Summary
マイクロチャネル·オン·チップ·プラットフォームは、フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせによって開発されました。内皮マイクロチャネルプラットフォームは、 インビボにおける微小血管の3次元（3D）ジオメトリを模倣する制御された連続かん流の流れの下で実行され、高品質かつリアルタイムイメージングを可能にし、微小血管の研究に適用することができる。
Abstract
インビボでの動物実験は、より時間がかかり、高価であり、観察および定量は非常に挑戦的であるための努力が微小血管の研究のためのin vitroアッセイの開発に焦点を当ててきた。 3次元（3D）ジオメトリに対してインビボ微小血管に表現し、連続的な流体の流れを提供する場合しかし、微小血管ビトロアッセイにおける従来は限界がある。フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせを使用して、我々は管理された連続灌流下で生体内微小血管および実行中の3Dジオメトリを模倣マルチ深円形の断面内皮マイクロチャネルオンチップを開発した流れ。ポジティブフォトレジストをリフロー半円形の断面マイクロチャンネルネットワークにマスターモールドを作製した。 replを2ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロチャネルの整列及び接合によるマスター型からicated、円筒マイクロネットワークが作成されました。マイクロチャネルの直径は十分に制御することができる。また、チップ内部で播種し、一次ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）は、細胞は4日〜2週間の間の時間期間の持続的な制御の下で灌流マイクロチャンネルの内面を内張りすることを示した。
Introduction
循環系の一部として微小血管は、血液や組織の間の相互作用を媒介する、代謝活動を支援し、組織微小環境を定義し、多くの健康および病理学的条件において重要な役割を果たす。 in vitroでの機能的な微小血管の要約は、複雑な血管現象の研究のためのプラットフォームを提供することができます。しかしながら、このような内皮細胞の遊走アッセイ、内皮管形成アッセイ、およびラットおよびマウス大動脈輪アッセイなどのインビトロ微小血管アッセイ、従来の三次元（3D）ジオメトリおよび連続フロー制御に対してインビボ微小血管に再現することができない1-8。このような角膜血管新生アッセイ、ニワトリ絨毛尿膜血管新生アッセイ、およびマトリゲルプラグアッセイなどの動物モデルおよびin vivoアッセイを使用して、微小血管の研究は、多くの時間がかかり、コストが高く、観察や数量化に関して挑戦、および倫理的な問題1、9-13を上げる。
持っていないでしょうな、簡単かつ厳密に制御生物学的条件と動的流体環境などの研究14、、動物とし、 生体内での関連する高い実験的なコストと複雑さを節減しながらmicromanufacturingとマイクロ流体チップ技術の進歩は、生物医学科学の洞察の様々を有効にしている従来のマクロスケールの技術で可能であっ。
ここでは、 生体内微小血管内の3Dジオメトリを模倣し、フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせを使用して管理された連続的な灌流の流れの下で実行され内皮マイクロチャネルオンチップを構築するためのアプローチを提示する。
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Protocol
1。フォトレジストマスターモールドのフォトリソグラフィ作製
次のプロトコルは30-60ミクロンの直径とマイクロチャネルを作製するためのプロセスを示しています。小径（30μm未満）とマイクロチャネルを取得するには、フォトレジストのシングルスピンコーティングが必要とされている。
- 使用前に24時間クリーンルームに4℃で冷蔵庫からリフローフォトレジストを転送し、室温まで昇温することができます。
- シリコンウェハをきれいにし、それを脱水できるように150℃で1時間のためにそれを焼く。脱水は、シリコン基板上にフォトレジストの密着性を支援する。
- スピンコート次のレシピを使用してフォトレジストの第一層：
| 手順 | 時間（秒） | 回転数（rpm） | 加速 |
| 1 | 2 </ TD> | 300 | 最高 |
| 2 | 10 | 0 | |
| 3 | 3 | 300 | 最高 |
| 4 | 60 | 600 | 最高 |
| 5 | 10 | 500 | 最高 |
| 6 | 10 | 600 | 最高 |
- その後、90秒110°Cの温度にホットプレート上でウェーハを焼く。ソフトベーク後のフォトレジストの厚さは20〜30程度になります。
- コートの第一層に使用されるのと同じレシピに続く第2のフォトレジスト層をスピン。
- ソフトベーク90秒110°Cの温度にホットプレートの上に置くことによって、再びウェハ。このソフトベーク後のフォトレジストの厚さは40〜60程度になります。
- photor露光することによって正のマスターパターンを生成フィルムマスクを介し14,500 mJの個/ cm 2の露光量でUV光にesist。
- 脱イオン（DI）水（1:2（v / v）の）で現像剤を希釈する。パターンが完全に開発されるまで、溶液中で繰り返しウエハを洗浄します。次いでDI水でウエハーを洗浄し、窒素ガスを用いて乾燥させる。
- リフロー：4分と溶媒の蒸発を防ぐために、ガラスのペトリ皿とカバーのため120°Cの温度にホットプレートの上に置き、ウェハを。ホットプレートからウェハを取り出し、それを室温まで冷却することができます。リフロー後のフォトレジストの厚さは50〜60程度になります。
2。 PDMSマイクロチャネルネットワークのソフトリソグラフィーの作製
- 10:1の重量比（ベース：硬化剤）で、ポリジメチルシロキサン（PDMS）溶液を調製し、それを徹底的に自転·公転ミキサーを使って混ぜる。
- リフローされたフォトレジストマスターモールド上にPDMSソリューションをキャスト。ドガに15分間デシケーター中でキャストPDMSを置き。必要に応じて残りの気泡を除去するために窒素ガスを使用してください。
- それを治すために可能にするために3時間60°Cの温度でオーブンでPDMSを焼く。その後、マスターモールドから硬化PDMS層を除去。
- チャネルネットワークに穴をパンチすることにより入口/出口の穴を作成するために削っパンチャーを使用します。窒素ガスを用いたPDMSの表面を清掃してください。
- 4.5×10 -2トルの動作圧力でのプラズマクリーナーおよび3.5立方フィート /分の酸素流量内側に30秒間酸素プラズマを持つ2つのPDMS層を扱う。その後、光学顕微鏡下で手動でPDMSの表面を合わせます。アライメントのよりよい制御のために必要に応じて水を一滴も使用します。
- 永久的な結合を実現するために30分間60℃のオーブンでデバイスを焼く。
3。チップでHUVEC文化と種まき
- 培養はL-グルタミンを有する培養培地でHUVECを、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した。目のために2〜5の電子実験通路を使用した。
- HUVECをが合流したら、37℃で2-6分間細胞をカウントし、最初のHEPESは（HEPES-BSS）緩衝生理食塩水で細胞を洗浄することによって、それらを収穫した後、トリプシン/ EDTAとインキュベートで細胞を扱うトリプシン処理が完了した後、トリプシン溶液で中和トリプシン/ EDTAを中和する。遠心分離し、それらを収集するために8％のデキストランを培養培地で細胞を懸濁する。デキストランは、良好な細胞播種や添付ファイルを助けるために媒体の粘度を増加させるために使用した。
- 5 4.5×10 -2トルの動作圧力とminと3.5の酸素流量フィート3 /分酸素プラズマでデバイスを扱う。その後、DI水でデバイスをロードし、殺菌のために層流バイオセーフティーフード内で8時間紫外線を扱う。
- 細胞は準備ができて一日前に、1×リン酸塩を使用してデバイスを洗うフィブロネクチン（は100μg/ mlの、希でコート後、（1×PBS）緩衝生理食塩水1×PBSで貢献しました）、4℃で一晩冷蔵庫でインキュベート。
- フィブロネクチンコーティングした後、培養液でロードし1×PBSでデバイスを洗う。 15分間37℃の温度でデバイスをインキュベートする。
- 3-4×10 6細胞/ mlの細胞濃度を8％デキストラン培地でHUVEC細胞をロードする。デバイスの一つの入口で細胞20μlの液滴を置き、マイクロ流体チャネルに細胞を導入することを傾ける。 15-20分後、細胞は、チャネルの側壁に付着するために開始されます。デバイスの細胞のより均一な分布を作成するために15分毎に回転させます。必要に応じて、追加のローディングを行うことができる。
4。長期灌流セットアップ
静置培養の5-6時間後、添付されたHUVECを、完全に広げ始めます。 10μlの/時の定常流とリモコンシリンジポンプシステムを用いた灌流を設定します。灌流をfを調整することができる以上の流量、及び2週間〜4日の間の期間続くことができます。
5。細胞染色と顕微鏡の特性
- 細胞はデバイス内部合流に到達すると、まず、徹底的にメディアを削除するには、1×PBSでデバイスを洗う。その後、希釈剤（4μL-1 ml）で希釈した赤色染料を使用してデバイスをロードします。セルローディング手順と同様の染料をロードします。室温で5分間、暗所で装置をインキュベートした後、染色を停止する培養液で装置を洗浄する。染料の長いインキュベーションは、細胞毒性とdisadhesionを引き起こす可能性があります。
- 1×PBS（1mL当たり2滴）で希釈し、青色色素をデバイスにロードします。室温で5分間、暗所でインキュベートし、その後完全に1×PBSで装置を洗浄する。
- 倒立光学顕微鏡下で細胞染色を調べます。染色が良好であった場合は、（1×PBSで希釈した3.5％パラホルムアルデヒド）固定培地でマイクロチャネルをロード、その後水没培地と完全にアルミホイルでそれをカバーを固定でデバイス。 4℃の温度で冷蔵庫でデバイスを保管℃で乾燥し、退色からデバイスを防ぐことができます。固定デバイスは共焦点レーザ走査型顕微鏡によって行うことができる共焦点イメージングのための準備ができている。
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Representative Results
マルチデプスマイクロチャネルネットワークを製造する当社のアプローチは、マイクロチャネルは、クロスセクション15を丸めていた、 生体内微小血管内の複雑な3D形状を模倣しています。さらに、チャネルと娘チャネルを分岐親の直径はおよそ全体のチャネル抵抗が低く、流動速度がネットワーク16-18全体より均一であるように要求されるレベルで流体の流れを維持するためにマレーの法則に従う。半円フォトレジストマスターモールドと円形の断面PDMSマイクロチャネルネットワークを製造するためのプロセス及び結果を、それぞれムービー1、図2、およびムービー2で実証された。 PDMSマイクロチャンネル網の幾何学的特徴は、特徴および図2に示した。我々の結果は、フォトレジストのリフロー技術はマルチデプス分岐チャネル·ネットワークを作成できることを示している私NAより便利レジストリフロー技術によるアプローチ、および約マレーの法則に従う微小バイオミメティックシステムを設計することができます。
in vitroモデルの多くでは、血管細胞は、通常、平面プレート、フィルター、又はヒドロゲルで被覆されたこれらの基板上で培養される。これらの条件下で、微小血管をランダムに自己集合セルラによって生成される。また、従来のアッセイは、内皮細胞上の一定の流れを達成するための固有の困難を有する。長期的かつ連続的なメディアフローの欠如は、適切なバリア機能を有する内皮細胞単層の安定性を維持する能力を妨げる。我々のモデルでは、適用するマイクロフルイディクスの利点は、流体のアクセスとコントロール（流量、期間やパターンを変える）だけでなく、廃棄物を取り除くために便利です。我々はマイクロチャンネルとセットで初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECを）播種するためのプロセスを実証ティン細胞培養の長期流体灌流システム（ 図3）。さらに、ため、インビボ微小血管内の複雑な形状のため、それらの小血管をリアルタイムで監視することは困難である。開発したPDMSベースのチップは、良好な光学特性を提供し、内皮マイクロチャンネルの高品質かつリアルタイムイメージングを可能にします。 （ 図4と作品3）
ムービー1。フォトレジストのマスターモールドするための模式的な製造手順。まず、洗浄済みのシリコン基板を用意した。正リフローフォトレジスト層は、シリコン基板上にスピンコーティングし、ベークして乾燥させた。フォトレジストをパターニングされたマスクを介してUV光に露光した後、パターニングされたマイクロチャネルを開発した。半円断面のマイクロチャネルネットワークは4分間120℃でリフロー後に作成されました。movie1.wmv "ターゲット=" _blank ">のムービーを表示するには、ここをクリックしてください。
図1。 SEMは、現像されたフォトレジストを示す ）リフロー前;リフローb）の後に、c）の PDMSは、リフロー前にレジストの断面を示す成型、画像は、矩形断面を示すステップと、d）PDMSは、半円 形の断面を示す成型リフロー後のレジスト;リフロー後の断面がパターン及びリフロー温度の初期寸法設計によって制御した。 （文献15から許可を得て転載）。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
映画の2。PDMにおける円筒マイクロチャネルネットワークの概略図製作手順S。PDMS溶液を金型フォトレジスト上にキャストし、3時間60°Cの温度のオーブンで硬化させた。二つの同一硬化PDMS層、半円 断面マイクロチャネルネットワークを持っているそれぞれが、整列し、円形の断面をマイクロチャネルを形成するために一緒に結合させた。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。
図2。 A）PDMS。BDで整列と結合して円筒形マイクロチャネルネットワーク ）円形PDMS金型の断面では、各分岐レベル（1-1 '、2-2'、および3-3 '）でチャネルの寸法を示す。また、これらの数字はmultibranchingとmultidepth円形の断面流路網の作成を示す。
ページ= "常に"> 
図3。遠隔制御されたシリンジポンプを用いてチップを介して、長期灌流を示す模式図である。
図4。蛍光細胞膜色素（赤）とそのHUVECをラインが異なる分岐地域における円筒マイクロチャネルネットワークの内面 。）トップ、b）のミドル、そしてc）ボトム。d）は細胞核色素（青）のショーを使って顕微鏡画像共焦点顕微鏡画像は、チャネルネットワークを裏打ちされたHUVECの円形の断面図を示す。スケールバー：100μmである。
映画の3。円形チャネルネットワークに沿って細胞の裏地を示す共焦点映画 。iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv "ターゲット=" _blank ">のムービーを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
1。マスターモールドの製造
血管の形態計測のために設計し、指針の一つは、ネットワーク全体に血管径の分布は最小エネルギー配慮によって支配されていることを述べているマレーの法則16、として知られています。また、分岐で親血管の直径のキューブが娘血管の直径の立方体の和に等しいと述べている（ 
なお）19、ポアズイユの法則は以下のように脈管構造のほとんどでせん断応力の大きさを推定するために使用されている
。その中で1eq3.jpg "srcが=" / files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "幅=" 25ピクセル"/>、μは、血液粘度血行力学的せん断応力である、Qは流量であり、Rは半径である容器20,21。対称分岐、マレーの法則とポアズイユの法則に基づいて重要な結果については、壁面せん断応力が血管網を通して一定のままであることであるので、円形の断面を持つ製作対称マイクロ流体チャネルネットワーク用に、もしチャンネル分岐での寸法はマレーの法則に従う、内皮細胞が経験せん断応力は異なる分岐チャネルで一定でなければなりません。
多数の微細加工技術およびプロセスが血管細胞22-25に使用されるマイクロチャネルの製造に適用されてきたが、得られたマイクロチャネルは、チャネルの、長方形、正方形又は台形の断面をもたらした。チャネルの矩形断面は消費されこうして細胞生理学26,27の変化で、その結果、異なるチャネルの位置に細胞に流体せん断応力と非生理学的形状を変え広く課すことができる分岐、で鋭い角や急激な遷移とstructed。
丸みを帯びたチャネルプロファイルをもたらすフォトレジストリフロー工程では、2つの手順、パターニングされたフォトレジスト1）溶融レジスト液面がシステム28,29及び2のエネルギーを最小化する形状に引っ張られるが含まれる）冷却と凝固相は、溶融プロセスに従う。リフローチャネルの形状はよく半円筒面で近似されています。リフローされたマスターモールド製作に続いて、標準的なソフトリソグラフィ法は、円形断面を有するPDMSマイクロ流体チャネルネットワークを作製した。我々の結果は、フォトレジストのリフロー技術はもっとstraighでマルチ深分岐マイクロチャネルネットワークを作成できることを示した前方のTアプローチ、および全体的なチャネル抵抗が低くなるように、私たちは約マレーの法則に従うと、 生体内微小血管内のジオメトリを模倣する微小血管のバイオミメティックシステムを設計することができますし、別の分岐レベルでせん断応力の変化を作製で最小限に抑えることができマイクロ流体チャネルネットワーク。
生理的血 液微小血管は30-300μmの30の間に半径とほぼ円形断面を採用しています。本論文で実証マイクロチャネルネットワークの寸法が異なる分岐レベルでは60μm〜100μmで周囲に変化させた。 生体内微小血管の模倣のために直径の異なる範囲を持つマイクロチャネルを作製するために、我々は抵抗する、単一スパン層リフローを使用することをお勧め（30μmまで限定）、または他の低粘度が抵抗する。大径（30〜60ミクロン）を有するマイクロチャネルについては、二重コーティング手順は、厚いフォトレジスト膜を得るために適用することができる15。上記二つの層の追加のスピンコーティングは、不正確な露光量をもたらすことができ均一な膜厚を防止するために避けられるべきである。 60μmの上記の膜厚については、他のより高い粘性リフローフォトレジストをお勧めします。
半円断面を有するレジストモールドを作製するための理想的な条件では、膜厚が最初に必要な幅及びマイクロチャネルとしての焦点距離を与えることによって予め決定することができる
ここで、Hは、必要な紡績膜厚であり、rは、チャネル幅の半分であり、Rは、一定の曲率半径、hは曲率の中心高さ、Eは、前と後のマイクロチャネルのボリュームをレジストの比である31をリフロー。マイクロチャネルの所定幅の円筒面については、レジストの特定のボリュームが再ある必要な瞬時しかし、いくつかのパラメータは、リフロープロセスのリフロー焼成温度やタイミングの間の材料の蒸着、フォトレジストなどと固体基板の間の臨界角及び境界運動として、リフローされたフォトレジストに影響を与え、得られたチャネル·プロファイルをより複雑にすることが報告されているアウトガス、基板の均一性、およびプロパティ32-34に抵抗。例えば、リフロー温度とタイミングは、境界の動きを引き起こし、したがって、臨界角を変化させ、最終的な体積変化をもたらすことができプロファイル33をレジストリフロー。私たちの前作15で報告されているように、リフロー工程があるためレジストの体積削減と境界の動きの平均で2％チャネル幅を減少させた。また、円筒面を取得するためのボリュームは、リフロー工程35,36の間に材料の蒸発の影響を手当を行う必要がある。異なる半径を有する円筒面を介して必要な場合マイクロチャンネルネットワークは、ネットワーク15内の異なる領域において容積の変化を生じる、マイクロチャネルの幅を変化させる必要がある。正常直径の異なる円筒形チャネル·ネットワークを作製し、幅/ボリューム、リフロー温度、タイミング、臨界角、境界線の動き、粘度とスピンコーティングプロトコル、および基板特性をレジストが考慮され、テストされなければならない抵抗する。
2。長期細胞培養
フローと関連付けられた壁面せん断応力の重要性はよく内皮生物の制御に認識されている。これは、細胞の形状及び向きの変化、分泌および組織増殖および分化、細胞内シグナル伝達、細胞骨格タンパク質産生および遺伝子発現、血管成熟および構造、およびバリア機能37-47を誘発するなどの分野で見られている。端部を形成するためのインビトロ法電流othelial管は一般的に'内皮細胞に依存している（ECS）を使用または細胞外マトリックス（ECM）（I型コラーゲン、フィブリン、またはマトリゲル）48-54で間葉系細胞を含まない自己組織化。これらの培養に成功し、いくつかの微小血管の挙動をモデル化しているが、形態形成のランダムなプロセスを経て形成された人工血管は所望の空間再現性と方向性を欠いている。これらの自己組織血管が簡単にバリア機能と長期血管安定性を持っているエンジニアリングの血管への挑戦をポーズ、3D管状組織55に腔流れを組み合わせていないため、また、微小血管の安定性に及ぼす流れの影響はほとんど不明のままです。
マイクロ流体システムは、生化学及び生物学的分析56,57の様々なフローを導入するための実用的かつ有用であることが証明されている。我々のアプローチは、培養細胞上の流体の流れを紹介する便利な方法を提供します。我々は、使用長期的な細胞培養用マイクロチャネル（4日間と2週間の間）を通って便利まだ安定して正確なフロー制御を実現する高度なリモート制御シリンジポンプ。
3。チップ内の細胞培養
PDMSマイクロチャネルのプラズマアシスト酸化はさらにタンパク質コーティングで表面が親水性とエイズレンダリング表面にシラノール基（SiOHの）を紹介します。別のECMタンパク質（フィブロネクチン、ゼラチンおよびコラーゲン）細胞接着について試験し、最良の結果は、フィブロネクチンコーティングであることが判明した。 HUVECを播種するための8％のデキストラン（約70kDa）を補充した培地中で3×10 6細胞/ mlの濃度で調製した。デキストランのECの密度播種にわたって微調整を可能にするために、メディアの粘度を増加させます。
コンフルエントな単層は、一定の媒体の流れに曝されたHUVECの2-4日の間に開発された。後に、細胞を可視化する細胞培養は、我々は膜染色と核染色色素で細胞を標識した、これらの色素は、低細胞毒性58を示 した。我々は、チップ内で培養接着単層としての細胞を染色した。完全な1×PBS洗浄は、チップ内部に閉じ込められた余分な染料を防止することが必要である。
要約すると、リフローフォトレジスト技術およびPDMS複製の組み合わせによって、開発されたマルチマイクロチャネルの深さは、約ネットワークマレーの法則に従う各分岐部に円形の表面とチャネルの直径で近似した。異なる分岐レベルでせん断応力の変化を作製微小流体チャネルネットワークで最小化することができる。さらに、細胞培養物から得られた結果は、内皮細胞の健全な状態を示す。このように、開発された内皮マイクロチャネル·オン·チップは模倣している、円形の断面多分岐とmultidepthマイクロチャネルネットワークを作成するために、迅速かつ再現性のあるアプローチを提供生体内微小血管内のジオメトリ。手順は、高度なmicromanufacturingおよび長期、連続かん流制御だけでなく、高品質かつリアルタイムイメージング能力を有する微小血管モデルを作成するためのマイクロ流体技術のユニークな機能の使用を示す。細胞生物学、組織工学、および生物工学アプリケーションのためのマイクロ流体チャネルの増加ユーティリティを使用すると、内皮マイクロチャネル·オン·チップは、微小血管研究のための潜在的なアッセイである。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
本研究の一部は全米科学財団（NSF 1227359）、国立科学財団（EPS-1003907）、それぞれ国立科学財団（1007978）、およびWVU PSCoR、主催WVUのADVANCEオフィスによって資金を供給WVU EPSCoRプログラムによってサポートされていました。微細加工作業はWVU共用研究設備（クリーンルーム施設）とウェストバージニア大学のチップ研究所（マイクロチップラボ）でマイクロ流体統合セルラー研究で行われていた。共焦点イメージングはWVU顕微鏡イメージング施設で行われた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Reflow Photoresist | AZ Electronic Materials | AZP4620 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 400K | |
| PDMS | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| MCDB 131 Culture Medium | Invitrogen | 10372-019 | |
| NacBlue Nuclei Staining | Invitrogen | H1399 | |
| PKH Red Stain | Sigma | MINI26 and PKH26GL | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14040-133 | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| PDMS Curing Agent | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
| Diluent C | Sigma | CGLDIL | |
| Hoechst33342 | Invitrogen, Molecular Probes | R37605 | |
| Dextran | Sigma | 95771 | |
| 3.5% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15710-S | |
| Equipment | |||
| Spinner | Laurell Technologies Corporation | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Desiccator | BelArt Products | 999320237 | |
| Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Syringe Pump System | Harvard Apparatus | PHD Ultra | |
| Laminar Biosafety Hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Planetary Centrifugal Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Isotemp Oven | Fisher Scientific | 13-246-516GAQ | |
| Optical Microscope | Zeiss | Invertoskop 40C | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Hotplate | Barnstead/Thermolyne Cimarec | SP131635 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 |
References
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