Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Published: October 21, 2013 doi: 10.3791/50771
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, University of California at Riverside

Summary

A Mikrokanälen-on-a-Chip-Plattform wurde durch die Kombination von photolithographischen reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik entwickelt. Die endothelialisierten Mikrokanäle Plattform imitiert die dreidimensionale (3D) Geometrie in vivo Mikrogefäßen läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss, ermöglicht qualitativ hochwertige und Echtzeit-Bildgebung und kann für mikrovaskuläre Forschung angewendet werden.

Abstract

Die Anstrengungen haben sich auf die Entwicklung in-vitro-Assays zur Untersuchung der Mikrogefäßen konzentriert, weil in vivo Tierstudien mehr zeitaufwendig, teuer und Beobachtung und Quantifizierung sind sehr anspruchsvoll. Jedoch haben herkömmliche in vitro Assays microvessel Einschränkungen bei der Darstellung in vivo microvessels bezüglich dreidimensionale (3D)-Geometrie und eine kontinuierliche Strömung. Mit einer Kombination von Photolithographie reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik, haben wir eine Multi-Tiefe kreisförmigen Querschnitt endothelialisierten entwickelt Mikrokanäle-on-a-Chip, der die 3D-Geometrie in vivo Mikrogefäßen imitiert und läuft unter kontrollierten kontinuierliche Perfusion fließen. Eine positive reflowable Photoresist wurde verwendet, um eine Master-Form mit einem halbkreisförmigen Querschnitt Mikrokanal Netzwerk herzustellen. Nach der Ausrichtung und Verbindung der beiden Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikrokanäle ersicated von der Urform wurde ein zylindrischer Mikrokanal Netzwerk erstellt. Die Durchmesser der Mikrokanäle kann gut beherrscht. Darüber hinaus zeigte primäre humane Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) innerhalb des Chips ausgesät, dass die Zellen mit der Innenfläche der Mikrokanäle ausgekleidet unter kontrollierten Perfusion dauernd für einen Zeitraum von 4 Tagen bis 2 Wochen.

Introduction

Mikrogefäßen als Teil des Kreislaufsystems, vermitteln die Wechselwirkungen zwischen Blut und Gewebe, unterstützt Stoffwechselaktivitäten, definieren Gewebe Mikroumgebung und spielen eine entscheidende Rolle in vielen Gesundheits-und pathologischen Bedingungen. Zusammenfassung der funktionellen microvessels in vitro konnte eine Plattform für die Untersuchung von komplexen vaskulären Erscheinungen bereitzustellen. Jedoch sind herkömmliche in vitro Assays microvessel wie Endothelzellmigration Assays Bildung endothelialer Gefäße Assays und Ratte und Maus Aortenring Assays nicht die in vivo microvessels neu in Bezug auf dreidimensionale (3D)-Geometrie und kontinuierlichen Steuerung 1-8. Studium der Mikrogefäßen anhand von Tiermodellen und in-vivo-Untersuchungen, wie Hornhaut-Angiogenese-Assay, chick Chorioallantoismembran Angiogenese Assay und Matrigel-Plug-Assay sind zeitaufwendiger, hohe Kosten, herausfordernde bezüglich Beobachtung und Quantifizierung undethische Fragen aufwerfen, 1, 9-13.

Advances in Mikrotechnik und Mikrofluidik-Chip-Technologien haben eine Vielzahl von Einblicken in biomedizinischen Wissenschaften aktiviert, während beschneidet die hohen experimentellen Kosten und Komplexitäten mit Tieren und in vivo-Studien 14, wie einfach und streng kontrolliert biologischen Bedingungen und dynamischen Umgebungen Fluidik, die nicht hätten zugeordnet war mit herkömmlichen makroskopischen Techniken möglich.

Hier präsentieren wir einen Ansatz für eine endothelialisierten konstruieren Mikrokanäle-on-a-Chip, der die 3D-Geometrie in vivo Mikrogefäßen imitiert und läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss durch die einzigartige Kombination von Photolithographie reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie, und Mikrofluidik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Photolithographie Herstellung von Fotolack Meister Mold

Das folgende Protokoll zeigt den Prozess, um die Mikrokanäle mit Durchmessern zwischen 30-60 um herzustellen. Um einen Mikrokanal mit einem kleineren Durchmesser (weniger als 30 Mikrometer), einem Dreh-Beschichtung aus Photoresist zu erhalten benötigt.

  1. Übertragen Sie die Reflow Fotolack aus dem Kühlschrank bei 4 ° C bis zur Reinraum 24 Stunden vor dem Gebrauch und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur erwärmen.
  2. Reinigen eines Silizium-Wafers und backen es für eine Stunde bei 150 ° C, damit sie austrocknen. Die Dehydratisierung wird das Photoresist Haftung auf dem Silizium-Substrat zu unterstützen.
  3. Spin-Beschichtung der ersten Schicht aus Photoresist mit folgender Rezeptur:
Schritt Zeit (Sekunden) Geschwindigkeit (rpm) Beschleunigung
1 2 </ Td> 300 höchste
2 10 0
3 3 300 höchste
4 60 600 höchste
5 10 500 höchste
6 10 600 höchste
  1. Dann backen die Wafer auf einer Heizplatte mit einer Temperatur von 110 ° C für 90 sek. Nach dem Weichbacken die Dicke der Fotolack wird 20-30 um betragen.
  2. Schleuderbeschichten einer zweiten Schicht aus Photoresist nach der gleichen Rezeptur für die erste Schicht verwendet wird.
  3. Weichbacken der Wafer erneut, indem Sie es auf einer Heizplatte mit einer Temperatur von 110 ° C für 90 sec. Nach dieser Weichbacken die Dicke der Fotolack wird 40-60 um betragen.
  4. Generieren positive Urmodelle indem die PHOTOResist mit UV-Licht mit einer Belichtungsdosis von 14.500 mJ / cm 2 durch eine Filmmaske.
  5. Verdünnen Sie die Entwickler mit deionisiertem (DI) Wasser (1:2 (v / v)). Spülen Sie den Wafer wiederholt in der Lösung, bis das Muster voll entwickelt ist. Dann waschen Sie den Wafer mit DI-Wasser und trocknen Sie sie mit Hilfe von Stickstoff.
  6. Reflow: Platz der Wafer auf einer Heizplatte mit einer Temperatur von 120 ° C für 4 min und Deckel mit einem Glas Petrischale zur Verdampfung des Lösungsmittels zu verhindern. Entfernen Sie die Wafer von der Kochstelle und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen. Die Photoresistdicke nach dem Reflow werden 50-60 um betragen.

2. Softlithographie Herstellung von PDMS Microchannel Netzwerk

  1. Bereiten Polydimethylsiloxan (PDMS)-Lösung in einem Gewichtsverhältnis von 10:1 (Basis: Härter) und mischen Sie es gründlich mit einem planetarischen Zentrifugalmischers.
  2. Wandelt den PDMS-Lösung auf dem Reflow Fotolack Urform. Legen Sie die gegossene PDMS in einem Exsikkator für 15 min zur Entgasung. Verwenden Stickstoffgas, um alle verbleibenden Luftblasen zu entfernen, wenn nötig.
  3. Backen des PDMS in einem Ofen bei einer Temperatur von 60 ° C für 3 Stunden, um es zu härten. Entfernen Sie dann die gehärteten PDMS Schicht von der Urform.
  4. Verwenden Sie eine geschärfte Puncher zu Einlass / Auslass Löcher durch Stanzen von Löchern in der Channel-Netzwerk zu erstellen. Reinigen Sie die Oberfläche des PDMS mit Hilfe von Stickstoff.
  5. Behandle zwei PDMS-Schichten mit Sauerstoff-Plasma für 30 sec in einem Plasma-Reiniger bei einem Betriebsdruck von 4,5 x 10 -2 Torr und einem Sauerstoff-Fluss von 3,5 m 3 / min. Dann Ausrichtung der Oberflächen der PDMS manuell unter einem optischen Mikroskop. Verwenden Sie einen Tropfen Wasser, wenn nötig für eine bessere Kontrolle der Ausrichtung.
  6. Backen Sie das Gerät in einem Ofen bei 60 ° C für 30 min, um eine dauerhafte Verklebung zu erreichen.

3. HUVEC Kultur und Seeding in den Chip

  1. Kultur die HUVECs mit Kulturmedium mit L-Glutamin mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt. Für the Experiment Durchgänge zwischen 2 und 5 verwendet wurden.
  2. Sobald die HUVECs konfluent sind, zählen die Zellen und ernten sie nach ersten Spülen der Zellen mit HEPES gepufferte Salzlösung (HEPES-BSS), und dann behandeln die Zellen mit Trypsin / EDTA und Inkubation für 2-6 min bei 37 ° C Nachdem die Trypsinierung abgeschlossen ist, neutralisieren die Trypsin / EDTA mit Trypsin Neutralisationslösung. Zentrifuge und die Zellen in Kulturmedium mit 8% Dextran, sie zu sammeln. Dextran wurde verwendet, um die mittlere Viskosität zu erhöhen, um in besser Zellaussaat und Anhänglichkeit zu unterstützen.
  3. Behandeln Sie das Gerät mit Sauerstoff-Plasma für 5 min mit einem Betriebsdruck von 4,5 x 10 -2 Torr und einem Sauerstoff-Fluss von 3,5 m 3 / min. Dann laden Sie das Gerät mit DI-Wasser und Behandlung mit UV-Licht für 8 h in einer laminaren Biosicherheit Haube für die Sterilisation.
  4. Eines Tages, bevor die Zellen fertig sind, waschen Sie das Gerät mit 1x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (1x PBS) anschließend mit Fibronektin (100 ug / ml, dilausgeschüttet mit 1x PBS) und Inkubation im Kühlschrank bei 4 ° C über Nacht.
  5. Nach dem Fibronectinbeschichtung, waschen Sie das Gerät mit 1x PBS dann mit Kulturmedium zu laden. Inkubieren der Vorrichtung bei einer Temperatur von 37 ° C für 15 min.
  6. Legen Sie die HUVEC-Zellen in 8% Dextran Kulturmedium mit einer Zellkonzentration von 3-4 x 10 6 Zellen / ml. Legen Sie eine 20 ul Tröpfchen von Zellen an einem Einlass des Geräts und kippen, um die Zellen in den mikrofluidischen Kanal einzuführen. Nach 15-20 min werden die Zellen beginnen zu den Seitenwänden der Kanäle zu befestigen. Drehen Sie das Gerät alle 15 Minuten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu schaffen. Falls erforderlich, kann eine zusätzliche Belastung durchgeführt werden.

4. Langfristige Perfusion-Setup

Nach 5-6 h statischer Kultur, werden die angeschlossenen HUVECs beginnen, voll ausbreiten. Richten Sie Perfusion mit einem ferngesteuerten Spritzenpumpensystem mit einem stetigen Strom von 10 ul / hr. Perfusion kann f eingestellt werdenoder eine höhere Strömungsgeschwindigkeit und kann für einen Zeitraum von 4 Tagen auf 2 Wochen.

5. Zellfärbung und Mikroskop Charakterisierung

  1. Wenn die Zellen Konfluenz erreichen im Inneren des Gerätes, erstens, waschen Sie das Gerät mit 1x PBS gründlich zu entfernen das Medium. Dann laden Sie das Gerät mit roter Farbstoff mit Verdünnungsmittel (4 ul-1 ml) verdünnt. Legen Sie den Farbstoff ähnlich der Zelle Ladevorgang. Inkubieren der Vorrichtung in der Dunkelheit für 5 min bei Raumtemperatur und anschließend Waschen der Vorrichtung mit Kulturmedium, um die Färbung zu beenden. Lange Inkubationszeit des Farbstoffes kann zelluläre Toxizität und disadhesion.
  2. Legen Sie das Gerät mit blauer Farbstoff mit 1x PBS (2 Tropfen pro ml) verdünnt. Im Dunkeln für 5 min bei Raumtemperatur und anschließend gründlich mit 1x PBS Gerät.
  3. Untersuchen Sie die Zellfärbung unter einem inversen Lichtmikroskop. Wenn die Färbung war gut, laden die Mikrokanäle mit Befestigung Medium (3,5% Paraformaldehyd mit 1x PBS verdünnt), dann tauchendas Gerät bei der Festsetzung der mittleren und vollständig bedecken Sie es mit Alufolie. Lagern Sie das Gerät im Kühlschrank bei einer Temperatur von 4 ° C, um das Gerät vor dem Austrocknen und Ausbleichen zu verhindern. Die feste Vorrichtung ist nun bereit für die konfokale Abbildung, die von einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt werden kann.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Unser Ansatz für die Multi-Tiefe Mikrokanalstruktur Netzwerk herzustellen ahmt die komplexen 3D-Geometrien in vivo Mikrogefäßen, in denen die Mikrokanäle haben abgerundete Querschnitte 15. Darüber hinaus sind die Durchmesser der übergeordneten Verzweigung Kanäle und die Kanäle Tochter etwa gehorchen Murray Gesetz zur Aufrechterhaltung der Fluidströmung an einen erforderlichen Pegel, so dass der gesamte Kanal ist niedrig und Strömungsgeschwindigkeiten gleichmäßiger im gesamten Netzwerk 16-18. Die Verfahren und Ergebnisse für die Herstellung eines halbkreisförmigen Photoresist Urform und einem kreisförmigen Querschnitt PDMS Mikrokanal Netzwerk wurden in Film 1, 2 und Film 2 sind gezeigt. Die geometrischen Eigenschaften des PDMS Mikrokanal Netzwerk charakterisiert und in 2 gezeigt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Fotolack Reflow-Technik kann Multi-Kanal Tiefe Verzweigung Netzwerke zu schaffen ina bequemer Ansatz Fotolack Reflow-Techniken und ermöglichen die Gestaltung der mikrovaskulären biomimetischen Systemen, die etwa gehorchen Murray Gesetz.

In vielen in-vitro-Modellen, sind vaskuläre Zellen, die normalerweise auf ebenen Platten, Filter oder diesen Substraten mit Hydrogelen beschichtet kultiviert. Unter diesen Bedingungen sind die Mikrogefäßen werden nach dem Zufallsprinzip durch zelluläre Selbstorganisation erzeugt. Darüber hinaus weisen herkömmliche Assays inhärenten Schwierigkeiten beim Erzielen einer konstanten Strömung über Endothelzellen. Das Fehlen einer langfristigen und kontinuierlichen Medienstrom verhindert die Möglichkeit, die Stabilität der endothelialen Zellschicht mit geeigneten Barriere Funktionen aufrechtzuerhalten. In unserem Modell ist der Nutzen der Anwendung von Mikrofluidik die Bequemlichkeit für Fluid Zugriff und Kontrolle (unterschiedliche Fließgeschwindigkeiten, Dauer und Muster) sowie das Loswerden von Abfällen. Wir zeigen die Prozesse für die primären humanen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) Aussaat in den Mikrokanälen und eingestellt ting eine langfristige Flüssigkeit Perfusion für Zellkultur (Abbildung 3). Darüber hinaus aufgrund der komplexen Geometrien in vivo Mikrovaskulatur, ist die Echtzeit-Überwachung von dieser kleinen Schiffe schwierig. Das entwickelte PDMS basierten Chip bietet guten optischen Eigenschaften und ermöglicht die qualitativ hochwertige und Echtzeit-Bildgebung der endothelialisierten Mikrokanäle. (Abb. 4 und Movie 3)

Film 1. Schematische Fertigung Verfahren für Fotolack Urformen. Zunächst wurde ein vorgereinigt Silizium-Substrat hergestellt. Die positive Reflow Photoresistschicht wurde durch Schleuderbeschichtung auf dem Siliziumsubstrat und gebacken wurde und getrocknet. Der Photoresist wurde mit UV-Licht durch eine gemusterte Maske belichtet und dann die strukturierten Mikrokanälen entwickelt. Eine halbkreisförmige Querschnittsform Mikrokanal Netzwerk wurde nach dem Reflow bei 120 ° C für 4 min erstellt.movie1.wmv "target =" _blank "> Klicken Sie hier, um Film anzusehen.

Abbildung 1
Abbildung 1. SEM zeigt das entwickelte Photoresist a) vor dem Reflow;. B) nach dem Reflow-, c) geformt PDMS zeigt den Querschnitt des vor Aufschmelzen widerstehen, das Bild zeigt einen rechteckigen Querschnitt aufweist, d) geformt PDMS, die einen halbkreisförmigen Querschnitt der Resist nach dem Aufschmelzen; Der Querschnitt nach dem Aufschmelzen durch die erste Dimension Gestaltung des Musters und Reflow-Temperatur gesteuert. (Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 15). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Movie 2. Die schematische Abläufe bei der Herstellung für zylindrische Mikrokanalstruktur Netzwerk in PDMS. Ein PDMS-Lösung wurde auf den Photolack Form gegossen und in einem Ofen bei einer Temperatur von 60 ° C für 3 Stunden. Zwei identische geheilt PDMS Schichten, von denen jede einen halbkreisförmigen Querschnitt Mikrokanalstruktur Netzwerk hat, wurden ausgerichtet und miteinander zu Mikrokanäle mit kreisförmigen Querschnitten zu bilden. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .

Abbildung 2
Abbildung 2. a) Ein ausgerichtet und verklebt zylindrischen Mikrokanalstruktur Netzwerk in PDMS. bd) Rund Querschnitte PDMS Formen zeigen Kanalabmessungen an jeder Verzweigung Ebene (1-1 ', 2-2' und 3-3 '). Darüber hinaus zeigen diese Figuren die Schaffung eines multibranching und multidepth kreisförmigen Querschnitt mikrofluidischen Kanal Netzwerk.

page = "always"> Abbildung 3
Abbildung 3. Schematische Darstellung der langfristigen Perfusion durch den Chip unter Verwendung eines ferngesteuerten Spritzenpumpe.

Fig. 4
Abbildung 4. Mikroskopische Aufnahmen mit fluoreszierenden Farbstoff Zellmembran (rot) und Zellkern-Farbstoff (blau) zeigen, dass die HUVECs Linie die innere Oberfläche eines zylindrischen Mikrokanalstruktur Netzwerk an verschiedenen Verzweigungen Regionen. A) Top, b) Mitte, und c) unten. D) Konfokale Mikroskopie Bild zeigt den kreisförmigen Querschnitt der HUVECs entlang der Kanal Netz. Maßstab Bars: 100 um.

Movie 3. Confocal Film zeigt die Zelle Futter entlang der kreisförmigen Kanal Netzwerk.iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv ​​"target =" _blank "> Klicken Sie hier, um Film anzusehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1. Meister Formenbau

Einer der Gestaltung und Leitprinzipien für vaskuläre Morphometrie als Murray Gesetz 16, was bedeutet, dass die Verteilung der Gefäßdurchmesser im gesamten Netzwerk von Mindestanforderungen an die Gesamtenergieeffizienz Gegenleistung regierten Staaten bekannt. Weiter heißt es, dass der Würfel der Durchmesser eines Elternteils Gefäß an einer Verzweigung der Summe der Potenzen der Durchmesser der Tochter Schiffe gleich ( Gleichung 1 ) 19 Darüber hinaus hat Poiseuille-Gesetz verwendet worden, um die Größe der Schubspannung in den meisten der Gefäße Schätzung Gleichung 2 . wobei1eq3.jpg "src =" / files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "width =" 25px "/> wird der hämodynamischen Schubspannung ist μ die Viskosität des Blutes, Q die Durchflussmenge und R ist der Radius der Behälter 20,21. Für symmetrische Verzweigungen, eine wichtige Konsequenz auf Murray Gesetz und dem Gesetz von Poiseuille ist, dass die Wandschubspannung konstant das Gefäßsystem verbleibt. Somit ist für einen symmetrischen hergestellt mikrofluidischen Kanal Netz mit kreisförmigen Querschnitten, ob der Kanal Abmessungen bei Gabelungen befolgen Murray Gesetz sollte die Schubspannung von den Endothelzellen erlebt sein an verschiedenen Verzweigungen Kanäle konstant.

Viele Mikrofabrikation Techniken und Verfahren zur Herstellung von Mikrokanälen für vaskuläre Zellen 22-25 verwendet wurden angewendet, jedoch führte die resultierenden Mikrokanäle in rechteckige, quadratische oder trapezförmige Querschnitte der Kanäle. Die rechteckigen Querschnitte der Kanäle conkonstruiert mit scharfen Ecken und abrupte Übergänge an Gabelungen, die wie die sehr unterschiedlichen Flüssigkeit Scherkräfte und unphysiologische Geometrien auf Zellen in anderen Kanal Positionen, was zu Variationen in der Zellphysiologie 26,27.

Photoresist-Reflow-Prozess, was zu einer abgerundeten Kanalprofil, sind zwei Verfahren 1) das Schmelzen des gemusterten Photoresists und der flüssige Resist Oberflächen in einer Form, die die Energie des Systems 28,29 und 2 minimiert gezogen) eine Kühl-und Erstarrungsphase folgt den Schmelzvorgang. Die Formen der Reflow-Kanäle werden auch durch eine halbzylindrische Oberfläche angenähert. Gefolgt von Reflow Master Formenbau wurde ein Standard Softlithographie Ansatz verwendet, um die PDMS mikrofluidischen Kanal Netzwerk mit einem kreisförmigen Querschnitt herzustellen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Fotolack Reflow-Technik kann Multi-Tiefe Verzweigung Mikrokanalstruktur Netzwerke in einer straigh erstellent vorwärts Ansatz und ermöglicht es uns, microvascular biomimetischen Systemen, die etwa gehorchen Murrays Gesetz und imitieren die Geometrie der in vivo Mikrovaskulatur, so dass der gesamte Kanal Widerstand gering ist, und die Schubspannung Variationen an verschiedenen Verzweigungsebenen entwerfen können in den hergestellten minimiert werden Mikrofluidkanal Netzwerk.

Die physiologischen Blut Mikrogefäßen Annahme eines etwa kreisförmigen Querschnitt mit Radien zwischen 30 30-300 um. Die Maße für den Beweis Mikrokanalstruktur Netzwerk in diesem Papier wurden rund 60 um bis 100 um auf verschiedenen Ebenen Verzweigung variiert. Um Mikrokanäle mit unterschiedlichen Durchmesserbereich zur Nachahmung in vivo Mikrogefäßen herzustellen, empfehlen wir Ihnen einzelne Schicht gesponnene Reflow verwenden widerstehen (begrenzt auf 30 um) oder andere niedere Viskosität widersteht. Für einen Mikrokanal mit einem größeren Durchmesser (30-60 um), kann ein Doppel-Beschichtungsverfahren aufgebracht, um eine dickere Photoresistfilm zu erhalten15. Zusätzliche Spin-Beschichtungen über zwei Schichten vermieden werden, um ungleichmäßige Filmdicke, die zu einer ungenauen Belichtungsdosis führen kann verhindert werden. Für eine Schichtdicke von über 60 um, werden andere höher viskosen Reflow Photoresisten empfohlen.

In einem idealen Zustand, herzustellen einer Form mit einem halbkreisförmigen Querschnitt widerstehen, kann die Filmdicke zunächst, indem sie eine gewünschte Breite und Brennweite des Mikrokanals so vorbestimmt werden Gleichung 4 , Wobei H die erforderliche spun-Schichtdicke, r Hälfte der Kanalbreite ist, R die konstanten Krümmungsradius ist, h die Höhe des mittleren Krümmung, und E ist das Verhältnis der Volumina Widerstand der Mikrokanalplatte vor und nach Aufschmelzen 31. Bei einer zylindrischen Oberfläche eines gegebenen Breite Mikrokanal ein bestimmtes Volumen des Resist wiedererforderlich. Allerdings haben einige Parameter gemeldet die aufgeschmolzenen Fotolack überlagern und die resultierenden Kanalprofile komplexer, wie Grenzwinkel und Grenze zwischen dem Photoresist und dem festen Substrat, Materialverdampfungsquellen beim Reflow Backen, Temperatur und den Zeitpunkt des Reflow-Prozesses, Ausgasung, Substrat Einheitlichkeit und Resisteigenschaften 32-34. Zum Beispiel kann die Reflow-Temperatur und zeitliche Abfolge in einer Volumenänderung bewirkt die Grenze Bewegung führen und damit Variation des kritischen Winkels und letzte aufgeschmolzen Lackprofils 33. Wie unsere bisherigen Arbeiten 15 berichtet, sank die Reflow-Prozess die Kanalweiten von durchschnittlich 2% wegen Photolackvolumen Kürzungen und Grenze Bewegung. Darüber hinaus muss die Lautstärke für das Erhalten einer zylindrischen Oberfläche auf Berücksichtigung der Wirkung des Materials machen Verdunstung während des Reflow-Prozesses 35,36. Wenn zylindrischen Oberflächen mit unterschiedlichen Radien werden durch erforderlicheinen Mikrokanal Netzwerk ist es notwendig, die Breite der Mikrokanäle variieren, was Variationen in den Mengen in unterschiedlichen Bereichen in dem Netzwerk 15. Um erfolgreich zu fabrizieren einen zylindrischen Kanal Netzwerk mit unterschiedlichen Durchmessern, die widersteht Breiten / Volumen-, Reflow-Temperaturen und Timing, kritische Winkel, Grenze Bewegung widerstehen Viskositäten und Spin-Coating-Protokolle und Substrat Eigenschaften betrachtet und getestet werden müssen.

2. Langfristige Zellkultur

Die Bedeutung der Strömung und der damit verbundenen Wandschubspannung wurde auch bei der Regulierung der endothelialen Biologie anerkannt. Dies hat in Bereichen wie induzieren Veränderungen in der Zelle Form und Orientierung, Sekretion und Organisation, Proliferation und Differenzierung, intrazelluläre Signalwege, Zytoskelett-Protein-Produktion und der Genexpression, Gefäßreifung und Struktur und Barriere-Funktionen 37-47 gesehen worden. Der Strom in vitro Verfahren zur Bildung Endeothelial Rohre im Allgemeinen auf endothelialen Zellen (ECs) Selbstorganisation mit oder ohne Mesenchymzellen in der extrazellulären Matrix (ECM) (Typ-I-Kollagen, Fibrin oder Matrigel) 48-54. Obwohl diese Kulturen haben erfolgreich mehrere microvascular Verhaltensweisen, die künstlichen Gefäße durch einen zufälligen Prozess der Morphogenese fehlt die gewünschte räumliche Orientierung gebildet Reproduzierbarkeit und modelliert. Darüber hinaus bleibt der Einfluss der Strömung auf mikrovaskuläre Stabilität weitgehend unbekannt, weil diese self-assembled Schiffe, die nicht leicht zu kombinieren weiß luminalen Strömung mit einer 3D röhrenförmigen Organisation 55, was eine Herausforderung für Engineering Blutgefäße zur Barriere-Funktionen und langfristigen vaskulären Stabilität aufweisen.

Mikrofluidische Systeme haben sich als praktisch und nützlich für die Einführung fließt zu einer Vielzahl von biochemischen und biologischen Analyse 56,57. Unser Ansatz bietet eine bequeme Möglichkeit, um Strömung in den kultivierten Zellen einzuführen. Wir verwendeten einadvanced ferngesteuerte Spritzenpumpe zu einer günstigen und gleichwohl stetigen und genaue Ablaufsteuerung durch die Mikrokanäle für langfristige Zellkultur (von 4 Tage und 2 Wochen) zu erreichen.

3. Zellkultur in dem Chip

Plasma-unterstützte Oxidation der PDMS Mikrokanäle führt Silanolgruppen (SiOH) auf den Oberflächen, die die Oberfläche hydrophil und hilft bei der weiteren Protein Beschichtungen macht. Verschiedene ECM Proteine ​​(Fibronectin, Gelatine und Kollagen) für Zellanhaftung getestet, und das beste Ergebnis wurde festgestellt, dass Fibronectin Beschichtung sein. Die HUVECs wurden in einer Konzentration von 3 x 10 6 Zellen / ml in Kulturmedium, das mit 8% Dextran (70 kDa) für die Aussaat ergänzt hergestellt. Dextran erhöht die Viskosität des Mediums, um feine Kontrolle über Aussaat Dichte von ECs aktivieren.

A Monolayer wurde zwischen 2-4 Tagen der HUVECs auf einen konstanten Medienstrom ausgesetzt entwickelt. Um die Zellen nach dem visualisierenZellkultur, wir Zellen mit Membranfärbung und Kerne Färbung Farbstoffen markiert, zeigten diese Farbstoffe niedriger Zytotoxizität 58. Wir gefärbt die Zellen als eine anhaftende Monoschicht in dem Chip kultiviert. Eine vollständige 1x PBS waschen ist notwendig, um zusätzliche Farbstoffe innerhalb des Chips gefangen zu verhindern.

Zusammenfassend durch die Kombination der Reflow Photolacktechnik und PDMS-Replikation wurde die entwickelten unterschiedlich tiefen Mikrokanal Netzwerk durch eine kreisförmige Oberfläche angenähert und die Kanaldurchmesser an jeder Gabelung etwa gehorchen Murray Gesetz. Die Schubspannung Variationen an verschiedenen Verzweigungen Ebenen können in der hergestellten mikrofluidischen Kanal Netzwerk minimiert werden. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse aus Zellkultur den gesunden Zustand der Endothelzellen. Somit werden die entwickelten endothelialisierten Mikrokanälen-on-a-Chip eine schnelle und reproduzierbare Ansatz kreisförmigen Querschnitt mit mehreren Verzweigungen und multidepth Mikrokanal Netzwerke, die die nachahmtGeometrie in vivo Mikrogefäßen. Die Prozedur veranschaulicht die Verwendung der einzigartigen Fähigkeiten in fortgeschrittenen Mikrotechnik und mikrofluidischen Technologien, um eine Mikrovaskulatur Modell mit einer langfristigen, kontinuierlichen Perfusion Steuerung sowie hochwertige und Echtzeit-Imaging-Fähigkeit zu erstellen. Mit der zunehmenden Nutzen von mikrofluidischen Kanälen für Zellbiologie, Tissue Engineering, Bioengineering und Anwendungen, die endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip ist ein Potential Assay für mikrovaskuläre Forschung.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde teilweise durch National Science Foundation (NSF 1227359), WVU EPSCoR Programm von der National Science Foundation (EPS-1003907), WVU ADVANCE Büro von der National Science Foundation (1007978) gefördert und WVU PSCoR finanziert bzw. unterstützt. Die Arbeit wurde in microfabrication WVU Forschungseinrichtungen gemeinsam nutzen (Reinraum-Einrichtungen) und Mikrofluidik Integrative Zellforschung on Chip Laboratory (Mikrochip Lab) an der West Virginia University getan. Die konfokale Bildgebung wurde bei WVU Microscope Imaging Facility getan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Reflow Photoresist AZ Electronic Materials AZP4620
Developer AZ Electronic Materials AZ 400K
PDMS Dow Corning Corporation Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium Invitrogen 10372-019
NacBlue Nuclei Staining Invitrogen H1399
PKH Red Stain Sigma MINI26 and PKH26GL
Fibronectin Gibco PHE0023
L-Glutamine Sigma G7513
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14040-133
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Trypsin/EDTA Invitrogen 25300-062
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002
PDMS Curing Agent Dow Corning Corporation Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
Fetal Bovine Serum Lonza 14-501F
Diluent C Sigma CGLDIL
Hoechst33342 Invitrogen, Molecular Probes R37605
Dextran Sigma 95771
3.5% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15710-S
Equipment
Spinner Laurell Technologies Corporation WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator BelArt Products 999320237
Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
Syringe Pump System Harvard Apparatus PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood Thermo Scientific 1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer Thinky ARE-310
Isotemp Oven Fisher Scientific 13-246-516GAQ
Optical Microscope Zeiss Invertoskop 40C
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Hotplate Barnstead/Thermolyne Cimarec SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adair, T. H. Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. , 1st edition, Biota Publishing. (2011).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
  3. Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex, UK. 65-87 (2006).
  4. Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
  5. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
  6. Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
  7. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
  8. Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
  9. Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. , Springer. (2008).
  10. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
  11. Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
  12. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  13. Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
  14. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  15. Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14 (5), 873-883 (2012).
  16. Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9 (6), 835-841 (1926).
  17. Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
  18. Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
  19. Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray's law. J. Gen. Physiol. 78 (4), 431-453 (1981).
  20. Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46 (1), 127-137 (1984).
  21. LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
  22. Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray's law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
  23. Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  24. Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
  25. Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
  26. Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281 (3), L529-L533 (2001).
  27. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
  28. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1 (8), 759-766 (1990).
  29. Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39 (8), 2171-2176 (2000).
  30. Young, B., Heath, J. W. Wheater's functional histology: A text and colour atlas. , 4th edition, Churchill Livingstone. (2000).
  31. O'Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
  32. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Rev. Mod. Phys. 57, 827-863 (1985).
  33. Elias, H. G. An Introduction to Polymer Science. , VCH Publishers. New York. (1997).
  34. Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
  35. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
  36. Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
  37. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
  38. Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
  39. Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
  40. Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
  41. Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
  42. Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
  43. Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
  44. Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
  45. Schaper, W. Therapeutic arteriogenesis has arrived. Circulation. 104 (17), 1994-1995 (2001).
  46. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87 (2), 320-330 (2010).
  47. Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
  48. Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
  49. Darland, D. C., D'Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4 (1), 11-20 (2001).
  50. Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
  51. Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
  52. Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
  53. Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
  54. Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human "angiogenesis" assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
  55. Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
  56. Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
  57. Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
  58. Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (12), 5133-5138 (2011).

Tags

Bioengineering Bioengineering Tissue Engineering Miniaturisierung Mikrosystemtechnik Mikrofluidik Reflow Fotolack PDMS Perfusion flow Primäre Endothelzellen
Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X., Mearns, S. M.,… More

Li, X., Mearns, S. M., Martins-Green, M., Liu, Y. Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip. J. Vis. Exp. (80), e50771, doi:10.3791/50771 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter