Summary
Een biochemische benadering wordt beschreven in vivo eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten identificeren. De methode combineert eiwit verknoping, affiniteitszuivering en massaspectrometrie, en is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel of organisme. Met deze benadering ook de identificatie van voorbijgaande PPI mogelijk.
Abstract
Membraaneiwitten zijn essentieel voor de levensvatbaarheid van de cellen en zijn daarom belangrijke therapeutische doelen 1-3. Omdat ze functioneren in complexen 4, methoden om hun interacties te identificeren en karakteriseren nodig 5. Daarom hebben wij de membraan Strep-eiwitinteractie experiment genoemd Membraan-SPINE 6. Deze techniek combineert in vivo verknopen met de omkeerbare cross-linker formaldehyde met affiniteit zuivering van een Strep-gelabeld membraan aas eiwit. Tijdens de procedure, verknoopte prooi eiwitten co-gezuiverd met het membraan aas eiwit en vervolgens gescheiden door koken. Daarom kunnen twee grote taken worden uitgevoerd bij de analyse van eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten gebruik Membraan-STEKEL: ten eerste, de bevestiging van een voorgenomen interactiepartner door immunoblotting, en ten tweede, de identificatie van nieuwe interactie partners door massaspectrometrie-analyse . Bovendien, zelfs low affiniteit, voorbijgaande PPI's zijn detecteerbaar door deze techniek. Tot slot, Membraan-STEKEL is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel, waardoor het van toepassing als een krachtig screening tool om PPI's van membraaneiwitten te identificeren.
Introduction
Om de functie van een proteïne te begrijpen is het essentieel om de interactiepartners kennen. Verschillende klassieke technieken beschikbaar voor de identificatie van interactiepartners van oplosbare eiwitten. Echter, deze technieken niet gemakkelijk overdraagbaar eiwitten door hun hydrofobe aard 4 membraan. Om deze beperking te overwinnen, hebben we de Membraan Strep-eiwit interactie-experiment (Membraan-STEKEL) 6 ontwikkeld. Het is gebaseerd op de SPINE methode, die alleen voor oplosbare eiwitten 7.
Membraan-SPINE profiteert van twee voordelen van het verknopingsmiddel formaldehyde: eerste, formaldehyde gemakkelijk membranen binnendringen en genereert daardoor een nauwkeurige momentopname van de interactoom van een levende cel 8. Ten tweede, kan formaldehyde dwarsverbanden worden teruggedraaid door koken 9. Hier worden deze twee voordelen gebruikt om niet alleen vaste maar ook tijdelijke PPI membraan prote identificerenins 6.
In het kort wordt een Strep-tag gefuseerd met de C-terminus van de integrale membraan eiwitten aas. Cellen die het membraan aas eiwit geïncubeerd met formaldehyde crosslinks prooi eiwitten aan het membraan aas eiwit (Figuur 1). Wijzigingen van prooi eiwitten zijn niet nodig. Vervolgens wordt de membraan fractie bereid. Daarom zijn membraaneiwitten opgelost door detergensbehandeling en aas eiwitten co-gezuiverd met prooi eiwitten met affiniteitszuivering. Vervolgens wordt het verknopen omgekeerd door koken en het aas en de co-elueerde prooi eiwitten gescheiden door SDS-PAGE. Tenslotte kan prooi eiwitten worden geïdentificeerd door immunoblot analyse of massaspectrometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Gedetailleerde informatie over buffers in het protocol is in Tabel 1.
1. Fixatie van eiwit-eiwit interacties door Formaldehyde Cross-linking in levende cellen
- Om te beginnen bereiden groeimedia, stock oplossingen en buffer P1
- Bereid 500 ml medium: Het medium moet voorwaarden die de interactie tussen membraan aas eiwit en prooi eiwitten ondersteunen. Daarnaast moet een experiment worden uitgevoerd onder omstandigheden waarbij geen interactie verwacht (bv. zonder cross-linking).
Opmerking: We vergelijken eiwit-eiwit interacties in gestresst en niet gestresst bacteriën. Daarom bereiden we 500 ml Luria Bertani (LB) medium (tabel 1) die wij vullen met een stress-inducerende middel (bijvoorbeeld 0,5 M NaCl) in een 2 L Erlenmeyer kolf. Voor controle, gebruiken we normaal LB-medium met 0,17 M NaCl (pH 7,0). - Bereid Tris-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) en 0,1 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), pH 8,0 stockoplossing (tabel 1).
- Bereid buffer P1. Los sucrose tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 M in Tris-buffer. Steriliseer buffer P1 door filtratie en bewaard bij 4 ° C.
- Bereid 500 ml medium: Het medium moet voorwaarden die de interactie tussen membraan aas eiwit en prooi eiwitten ondersteunen. Daarnaast moet een experiment worden uitgevoerd onder omstandigheden waarbij geen interactie verwacht (bv. zonder cross-linking).
- Groeien cellen die het membraan aas eiwit met een C-terminale Strep-tag fusie van een vector. Induceren de expressie van membraan lokaas eiwitten gedurende een voldoende tijd.
Opmerking: We induceren de expressie van bacteriële membraan aas eiwitgehalte bij vroege log-fase (600 A = 0,3) door toevoeging van 250 gl 1 M isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) tot 500 ml medium (eindconcentratie 0,5 mM) . Om voldoende expressie mogelijk te maken, broeden we de bacteriën tot in de late-log-fase (A 600 = 1.2). - Bereid je voor elke cultuur twee centrifuge bekers met een minimaal volume van elk 300 ml en leg ze op ijs.
- Voer formaldehyde verknoping.
CAUTIE: Formaldehyde is zeer giftig We raden werken onder een veiligheids zuurkast..- Breng de cultuur vat onder een veiligheids zuurkast. Splitsen elk monster in twee monsters, een weglating verknopen (- X) en een met inbegrip van het formaldehyde verknopen (+ X). Voeg 4 ml 37% formaldehyde-oplossing 250 ml cultuur tot een eindconcentratie van 0,6% te bereiken.
- De cultuur schepen terug te boeken en te groeien cellen voor nog eens 20 minuten als voorheen.
- Vul uw culturen in de centrifuge buizen onder een veiligheid zuurkast. Verzamel cellen door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 30 minuten.
- Gooi supernatant door voorzichtig pipetteren het omhoog onder een veiligheid zuurkast. Verzamel giftige formaldehyde bevattende supernatant en gooi het goed.
- Om een optimale opbrengst te bereiken tijdens membraaneiwit voorbereiding, bereiden eerst sferoplasten. Hier bieden we een protocol voor sferoplast vorming van Gram-negatieve bacteriën:
- Prepare buffer P2 (tabel 1) van gevriesdroogd poeder. Voorzichtig los 2 mg lysozym in 0,1 M EDTA, pH 8, in een 1,5 ml buis. Bereiden altijd buffer P2 vers voor de dag van het experiment.
- Bereid Tris-buffer met proteaseremmer (buffer P3). Aan 10 ml Tris-buffer, voeg 0,1 ml 1 M fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (tabel 1) tot een eindconcentratie van 10 mM. Gebruik de buffer onmiddellijk een goede werking van PMSF waarborgen proteaseremmer.
- Resuspendeer celpellets in 10 ml Tris-buffer met proteaseremmer en transferoplossing een 15 ml conische buis.
- Voeg 1 ml buffer P2 en incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
- Verzamel sferoplasten door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 30 minuten en gooi supernatant voorzichtig.
- Incubeer de sferoplast pellets nacht bij -20 ° C.
2. Zuivering van Strep-tag membraaneiwit (Bait)
- Plaats sferoplast pellet op ijs. </ Li>
- Gedurende de tijd dat de sferoplast pellets ontdooien op ijs, bereiden 10 ml buffer P3 voor elke sferoplast voorbereiding. Voorzichtig los 1 mg DNaseI in 10 ml Tris-buffer. Voeg 0,1 ml 1 M PMSF vlak voor gebruik.
- Resuspendeer de pellet in 6 ml vers bereid P3. Ultrasone trillingen het monster vier maal gedurende 1 min continu op ijs met 1 min. pauze tussen elke burst, om sferoplasten verstoren.
- Centrifugeer het monster bij 10.000 xg gedurende 10 min te oogsten celresten. Breng de bovenstaande behulp van een pipet om een ultracentrifuge buis.
- Pellet de membraanfractie bij 100.000 xg gedurende 30 minuten. Was de pellet voorzichtig in Tris-buffer zonder het op te lossen. Droog de buis met een papieren tissue (bijvoorbeeld Kleenex). Vermijd de pellet te verstoren op elk moment.
- Resuspendeer de pellet (= membranen) voorzichtig in 1 ml Tris-buffer. Gebruik een 20 pi aliquot de eiwitconcentratie te bepalen, bijvoorbeeld door BCA assay. Bij deze stap worden de membranen shock li bevrorenquid stikstof en bewaard bij -80 ° C.
3. Zuivering van Strep-tag Membraan Bait Eiwit en SDS-PAGE
- Normaliseren van de eiwitconcentratie van de membraanfractie met 5 mg / ml met Tris-buffer. Neem 2,5 ml membraanfractie (5 mg / ml) in een ultracentrifuge buis en voeg 0,25 ml 20% Triton X-100 tot een eindconcentratie van 2% bedragen, teneinde het membraan eiwitten oplosbaar. Voeg een micro-magnetische staaf en roeren op ijs gedurende 1 uur.
Noot: Hoewel algemeen hebben we goede resultaten met Triton X-100 als detergens, kan het handig zijn de wasmiddel voor optimalisatie veranderen. In dit opzicht hebben we de beste resultaten met die reinigingsmiddelen voor functionele zuivering van de respectievelijke membraan aas eiwit. - Tijdens het uitvoeren van stap 3.1, bereiden 50 ml buffer W en 5 ml buffer E uit (tabel 1). Vul 10 ml 5x buffer W concentraat 50 ml en voeg 150 ul 20% Triton X-100.
- Vul 1 ml 5x buffer E concentraat 10 ml en voeg 30 ul 20% Triton X-100. Equilibreer een 1 ml Strep-Tactin superflow zwaartekracht kolom stroom met 8 ml buffer W.
Opmerking: Het is essentieel om de wasmiddel voor de solubilisatie in een concentratie 10-voudig boven de kritische micel concentratie (CMC) heeft in een buffer tijdens de zuiveringsprocedure te voegen.
- Vul 1 ml 5x buffer E concentraat 10 ml en voeg 30 ul 20% Triton X-100. Equilibreer een 1 ml Strep-Tactin superflow zwaartekracht kolom stroom met 8 ml buffer W.
- Verwijder de micro-magnetische staaf van het oplosbaar monster en ultracentrifuge bij 100.000 xg gedurende 30 min, de onoplosbare membraanfractie pelleteren. Verwijder het supernatant met een pipet voor verdere zuivering.
- Plaats het supernatant op de kolom. Voer de kolom alleen met zwaartekracht. Was de kolom met 5 ml buffer inch Herhaal deze wasstap 5x.
- Elueren membraan aas eiwitten met 1 ml buffer E. Herhaal deze elutiestap 4x.
- Concentraat elutiefracties 2, 3, en 4 300 pl met een centrifugale filtereenheid.
- Meng 200 gl van elk monster met 50 ul 5x SDS-PAGE ladingskleurstof. Split elke bereiding in 125 ul porties. Kook een aliquot van elk preparaat gedurende 20 minuten bij 95 ° C, formaldehyde verknopingen keren. Laat monsters afkoelen tot kamertemperatuur gedurende ten minste 10 minuten op de bank top.
- Belasting 30 pi van elk monster een enkele rijstrook van een polyacrylamide-gel geschikt voor immunoblotting. Gebruik een voorgekleurde molecuulgewichtsmerker voor de beste oriëntatie en draaien SDS-PAGE 10.
4. Immunoblotanalyse interactiepartners bevestigen
- Zodra stap 3.8 is voltooid, overdracht eiwitten aan een nitrocellulose membraan door bijvoorbeeld halfdroge.
- Blokkeer het membraan niet-specifieke labeling voorkomen. Bereid blokkerende buffer door weging runderserumalbumine (BSA) tot 3% gewicht per volume te bereiken in Tris-gebufferde zoutoplossing aangevuld met een uiteindelijke concentratie van 0,05% Tween-20 (TBS-T). Gebruik een voldoende hoeveelheid blockingbuffer het membraan bedekken. Blokkeer het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verdun eennd incubeer de prooi eiwit specifieke eerste antilichaam zoals gewoonlijk. Gebruik een HRP-gekoppeld antilichaam als tweede antilichaam.
- Ontwikkel de immunoblot met een chemiluminescentiedetectie kit met een hoge gevoeligheid. Bekijk het signaal met behulp van een klassieke film veredeling of digitale imaging apparatuur.
5. NanoLC-ESI-MS/MS hoge resolutie Experimenten interactiepartners identificeren
- Indien er geen specifiek antilichaam beschikbaar voor de prooi eiwit of onbekende interactiepartners worden geïdentificeerd, gebruikt massaspectrometrie (MS) voor identificatie. Om keratine besmetting te voorkomen, gebruiken precasted gels voor scheiding van eiwitten.
- Zilverkleuring de SDS-PAGE met behulp van een MS-compatibele kleuring kit volgens het protocol van de fabrikant. Voer alle vlekken en wassen stappen in glas tanks.
- Accijnzen respectievelijke bands en deze analyseren door hoge resolutie LC / MS 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Membraan STEKEL analyse kan de co-zuivering van membraaneiwitten en transient interagerende proteïne partners. De co-zuivering wordt mogelijk door de verknoping middel formaldehyde. Twee parameters zijn cruciaal voor niet-specifieke cross-verbindingen te voorkomen: de formaldehyde concentratie en de verknoping tijd. Het voldoende, maar niet overmatig gebruik van formaldehyde kan eenvoudig worden gecontroleerd door immunoblotting. Formaldehyde verknoopte eiwitcomplexen kunnen worden gescheiden door koken maar niet door SDS behandeling. Daarom kunnen ze worden gevisualiseerd na blotting van de Strep-tag membraan aas eiwit zoals smeer in het bovenste gedeelte van de immuun-blot van een ongekookte monster.
Een representatief resultaat van een membraan SPINE assay, inclusief alle benodigde controles, wordt getoond in Figuur 2. Als aas eiwit integraal membraaneiwit CpxA van Escherichia coli gebruikt 6,11. CpxA is een sensor kinase en bestaat uit eenN-terminale domein sensor met twee transmembraandomeinen (TMD) integratie van een groot extracytoplasmic sensor domein en een C-terminaal cytoplasmatisch sterk geconserveerde katalytische domein 12. Na stimulatie, CpxA activeert zijn verwante respons regulator CpxR. Geactiveerde CpxR diffundeert uit om de reactie bemiddelen. Voor Membraan wervelkolom, werd de Strep-tag gefuseerd met de C-terminus van CpxA (CpxA-Strep). CpxA-Strep verknoopt met andere eiwitten of eiwitcomplexen wordt gedetecteerd als een smeer in het ongekookte formaldehyde behandelde monster (figuur 2, regel 1 versus regel 3), voldoende verknoping. Bovendien is een directe interactie eiwit-eiwit van CpxA-Strep met zijn verwante respons regulator eiwit CpxR als prooi eiwit alleen detecteerbaar in de aanwezigheid van formaldehyde (figuur 2, regel 2 versus regel 4) ondersteunen van de specificiteit van formaldehyde verknoping.
Een representatief resultaat van een Membraan STEKEL analyse wordt gepresenteerd in figuur 3. Monsters die overeenkomen met die van figuur 2 werden met zilver gekleurd. De pijl markeert een band die specifiek is voor het gekookte monster. Door de achtergrond, MS analyse identificeerde ook andere eiwitten naast CpxR 6. Daarom moet de niet-formaldehyde behandelde monster altijd geanalyseerd voor achtergrondgeluiden en specifieke interactiepartner toewijzen.
Tabel 1: Buffers en reagentia die nodig zijn voor membraan-STEKEL.
| Buffer / reagens / Medium | Werkconcentratie | commentaar | |
|---|---|---|---|
| LB | 10 g trypton 5 g gistextract 10 g NaCI tot 1 L, pH 7,0 | Luria Broth medium | |
| IPTG | 1 M isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside | 0,5 mM | |
| Tris-buffer | 20 mM Tris-HCI, pH 8 | Breng de pH op 8,0 met behulp van NaOH | |
| 0,1 M EDTA, pH 8 | 0,1 M EDTA | Breng de pH op 8,0 met behulp van NaOH | |
| PMSF | 1 M fenylmethylsulfonylfluoride 100% isopropanol | 10 mM | PMSF is stabiel in 100% isopropanol, maar niet in het water! De oplossing kan worden bewaard bij -20 ° C; PMSF moet worden aangepast aan kamertemperatuur voordat verdund in buffer; PMSF bevattende buffers moeten worden gebruikt binnen 10 minuten na de bereiding. |
| P1 | 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 0,5 M sucrose | ||
| P2 | 2 mg / ml lysozym in 0,1 M EDTA, pH 7,5 | ||
| P3 | 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 10 mM PMSF | Het gebruiken van hetdellijk na de bereiding | |
| Wasmiddel | 20% Triton X-100 | 2% voor solubilisatie | |
| Buffer W | Vul 10 ml 5x concentreren tot 50 ml voeg 150 ul 20% Triton X-100 | 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 150 mM NaCl 1 mM EDTA 0,06% Triton X-100 | 5x concentraat is onderdeel van Strep-tag eiwitreiniging buffer set (IBA) |
| Buffer E | Vul 1 ml 5x concentraat tot 10 ml voeg 30 ul 20% Triton X-100 | 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 150 mM NaCl 1 mM EDTA 2,5 mM dethiobiotine 0,06% Triton X-100 | 5x concentraat is onderdeel van Strep-tag eiwitreiniging buffer set (IBA) |
| 5x SDS-PAGE laadkleurstof | 0,3125 M Tris-HCl, pH 6,8 10% SDS 0.5 M DTT 50% glycerol |
Figuur 1. Stroomdiagram van het Membraan-STEKEL procedure met behulp van een Escherichia coli membraaneiwit als aas eiwit. A) Bacteriën uiting van de Strep-gelabeld membraan aas eiwit worden behandeld met formaldehyde. Formaldehyde dringt membranen en crosslinks prooi eiwitten aan het membraan aas eiwit. B) De membraanfractie wordt bereid en membraaneiwitten werd opgelost door detergensbehandeling. Vervolgens prooi eiwitten co-gezuiverd met aas eiwit. C) Formaldehyde verknopingen worden omgekeerd door koken en eiwitten gescheiden door SDS-PAGE. Tenslotte zijn prooi eiwitten ofwel bewaakt door immunoblotting (D) of die door MS-analysis (E). Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Representatieve immunoblot gebruikt om een PPI een membraaneiwit controleren. Bacteriën produceren CpxA-Strep uit een plasmide als lokaas membraan eiwit, werden gekweekt in LB medium tot een OD600 van 1 en blootgesteld aan formaldehyde (CH2O) gedurende 20 minuten. De binnenste membraanfractie werd bereid membraaneiwitten werden gesolubiliseerd door detergensbehandeling en CpxA-Strep werd gezuiverd (lanen 1 en 2). Bacteriën produceren ofwel CpxA-Strep zonder formaldehydebehandeling (lanen 3 en 4) of die de lege vector met formaldehydebehandeling (lanen 5 en 5) dienden als controle. Porties van elk monster werden gekookt bij 95 ° C gedurende 20 min(Lanen 2, 4 en 6) om verknoopte eiwitten te scheiden van CpxA-Strep. Eiwitten werden gescheiden in een 12.5% SDS-PAGE. Immunoblotting werd uitgevoerd en de blot werd afgescheiden volgens de grootte van CpxA-Strep (51 kDa) en de respectieve prooi eiwitten CpxR (26 kDa). De twee delen van de immunoblot werden geïncubeerd met polyklonale antilichamen opgewekt tegen CpxA en CpxR, respectievelijk. Vervolgens werden de blots verder behandeld met een anti-konijn paard (HRP) antilichaam en ontwikkeld met SuperSignal West Pico Chemiluminescent substraat. De pijlpunt markeert afbraakproducten van CpxA. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Representatieve zilver gekleurde SDS-PAGE voor de identificatie van een interaction partner van een membraan eiwit door MS analyse. monsters van die van figuur 2 werden zilver gekleurd. De pijl markeert een band die werd geanalyseerd door MS analyse en die CpxR de interactie partner van CpxA 5 bevestigd. Laan 7 shows gezuiverd CpxR-Zijn 6 en baan 8 shows gezuiverd CpxA-Zijn 6 eiwit. Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Membraan STEKEL analyse is een biochemische benadering die men in staat stelt om te bevestigen en om te identificeren om dit punt onbekende interactie partners van membraaneiwitten. Membraan STEKEL combineert in vivo verknoping door formaldehyde met zuivering van een Strep-gelabeld membraan aas eiwit. De combinatie met immunoblotting vergemakkelijkt de bevestiging van voorspelde interactiepartners (figuur 2). Bovendien, de combinatie met MS analyse maakt de identificatie van onbekende interactiepartners (figuur 3). Voor beide toepassingen, is er geen verplichting voor het wijzigen van je prooi eiwit. Bovendien Membraan wervelkolom is voldoende gevoelig voor de detectie van endogene prooi eiwitten 6 toestaan.
Hier presenteren we een protocol geoptimaliseerd voor membraaneiwitten van gram-negatieve bacteriën. De omhullende van Gram-negatieve bacteriën scheidt het cytoplasma uit de omgeving en bezit naast decytoplasmatische membraan, een buitenste membraan en een mureïne sacculus. Vandaar ons protocol omvat het verwijderen van de membraan en het mureïne sacculus, waardoor zogenaamde sferoplasten. Omdat dergelijke protocollen zijn beschikbaar voor de meeste celtypen moeten ons protocol aangepast voor twee membraaneiwitten. Daarnaast moeten de volgende punten worden beschouwd.
Allereerst, het aantal kopieën van de vector die voor de overproductie van het membraan aas eiwit moet in balans zijn tussen een hoog niveau om voldoende membraan eiwit zuivering en een laag niveau om niet-specifieke interacties te voorkomen toestaan
Ten tweede, sommige membraaneiwitten een N-terminale fusie wellicht optimaler dan een C-terminale fusie. In beide gevallen moet de functionaliteit van het fusie worden bevestigd door trans-complementatie.
Ten derde, andere affiniteitszuivering protocollen zijn ook compatibel met daaropvolgende MS analyse zoals FLAG zuivering enTandem Affinity Purification (TAP). Wij verkiezen het Strep-tag II vanwege zijn kleine omvang met slechts 8 aminozuren (WSHPQFEK).
Ten vierde moet de concentratie van gebruikte formaldehyde en verknopende tijd geoptimaliseerd om onspecifieke verknoping te voorkomen. Een voldoende maar niet overmatig gebruik van formaldehyde kan worden gevolgd door immunoblotting van ongekookt monsters als de verhouding tussen verknoopte en niet-gekoppelde membraan aas eiwit (Figuur 2). Verknoopte eiwitten migreren als uitstrijkje in het bovenste gedeelte van de immunoblot. Un-linked eiwitten migreren omdat onbehandelde eiwit. De verhouding tussen verknoopt en ongekoppelde eiwitten dient ongeveer 3:1.
Ten vijfde is er geen "algemene detergent" voor alle membraaneiwitten voor het oplosbaar. Vandaar dat in sommige gevallen de juiste wasmiddel voor solubilisatie van het membraan aas eiwit worden bepaald. Daarbij moet de gekozen detergent compatibel met de Strep-tag colum zijnn.
Ten slotte zilverkleuring procedure moet stroken met daarop MS analyse zijn. MS-compatibele zilverkleuring kits zijn verkrijgbaar bij verschillende leveranciers. We gebruikten verschillende degenen met vergelijkbare goede resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 en SFB940 naar SH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identification of human protein drug targets. Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M.
- Daley, D. O. The assembly of membrane proteins into complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).
- Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo. Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).
- Herzberg, C., et al. SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).
- Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies. Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system. FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).
- Weber, R. F., Silverman, P. M. The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component. J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).
