sağlanmaktadır – (and-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), süksinimidil ester. Bu protokol, Baici ark adapte edilmiştir. Floresein izotiosiyanat çözülebilir kolajen molekülü etiketlemek için kullanılır 16,17. Floresein gibi, TAMRA, örneğin N-terminalinde bulunan serbest amino grubu ve daha da önemlisi, lisinlerin yan amino grubu gibi proteinlerin nonprotonated alifatik amino grupları ile reaksiyona giren bir amino-reaktif bir floresan boya. Lisin amino grubu nonprotonated biçiminde olduğunda Bu reaksiyon, sadece temel bir pH değerinde meydana gelir. TAMRA fazla floresein daha kararlı olmasının yanı sıra,zaman, kendi emisyon spektrumları yararlı GFP etiketli proteinlerin canlı hücre görüntüleme için kombine edilebilir kırmızı / turuncu aralığı (ex / em = 555/518 nm), düşüyor. Amino-reaktif boyalar ile çözülebilir kolajen etiketli moleküller kullanılarak polimerizasyon işlemi ya yoğunluğu, gözenek büyüklüğü ve kollajen matris 10,16,18,19 arasında çapraz bağlanma durumunu etkilemez.
Bu protokol aynı zamanda daha iskeleti veya hücre iskeleti ilişkili protein etiketlemek için optimize edilmiştir endojen protein, 3 boyutlu immunofluorescent etiketleme için bir yöntem içerir. Bu protokolün son odak kollajen matriks gerginlik sert cam lamelleri gelen düşük katkı ile konfokal mikroskopi kullanılarak 3D kültürlerin yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için yöntemler üzerinde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol floresan bir 561 nm lazer ile donatılmış bir standart konfokal mikroskop kullanarak, kollajen ağ organizasyonu kolay görselleştirme izin için mükemmel bir yöntem sağlar TAMRA kullanarak kollajen etiketlemek için burada açıklanan. Yansıma konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, bu tekniğin bir avantajı, 3D matris derinliklerine dosyasını kolajen lifleri yeteneğidir. Liflerin yansıma yoğunluğuna ve kontrast lazer ışığı emme ve saçılma bağlı derinliği ile esas olarak a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar minnetle görüntü Şekil 3 ve PICT Ibisa Görüntüleme Tesisi (Institute Curie) olarak edinme ve işleme için Dr Vasily Gurchenkov (Institut Curie) kabul. In vitro hücre modellerinde Kompleksi – Bu çalışma ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 ve PIC 3D tarafından desteklenmiştir.
Materials
| TAMRA, SE | Invitrogen | C-1171 | |
| Rat tail Collagen High Concentration | BD Biosciences | 354249 | |
| Rat tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Phalloidin | Sigma | P2141 | |
| Taxol (Paxitel) | Sigma | T7402 | |
| Mouse anti-alpha Tubulin antibody | Sigma | T9026 | |
| Alexa 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A21052 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting media | Fisher Scientific | 106 226 89 | |
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis Cassette | Pierce | 66380 | |
| Glass bottom dishes | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Imaris 7.2.3 | Bitplane |
References
- Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells. Cell. 67 (2), 403-410 (1991).
- Klein, C. E., Dressel, D., et al. Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils. J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).
- Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Zänker, K. S. Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44. Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).
- Fraley, S. I., Feng, Y., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Harunaga, J. S., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesions in 3D. Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).
- Raub, C. B., Suresh, V., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
- Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?. Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).
- Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering. J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), (2011).
- Haji-Karim, M., Carlsson, J. Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin. Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).
- Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. Cross-linking in collagen and elastin. Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).
- Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., Böni, A. A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils. Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).
- Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels. J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).
- Sabeh, F., Ota, I., et al. Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP. J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).
- Jawerth, L. M., Münster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks. Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).
- Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy. J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).
