Summary
En biokjemisk tilnærming er beskrevet å identifisere in vivo protein-protein interaksjoner (PPI) av membran proteiner. Metoden kombinerer proteintverrbinding, affinitetsrensing og massespektrometri, og kan tilpasses til nesten en hvilken som helst celletype eller organisme. Med denne fremgangsmåten, blir til og identifisering av transiente PPIer mulig.
Abstract
Membranproteiner er essensielle for cellelevedyktighet og er derfor viktige terapeutiske mål 1-3. Siden de fungerer i komplekser 4, metoder for å identifisere og karakterisere deres interaksjoner er nødvendig fem. For å oppnå dette, har vi utviklet Membrane Strep-protein interaksjon eksperiment, kalt Membran-SPINE seks. Denne teknikken kombinerer in vivo tverrbinding ved bruk av den reversible tverrbinder formaldehyd med affinitetsrensing av Strep-kodet membranprotein agn. I løpet av fremgangsmåten, fornettede proteiner byttedyr er ko-renset med membranen agn protein og deretter separert ved koking. Derfor kan to store oppgaver utføres når analysere protein-protein interaksjoner (PPI) av membran proteiner ved hjelp av membran-SPINE: først, en bekreftelse av en foreslått interaksjon partner ved immuno, og andre, identifisering av nye interaksjonspartnere ved massespektrometri analyse . Dessuten, selv low affinitet, forbigående PPIs kan påvises ved denne teknikken. Endelig er Membran-SPINE tilpasses nesten alle celletype, noe som gjør det aktuelt som et kraftig screening verktøy for å identifisere PPIs av membran proteiner.
Introduction
For å forstå funksjonen til et protein er det viktig å kjenne dens interaksjonspartnere. Flere klassiske teknikker er tilgjengelige for identifisering av interaksjonspartnere av oppløselige proteiner. Imidlertid er disse teknikker ikke er lett overførbar til membran proteiner på grunn av deres hydrofobe natur 4.. For å overkomme denne begrensningen, har vi utviklet Membrane Strep-protein interaksjon eksperiment (Membran-SPINE) 6. Den er basert på ryggraden metode, som bare er egnet for løselige proteiner 7.
Membran-ryggraden fordeler fra to fordeler ved den tverrbindende middel formaldehyd: for det første kan formaldehyd lett trenge gjennom membraner, og således genererer en nøyaktig bilde av interactome av en levende celle 8.. For det andre, kan formaldehyd kryssbindinger bli reversert ved å koke ni. Her er disse to fordeler brukt til å identifisere ikke bare faste, men også forbigående PPIer av membranen proteins seks.
I korte trekk, er en streptokokk-tag smeltet til C-enden av integrert membran agn protein. Celler som uttrykker membran agn protein blir inkubert med formaldehyd som tverrbinder proteinene tære til membranen agn protein (figur 1). Modifikasjoner av byttedyr proteiner er ikke nødvendig. Det neste er at membranfraksjonen forberedt. Derfor er membranproteiner oppløseliggjøres ved såpebehandling og agn proteiner er ko-renset med byttedyr proteiner ved hjelp av affinitetsrensing. Derpå blir det kryss-kobling reverseres ved koking, og agnet og dets ko-eluerte byttedyr proteiner blir separert ved SDS-PAGE. Endelig kan byttedyr proteiner bli identifisert ved immunoblotanalyse eller massespektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Detaljert informasjon om buffere angitt i protokollen er tilgjengelig i tabell 1.
En. Fiksering av protein-protein interaksjoner ved Formaldehyd Cross-linking i levende celler
- For å begynne å forberede vekstmedier, stamløsninger og buffer P1
- Forbered 500 ml medium: Mediet bør gi forhold som støtter samspillet mellom membran agn protein og byttedyr proteiner. I tillegg bør et eksperiment utføres under betingelser hvor det ikke forventet interaksjoner (for eksempel uten at tverrbinding).
Merk: Vi sammenligner protein-protein interaksjoner i stressete og ikke-stressede bakterier. Derfor, var vi 500 ml Luria Bertani (LB) medium (Tabell 1) som vi utfylle med en stress-fremkallende middel (for eksempel 0,5 M NaCl) i en 2 liters Erlenmeyer-kolbe. For kontroll, bruker vi normal LB medium med 0,17 M NaCl (pH 7,0). - Forbered Tris-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) og 0,1 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), pH 8,0 stamløsning (tabell 1).
- Forbered buffer P1. Oppløs sukrose til en sluttkonsentrasjon på 0,5 M i Tris-buffer. Steril buffer P1 ved filtrering og lagre den ved 4 ° C.
- Forbered 500 ml medium: Mediet bør gi forhold som støtter samspillet mellom membran agn protein og byttedyr proteiner. I tillegg bør et eksperiment utføres under betingelser hvor det ikke forventet interaksjoner (for eksempel uten at tverrbinding).
- Dyrk celler som uttrykker membran agn protein med en C-terminal Strep-tag fusjon fra en vektor. Indusere ekspresjon av membran agn proteiner i et tilstrekkelig tidsrom.
NB: Der fremkalle ekspresjon av bakterielle membran agn proteiner ved tidlig logaritmisk fase (A 600 = 0,3) ved tilsetning av 250 pl 1 M isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) til 500 ml medium (sluttkonsentrasjon: 0,5 mM) . For å gi tilstrekkelig uttrykk, ruge vi bakteriene før sent-log fase (A 600 = 1,2). - Forbered for hver kultur to sentrifuger begre med et minimumsvolum på 300 ml hver, og plassere dem på is.
- Utfør formaldehyd kryssbinding.
CAURING: Formaldehyd er svært giftig Vi anbefaler å arbeide under en sikkerhetsavtrekkshette..- Overfør kultur fartøy under en sikkerhetsavtrekkshette. Dele hver prøve inn i to prøver, en utelate tverrbinding (- X) og en med den formaldehydkryssbinding (+ X). Tilsett 4 ml 37% formaldehydoppløsning i 250 ml kultur for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,6%.
- Overfør dyrkingsbeholderne tilbake og dyrke cellene i ytterligere 20 min som tidligere.
- Fyll kulturer inn i sentrifugerør i henhold til en sikkerhetsavtrekkshette. Samle-celler ved sentrifugering ved 3000 xg i 30 min.
- Kast supernatant ved forsiktig pipettering det opp under en sikkerhetsavtrekkshette. Samle giftig formaldehyd-holdig supernatant og behandler det riktig.
- For å oppnå optimal avkastning i løpet av membran protein forberedelse, forberede sfæroplaster først. Her gir vi en protokoll for Sfæroplastdannelse av Gram-negative bakterier:
- Prepare buffer P2 (Tabell 1) fra lyofilisert pulver. Forsiktig oppløse 2 mg lysozym i 0,1 M EDTA, pH 8, i et 1,5 ml rør. Alltid forberede buffer P2 ferskt for dagen av forsøket.
- Forbered Tris-buffer med protease inhibitor (buffer P3). Til 10 ml av Tris-buffer, tilsett 0,1 ml 1 M fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) (tabell 1) til en sluttkonsentrasjon på 10 mM. Bruk buffer med en gang, for å sikre riktig funksjon av PMSF som protease inhibitor.
- Resuspender celle pellets i 10 ml Tris-buffer med protease inhibitor og overføring løsning til en 15 ml konisk rør.
- Tilsett 1 ml buffer P2 og inkuber på is i 30 min.
- Samle sfæroplaster ved sentrifugering ved 3000 xg i 30 min og kast supernatant nøye.
- Inkuber spheroplast pellets over natten ved -20 ° C.
2. Rensing av streptokokk-tag Membrane Protein (Bait)
- Plasser spheroplast pellet på is. </ Li>
- I løpet av tiden speroplast pellets tine på is, forberede 10 ml buffer P3 for hver spheroplast forberedelse. Forsiktig oppløse 1 mg DNaseI i 10 ml Tris-buffer. Til 0,1 ml 1 M PMSF like før bruk.
- Resuspender pellet i 6 ml nylaget P3. Sonicate prøven fire ganger i 1 min kontinuerlig på is med 1 min pause mellom hvert utbrudd, for å forstyrre sfæroplaster.
- Sentrifuger prøven på 10 000 xg i 10 min til innhøsting celleavfall. Overfør supernatanten ved hjelp av en pipette til en ultrasentrifugerør.
- Pellet membranen fraksjon ved 100.000 x g i 30 min. Vask pelleten nøye i Tris-buffer uten oppløsning det. Tørk rør med en papirvevet (f.eks Kleenex). Unngå å forstyrre pelleten til enhver tid.
- Resuspender pelleten (= membraner) forsiktig i 1 ml Tris-buffer. Bruk en 20 pl prøve for å bestemme proteinkonsentrasjonen ved f.eks BCA-analyse. På dette trinnet, kan membranene være støt frosset i lipund nitrogen og lagret ved -80 ° C.
Tre. Rensing av streptokokk-tag Membran Bait Protein og SDS-PAGE
- Normaliser proteinkonsentrasjonen av membranfraksjonen til 5 mg / ml med Tris-buffer. Ta 2,5 ml membranfraksjonen (5 mg / ml) i et ultrasentrifugerør og tilsett 0,25 ml 20% Triton X-100 for å nå en sluttkonsentrasjon på 2%, for å oppløseliggjøre membranproteiner. Til en mikro-magnetisk stav og rør på is i 1 time.
Merk: Selv om generelt har vi gode resultater ved hjelp av Triton X-100 som vaskemiddel, kan det være nyttig å endre vaskemiddel for optimalisering. I denne forbindelse har vi beste resultater med disse vaskemidler som brukes for funksjonell rensing av den respektive membran agn protein. - Ved utføring av trinn 3.1, klar 50 ml buffer W og 5 ml buffer E fra (tabell 1). Fyll opp med 10 ml 5x buffer W konsentrat til 50 ml og tilsett 150 pl 20% Triton X-100.
- Fyll opp en ml 5x buffer E konsentrat til 10 ml og tilsett 30 pl 20% Triton X-100. Stabilisere en 1 ml Strep-Tactin superflow gravitasjon flyt kolonne med 8 ml buffer W.
Merk: Det er viktig å legge vaskemiddel anvendes for solubilisering i en konsentrasjon 10 ganger høyere enn den kritiske micellekonsentrasjon (CMC) i en hvilken som helst buffer under renseprosedyren.
- Fyll opp en ml 5x buffer E konsentrat til 10 ml og tilsett 30 pl 20% Triton X-100. Stabilisere en 1 ml Strep-Tactin superflow gravitasjon flyt kolonne med 8 ml buffer W.
- Fjern det mikro-magnetstav fra oppløseliggjøring prøven og ultrasentrifuge ved 100.000 xg i 30 min, for å pelletere den uoppløselige membranfraksjon. Fjern supernatanten ved hjelp av en pipette for ytterligere rensing.
- Laste supernatanten til kolonnen. Kjør kolonnen bare med tyngdekraften flyt. Vask kolonnen med 5 ml buffer W. Gjenta vasketrinn 5x.
- Eluer membran agn proteiner med 1 ml buffer E. Gjenta dette elueringstrinnet 4x.
- Konsentrer elueringsfraksjonene 2, 3 og 4 til 300 pl med en sentrifugal filterenhet.
- Bland 200 ul av hver prøve med 50 ul 5x SDS-PAGE lasting fargestoff. Splitte hvert preparat i 125 ul delprøver. Kok en alikvot av hvert preparat i 20 minutter ved 95 ° C, for å reversere formaldehyd-kryssbindinger. La prøvene kjøles ned til romtemperatur i minst 10 min på benken toppen.
- Belastnings 30 pl fra hver prøve til en enkelt bane av en polyakrylamid-gel passende for immunoblotting. Bruk en prestained molekylvekt markør for beste orientering og kjøre SDS-PAGE 10.
4. Immunoblotanalyse å bekrefte Interaksjons Partnere
- Når trinn 3.8 er ferdig, overfører proteiner til en nitrocellulose membran ved f.eks semidry.
- Blokker membranen for å forhindre uspesifikk merking. Forbered blokkering buffer ved veiing bovint serum albumin (BSA) for å oppnå 3% vekt pr volum i Tris-bufret saltvann supplert med endelig konsentrasjon på 0,05% Tween-20 (TBS-T). Bruk en tilstrekkelig mengde blokkeringsbuffer til å dekke membranen. Blokker membranen i 1 time ved RT.
- Fortynne ennd ruge byttet protein spesifikt første antistoff som vanlig. Bruk en HRP-bundet antistoff som det andre antistoff.
- Utvikle immunoavtrykket bruker en chemiluminescent deteksjon kit med høy følsomhet. Overvåke signalet ved hjelp av en klassisk film behandlingsprosedyre eller digital bildebehandling utstyr.
5. NanoLC-ESI-MS/MS High Resolution Forsøk å identifisere Interaksjons Partnere
- I tilfelle at ingen spesifikke antistoff, er tilgjengelig for tære protein eller ukjente interaksjonspartnere skal identifiseres, bruk massespektrometri (MS) for identifisering. For å hindre forurensning keratin, bruk precasted geler proteinseparasjon.
- Silver flekker på SDS-PAGE ved hjelp av en MS-kompatibel flekker kit i henhold til produsentens protokoll. Utføre alle flekker og vasketrinn i glasstanker.
- Avgifts respektive band og analysere disse med høy oppløsning LC / MS ni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Membran SPINE analyse gjør at co-rensing av membran proteiner og forbigående samspill protein partnere. Den ko-rensing oppnås ved hjelp av kryssbindingsmiddel formaldehyd. To parametere er kritiske for å hindre at uspesifikke kryssbindinger: formaldehydkonsentrasjon og kryssbindingen time. Det er tilstrekkelig, men ikke overdreven bruk av formaldehyd kan lett kontrolleres ved immunoblotting. Formaldehyd fornettede proteinkomplekser kan bli separert ved å koke, men ikke ved hjelp av SDS-behandling. Derfor kan de bli visualisert etter blotting av Strep-merket membran agn protein som smøre i den øvre delen av immun-blot av en unboiled prøven.
Et representativt resultat av en membran ryggraden assay, inkludert alle nødvendige kontroller, er vist i figur 2.. Som agn protein integrert membran protein CpxA av Escherichia coli ble brukt 6,11. CpxA er et sensor-kinase og består av enN-terminal sensor domene med to transmembrane domener (TMD) integrere en stor ekstra cytoplasmiske sensor domene og en C-terminal svært konservert cytoplasma katalytisk domene 12. Etter stimulering, CpxA aktiverer kognatreseptoren respons regulator CpxR. Aktivert CpxR diffunderer ut for å mekle responsen. For Membrane SPINE ble Strep-tag smeltet til C-terminalen på CpxA (CpxA-Strep). CpxA-Strep tverrbundet til andre proteiner eller proteinkomplekser er oppdaget som en sverte i unboiled formaldehyd-behandlet prøven (figur 2, linje 1 mot linje 3) indikerer tilstrekkelig kryssbinding. Dessuten er en direkte protein-protein interaksjon av CpxA-Strep med kognatreseptoren respons regulator protein CpxR som byttet protein bare påvises i nærvær av formaldehyd (fig. 2, linje 2 versus linje 4) som støtter spesifisiteten av formaldehyd tverrbinding.
Et representativt resultat av en membran ryggraden analysen er presentert in Figur 3. Prøver som svarer til dem på figur 2 ble sølvfarget. Pilen markerer et band som er spesifikk for den kokte prøve. Med hensyn til bakgrunnen, også identifisert MS-analyse andre proteiner i tillegg til CpxR 6.. Derfor bør den ikke-formaldehyd-behandlet prøve alltid bli analysert, for å tildele bakgrunnsstøy og spesifikk interaksjon partner.
Tabell 1: Buffere og reagenser som er nødvendige for membran-ryggraden.
| Buffer / Reagens / Medium | Arbeide konsentrasjon | kommentar | |
|---|---|---|---|
| LB | 10 g Trypton 5 g gjærekstrakt 10 g NaCl til en L, juster pH til 7,0 | Luria buljong medium | |
| IPTG | 1 M Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside | 0,5 mM | |
| Tris-buffer | 20 mM Tris-HCl, pH 8 | Juster pH til 8,0 ved hjelp av NaOH | |
| 0,1 M EDTA, pH 8 | 0,1 M EDTA | Juster pH til 8,0 ved hjelp av NaOH | |
| PMSF | 1 M fenylmetylsulfonylfluorid i 100% Isopropanol | 10 mM | PMSF er stabil i 100% isopropanol, men ikke i vann! Lager-løsning kan lagres ved -20 ° C; PMSF må tilpasses til romtemperatur før fortynning i buffer, inneholdende PMSF buffere bør brukes i løpet av 10 minutter for fremstillingen. |
| P1 | 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 0,5 M sukrose | ||
| P2 | 2 mg / ml lysozym i 0,1 M EDTA, pH 7.5 | ||
| P3 | 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 10 mM PMSF | Bruk umiddeldelbart etter tilberedning | |
| Vaskemiddel | 20% Triton X-100 | 2% for solubilisering | |
| Buffer W | Fyll opp 10 ml 5x konsentrere til 50 ml Tilsett 150 ul 20% Triton X-100 | 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 150 mM NaCl 1 mM EDTA 0,06% Triton X-100 | 5x konsentrat er en del av streptokokk-tag protein rensing buffer sett (IBA) |
| Buffer E | Fyll opp en ml 5x konsentrere til 10 ml legg 30 pl 20% Triton X-100 | 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 150 mM NaCl 1 mM EDTA 2,5 mM Dethiobiotin 0,06% Triton X-100 | 5x konsentrat er en del av streptokokk-tag protein rensing buffer sett (IBA) |
| 5x SDS-PAGE lasting fargestoff | 0,3125 M Tris-HCl, pH 6.8 10% SDS 0,5 M DTT 50% glycerol |
Figur 1. Flytskjema for den membran-ryggraden prosedyren ved hjelp av en Escherichia coli membranprotein som agn. Protein A) bakterier som uttrykker Strep-kodet membranprotein agn er behandlet med formaldehyd. Formaldehyd trenger gjennom membranene og kryssbindinger tære proteiner til membranen agn protein. B) Membranfraksjonen blir fremstilt og membranproteiner er solubilisert ved behandling vaskemiddel. Deretter byttedyr proteiner er ko-renset med agn protein. C) Formaldehyd kryssbindinger blir reversert ved å koke, og proteinene separeres ved SDS-PAGE. Endelig er byttedyr proteiner enten overvåket ved immunoblotting (D) eller identifisert av MS-analyse (E). Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Representative immunoblot som brukes til å overvåke en PPI for et membranprotein. Bakterier som produserer CpxA-Strep fra et plasmid som membran agn protein, ble dyrket i LB-medium til en OD 600 på 1 og utsettes for formaldehyd (CH 2 O) i 20 min. Det indre membranfraksjon ble fremstilt, membran proteiner ble oppløseliggjort ved behandling vaskemiddel og CpxA-Strep ble renset (søyle 1 og 2). Bakterier som produserer enten CpxA-Strep uten formaldehyd-behandling (banene 3 og 4) eller med seg den tomme vektoren med formaldehyd behandling (banene 5 og 5) tjente som kontroller. Porsjoner av hver prøve ble kokt ved 95 ° C i 20 min(baner 2, 4 og 6) for å separere fornettede proteiner fra CpxA-Strep. Proteiner ble separert på en 12,5% SDS-PAGE. Immunoblotting ble utført, og blot ble separert i henhold til størrelse på CpxA-Strep (51 kDa) og de respektive byttedyr proteiner CpxR (26 kDa). De to delene av immunoblot ble inkubert med polyklonale antistoffer dannet mot CpxA og CpxR, respektivt. Deretter ble blots videre behandlet med et anti-kanin, hest (HRP)-antistoff og utviklet ved bruk av SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrat. Pilspissen markerer nedbrytningsprodukter av CpxA. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Representative sølv-farget SDS-PAGE som brukes for identifikasjon av en interaction partner av et membranprotein av MS-analyse. Prøver som svarer til dem på figur 2, ble sølvfarget. Pilen markerer et band som ble analysert ved MS analyse og som bekreftet CpxR som samspillet partner av CpxA fem. Lane 7 viser renset CpxR-Hans 6 og lane 8 viser renset CpxA-Hans seks protein. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Membran SPINE analyse er en biokjemisk tilnærming som gjør det mulig å bekrefte og for å identifisere til dette punktet ukjente interaksjons partnere av membran proteiner. Membranryggraden kombinerer in vivo tverrbinding av formaldehyd med rensing av et Strep-kodet membranprotein agn. Kombinasjonen med immunoblotting muliggjør bekreftelse av predikerte interaksjonspartnere (figur 2). I tillegg er kombinasjon med MS-analyse gjør det mulig å identifisere ukjente interaksjonspartnere (figur 3). For begge programmene, er det ingen krav for å endre din byttedyr protein. Dessuten er membran SPINE tilstrekkelig følsom til å tillate påvisning av endogene byttedyr proteiner 6.
Her presenterer vi en protokoll som er optimalisert for membranproteiner av gram-negative bakterier. Konvolutten med gram-negative bakterier som skiller cytoplasma fra omgivelsene og besitter, i tillegg til dencytoplasmisk membran, en ytre membran og en murein sacculus. Derfor inkluderer vår protokoll fjerning av den ytre membran og murein sacculus, noe som resulterer i såkalte sfæroplaster. Fordi slike protokoller er tilgjengelige for de fleste celletyper, skulle våre protokollen kunne tilpasses for de fleste membranproteiner. I tillegg bør følgende punkter vurderes.
Først av alt, kopitallet av vektoren brukt for å overprodusere membranen agn protein må balanseres mellom et høyt nivå for å gi tilstrekkelig membranproteinrensing og et lavt nivå for å unngå uspesifikke interaksjoner
For det andre, for noen membranproteiner en N-terminal fusjon kan være mer optimal enn en C-terminal fusjon. I begge tilfeller bør funksjonaliteten av fusjons bekreftes av trans-komplementering.
Tredje, andre affinitetsrensing protokoller er også kompatible med påfølgende MS analyse, slik som FLAG rensing ogtandem affinitetsrensing (TAP). Vi foretrekker streptokokk-tag II på grunn av sin lille størrelse med bare 8 aminosyrer (WSHPQFEK).
For det fjerde bør konsentrasjonen av formaldehyd som brukes, og den tverrbindende tid være optimalisert for å forhindre uspesifikk tverrbinding. En tilstrekkelig, men ikke overdreven bruk av formaldehyd kan overvåkes ved immunoblotting av unboiled prøver som forholdet mellom kryssbundne og nonlinked membran agn protein (figur 2). Kryssbundne proteiner som migrerer som en smøre i den øvre del av immunoblot. Un-koblede proteiner migrere som ubehandlet protein. Forholdet mellom tverrbundet og ukoblet protein bør være ca 3:01.
For det femte er det ingen "generell vaskemiddel" for alle membranproteiner for solubilisering. Derfor, i visse tilfeller passende vaskemiddel for solubilisering av membranen agn proteinet har til å bli bestemt. Derved må det valgte vaskemiddel være kompatibel med Strep-tag column.
Endelig har det sølvfargingsprosedyre for å være kompatibel med påfølgende MS-analyse. MS kompatible sølv flekker kits er tilgjengelig fra ulike leverandører. Vi brukte forskjellige de med sammenlignbare gode resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet med tilskudd av Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 og SFB940 til SH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identification of human protein drug targets. Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M.
- Daley, D. O. The assembly of membrane proteins into complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).
- Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo. Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).
- Herzberg, C., et al. SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).
- Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies. Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system. FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).
- Weber, R. F., Silverman, P. M. The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component. J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).
