Révéler l'organisation du cytosquelette des cellules invasives du cancer en 3D
Summary
Cet article présente une méthode pour étiqueter fluorescence collagène qui peut encore être utilisé à la fois fixe et imagerie en temps réel des cultures cellulaires en 3D. Nous fournissons également un protocole optimisé pour visualiser les protéines du cytosquelette endogènes des cellules cultivées dans des environnements 3D.
Abstract
La migration cellulaire a traditionnellement été étudié dans des substrats 2D. Cependant, il est devenu de plus en plus évident qu'il est nécessaire d'étudier la migration cellulaire dans des environnements 3D plus appropriées, qui ressemblent mieux la dimensionnalité des processus physiologiques en question. Cellules migratrices peuvent différer substantiellement dans leur morphologie et leur mode de migration selon qu'ils se déplacent sur des substrats 2D ou 3D. En raison de difficultés techniques et d'incompatibilités avec la plupart des protocoles standard, l'analyse structurelle et fonctionnelle des cellules incorporées dans des matrices 3D reste encore rare. Cet article décrit les méthodes de préparation et d'imagerie de cultures de cellules cancéreuses 3D, que ce soit sous forme de cellules ou de sphéroïdes simples. Comme un substrat d'ECM approprié pour la migration des cellules cancéreuses, nous utilisons nonpepsinized collagène de queue de rat je polymérisé à température ambiante et marqué par fluorescence pour faciliter la visualisation en utilisant microscopie confocale standard. Ce travail comprend également un protocol pour le marquage par immunofluorescence 3D du cytosquelette de la cellule endogène. L'utilisation de ces protocoles, nous espérons contribuer à une meilleure description de la composition moléculaire, la localisation et les fonctions des structures cellulaires en 3D.
Introduction
Le domaine de la migration cellulaire a été bravant dans le nouveau monde de troisième dimension de la marque. Il est intuitif pour étudier la migration cellulaire dans un environnement qui ressemble le plus à celui physiologique et, par conséquent, en trois dimensions (3D). Toutefois, en raison de limitations techniques, des études de migration plus cellulaires ont été faites analyser le mouvement des cellules à travers des substrats à deux dimensions (2D) rigides, soit non traitées ou enrobées de protéines de la matrice extracellulaire appropriés (ECM).
Les premières études consacrées à la migration des cellules dans trois réseaux de collagène dimensions remontent plus de 20 ans 1-3. Toutefois, seulement au cours des 5 dernières années, il est devenu clair que les cellules migratrices pourraient différer substantiellement dans leur morphologie et leur mode de migration en fonction de la dimension du substrat. En 2D, les cellules ne contacter le substrat avec sa surface ventrale en utilisant des points d'adhésion, aboutissant à la formation de larges parties saillantes plates (lamellipode) avecprotubérances en forme de doigt embarqués (filopodia) à leur bord d'attaque. Ces structures, en même temps que les fibres de stress qui relient l'avant de la cellule au bord de fuite, sont considérées comme cruciale pour le mouvement de cellule à 2D. Dans les matrices 3D, les cellules sont généralement plus allongée, avec toute la surface de la cellule communiquant avec l'ECM, provoquant des changements considérables dans la formation et la pertinence fonctionnelle de plusieurs de ces structures. Inversement, d'autres caractéristiques cellulaires gagnent en pertinence migration 3D, telle que déformation nucléaire et structures impliqués dans remodelage de la MEC 4.
En dépit de ces altérations morphologiques connus, ainsi que les différences dans les modes de migration 5-7, qui peut varier en fonction de l'ECM et de types de cellules, l'analyse structurelle et fonctionnelle des cellules incorporées dans des matrices 3D reste encore rare. Travailler avec des matrices 3D épais et dense porte difficultés techniques, telles que l'imagerie par microscopie à haute résolution, et des incompatibilités avec plus standard protocoles optimisés pour les cultures 2D, comme l'étiquetage immunofluorescence des protéines endogènes. Aussi, parce que l'utilisation de matrices 3D est une approche relativement nouvelle, les chercheurs sont en train de rechercher les meilleures conditions pour ressembler étroitement spécifique dans les situations in vivo, tels que l'architecture du stroma normal des différents organes de tissus ou de l'organisation ECM autour d'une tumeur. Les écarts dans les résultats des différents groupes concernant, par exemple, les modes de cellules cancéreuses de la migration ou l'existence d'adhérences focales, ont suscité une certaine controverse 8. Beaucoup d'efforts ont été récemment consacrée à parvenir à un consensus en termes d'ECM nature chimique, la taille des pores, l'épaisseur de la fibre, et la rigidité de la matrice. De nombreux types d'ECM 3D sont actuellement utilisés, allant de cellules dérivées de matrices matrigel disponible dans le commerce, le collagène pepsine bovine I, ou nonpepsinized queue de rat collagène I. Chacune de ces matrices a des propriétés physiques et chimiques spécifiques et on a besoin de relationste la matrice de choix pour le processus physiologique à l'étude. En outre, la taille et la fibre épaisseur des pores peut dépendre des conditions de polymérisation, tels que le pH et la température de 9,10. La liaison à distance et de supports rigides tels que le verre, peut également modifier les propriétés élastiques de la matrice 10,11.
Cet article décrit les méthodes de préparation et d'imagerie de cultures de cellules cancéreuses 3D, que ce soit sous forme de cellules ou de sphéroïdes simples. Procédés de fabrication de sphéroïdes de cellules cancéreuses ont déjà été décrits, plus populaires étant la méthode de la goutte suspendue 12,13 et la méthode de la plaque d'agarose enduit 14. En tant que substrat d'ECM approprié pour la migration des cellules de cancer, nonpepsinized collagène de queue de rat I polymérisé à température ambiante est utilisé à 2 mg / ml. Nonpepsinized collagène acido-extrait I de queue de rat conserve les deux C-terminale et N-télopeptides, les portions non hélicoïdale de la molécule de collagène responsables de collagène natif intermolecréticulation culier et la stabilité fibrilar 15. Ensemble, ces conditions permettent la formation de réseaux de collagène qui ressemblent le plus à ceux observés in vivo 10. Pour permettre la visualisation des fibres de collagène, à la fois dans les cultures fixes et de vie, un protocole détaillé est prévu pour marquer par fluorescence collagène in vitro, 10 à l'aide de 5 – (et-6)-carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA), ester de succinimidyle. Ce protocole a été adapté à partir de Baici et al. 16,17, où l'isothiocyanate de fluorescéine est utilisée pour marquer les molécules de collagène solubles. Que la fluorescéine, TAMRA est un colorant fluorescent amino-réactif qui réagit avec les groupes amino aliphatiques non protoné de protéines, tels que le groupe amino libre à l'extrémité N-terminale et, plus important encore, le groupe amino côté de lysines. Cette réaction se produit uniquement à pH basique, lorsque le groupe amino de lysine se présente sous forme non protoné. En plus de TAMRA être plus stable que la fluorescéine surtemps, son spectre d'émission se situe sur la gamme orange / rouge (ex / em = 555/518 nm), qui peut être utilement combiné pour l'imagerie des cellules vivantes de protéines GFP-taggés. Utilisation de collagène solubles molécules marquées avec des colorants amino-réactifs n'a pas d'incidence sur le procédé de polymérisation, ni la densité, la taille des pores et de l'état de réticulation de la matrice de collagène 10,16,18,19.
Ce protocole comprend également un procédé de marquage par immunofluorescence 3D des protéines endogènes, qui a été encore optimisé pour marquer le cytosquelette ou protéines associées cytosquelette. L'objectif final de ce protocole est sur les méthodes pour acquérir des images à haute résolution des cultures 3D en utilisant la microscopie confocale à contribution réduite à partir de lamelles de verre rigides sur la tension de la matrice de collagène.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici pour identifier fluorescence collagène I en utilisant TAMRA fournit une excellente méthode pour permettre la visualisation facile de l'organisation du réseau de collagène, en utilisant un microscope confocal équipé en standard d'un laser 561 nm. Un avantage de cette technique comparant à microscopie confocale de réflectance est la capacité de fibres de collagène d'image plus profondément dans la matrice 3D. L'intensité et le contraste de la réflexion des fibres dimin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Dr Vasily Gurchenkov (Institut Curie) pour l'image acquisition et de traitement de la figure 3 et PICT-IBISA Facility Imaging (Institut Curie). Ce travail a été soutenu par l'ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 et PIC 3D – Complexe modèles cellulaires in vitro.
Materials
| TAMRA, SE | Invitrogen | C-1171 | |
| Rat tail Collagen High Concentration | BD Biosciences | 354249 | |
| Rat tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Phalloidin | Sigma | P2141 | |
| Taxol (Paxitel) | Sigma | T7402 | |
| Mouse anti-alpha Tubulin antibody | Sigma | T9026 | |
| Alexa 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A21052 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting media | Fisher Scientific | 106 226 89 | |
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis Cassette | Pierce | 66380 | |
| Glass bottom dishes | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Imaris 7.2.3 | Bitplane |
References
- Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells. Cell. 67 (2), 403-410 (1991).
- Klein, C. E., Dressel, D., et al. Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils. J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).
- Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Zänker, K. S. Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44. Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).
- Fraley, S. I., Feng, Y., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Harunaga, J. S., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesions in 3D. Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).
- Raub, C. B., Suresh, V., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
- Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?. Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).
- Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering. J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), (2011).
- Haji-Karim, M., Carlsson, J. Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin. Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).
- Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. Cross-linking in collagen and elastin. Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).
- Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., Böni, A. A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils. Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).
- Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels. J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).
- Sabeh, F., Ota, I., et al. Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP. J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).
- Jawerth, L. M., Münster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks. Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).
- Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy. J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).
