Summary
生化学的ア プローチは、膜タンパク質のin vivoでのタンパク質-タンパク質相互作用（PPI）を識別するために記載されている。この方法は、タンパク質架橋、アフィニティー精製および質量分析を組み合わせて、ほぼすべての細胞型または生物に適用可能である。このアプローチでは、一過性のPPIのさえ識別が可能となる。
Abstract
膜タンパク質は、細胞の生存に必須であり、したがって、重要な治療標的である1-3。これらは複合体4で機能するので、それらの相互作用を同定し、特徴付けるための方法が5必要です。この目的のために、我々は、膜- SPINE 6と呼ばれる膜のStrep-タンパク質相互作用実験を、開発した。この技術は、 インビボ Strepタグ膜ベイトタンパク質のアフィニティー精製の 可逆架橋剤ホルムアルデヒドを用いて架橋で組み合わせる。処置中に、架橋された獲物タンパク質は、膜ベイトタンパク質と共精製し、続いて沸騰させることによって分離される。イムノブロッティングによって提案された相互作用パートナーの第一、確認、および質量分析による新たな相互作用パートナーの第2の識別：膜 - SPINEを用いた膜タンパク質のタンパク質 - タンパク質相互作用薬（PPI）を分析するとき、したがって、二つの主要なタスクを実行することができる。また、あってもLOW親和性、一過性のPPIは、この技術によって検出可能である。最後に、膜 - SPINEは、膜タンパク質の同定のPPIをスクリーニングするための強力なツールとして、適用すること、ほぼすべての細胞型に適用可能である。
Introduction
タンパク質の機能を理解するためには、その相互作用パートナーを知ることが不可欠である。いくつかの古典的な手法は、可溶性タンパク質の相互作用パートナーの同定のために用意されています。しかし、これらの技術は、簡単に自分の疎水性の性質4による膜タンパク質に譲渡することはできません。この制限を克服するために、我々は、膜のStrep-タンパク質相互作用実験（膜- SPINE）6を開発した。これは、可溶性タンパク質7にのみ適した脊椎法に基づいています。
架橋剤のホルムアルデヒドの二つの利点から、膜-背骨の利点は：まず、ホルムアルデヒドは簡単に膜を透過し、そのため生細胞8のインタラクトームの正確なスナップショットを生成することができます。第二に、ホルムアルデヒド架橋が9を沸騰させることによって逆転させることができる。ここで、これらの二つの利点は、膜proteの永久的でなく、過渡のPPIだけを識別するために使用されプラグ6。
要するに、Strepタグは内在性膜ベイトタンパク質のC末端に融合される。膜ベイトタンパク質を発現する細胞は、架橋は、膜ベイトタンパク質にタンパク質を捕食ホルムアルデヒド（ 図1）とともにインキュベートする。獲物タンパク質の修正は必要ありません。次に、膜画分を調製する。したがって、膜タンパク質は、治療およびベイトタンパク質は、アフィニティー精製を使用して、その獲物タンパク質と同時精製される界面活性剤によって可溶化される。続いて、架橋を沸騰させることによって反転され、餌及びその共溶出獲物タンパク質は、SDS-PAGEによって分離されている。最後に、獲物タンパク質は、イムノブロット分析または質量分析によって同定することができる。
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Protocol
注意：プロトコルに示されたバッファに関する詳細な情報は、 表1で提供されています。
1。生細胞におけるホルムアルデヒド架橋によってタンパク質 - タンパク質相互作用の固定
- 増殖培地、ストック溶液とバッファP1の準備を開始するには
- 培地500ミリリットルを準備します。媒体が膜baitタンパク質と獲物タンパク質間の相互作用をサポートする条件を提供する必要があります。さらに、1つの実験は、（ 例えば、架橋せず）の相互作用が期待されない条件下で行われるべきである。
注意：我々は強調し、非ストレス細菌中のタンパク質 - タンパク質相互作用を比較する。そのため、私たちは、2Lの三角フラスコ中のストレス誘導剤（ 例えば 、0.5M NaCl）で補完する500ミリリットルルリアベルターニ（LB）培地（ 表1）を準備します。制御のために、我々は0.17のNaCl（pH7.0）で、通常のLB培地を使用しています。 - トリス緩衝液を調製し（20mMのTris-HClでpHを8.0）および0.1 Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、pH8.0の原液（ 表1）。
- バッファP1を準備します。トリス緩衝液中の0.5 Mの最終濃度になるようにスクロースを溶解させる。濾過によりバッファP1を滅菌し、4℃で保存し
- 培地500ミリリットルを準備します。媒体が膜baitタンパク質と獲物タンパク質間の相互作用をサポートする条件を提供する必要があります。さらに、1つの実験は、（ 例えば、架橋せず）の相互作用が期待されない条件下で行われるべきである。
- ベクターからC-末端のStrep-tag融合有する膜ベイトタンパク質を発現する細胞を成長させる。十分な時間のための膜ベイトタンパク質の発現を誘導する。
注：我々 500 mlの培地を250μlの1 Mイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加により早期対数増殖期（A 600 = 0.3）で（最終濃度：0.5mMの）を細菌膜のベイトタンパク質の発現を誘導する。十分な発現を可能にするために、我々は対数期後期（600 = 1.2）まで、細菌を培養する。 - 300ミリリットルそれぞれの最小容積と各培養用の2遠心ビーカーを用意し、氷の上に置きます。
- ホルムアルデヒド架橋を行う。
CAUTION：ホルムアルデヒドは毒性が強く私たちは、安全性のヒュームフードの下で働いてお勧めします。- 安全ヒュームフードの下で培養容器を移す。 （ - X）と架橋ホルムアルデヒド（+ X）を含む一つのサンプルは、架橋を省略一つに各サンプルを分割。 0.6％の最終濃度に達するように250mlの培養物に4ミリリットルの37％ホルムアルデヒド溶液を添加する。
- バック培養容器を転送し、以前のように、さらに20分間細胞を増殖。
- 安全ヒュームフードの下の遠心管にあなたの文化を記入してください。 30分間3000×gの遠心分離によって細胞を収集します。
- 慎重に安全ヒュームフードの下でそれをピペッティングにより上清を捨てる。有毒なホルムアルデヒド含有上清を収集し、適切に廃棄してください。
- 膜タンパク質の調製中に最適な収率を達成するために、第一のスフェロプラストを調製する。ここでは、グラム陰性細菌のスフェロプラスト形成のためのプロトコルを提供する。
- た準備凍結乾燥粉末から電子バッファP2（ 表1）。穏やかに1.5mlチューブに、0.1 M EDTA、pHを8に2mgのリゾチームを溶解する。常に実験の日のために新鮮にバッファP2を準備します。
- プロテアーゼ阻害剤（バッファP3）とトリス緩衝液を準備します。トリス緩衝液10mlに、10mMの最終濃度を0.1 mlの1 Mフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）（ 表1）を加える。プロテアーゼ阻害剤PMSFとしての適切な機能を確保するために、すぐにバッファを使用する。
- プロテアーゼ阻害し、15mlのコニカルチューブに移す溶液で10mlトリス緩衝液に再懸濁した細胞ペレット。
- 1ミリリットルの緩衝P2を追加し、30分間氷上でインキュベートする。
- 30分間3000×gの遠心分離によりスフェロプラストを収集し、慎重に上清を捨てる。
- -20℃で一晩フェロプラストペレットをインキュベート
2。 Strepタグの膜タンパク質の精製（ベイト）
- 氷上でフェロプラストペレットを配置します。</李>
- フェロプラストペレットを氷上で解凍時間の間に、それぞれのスフェロプラストを調製するための10ミリリットルバッファP3を準備します。静かに10ミリリットルトリス緩衝液中で1mgのDNアーゼIを溶かす。使用直前に0.1ミリリットルの1M PMSFを追加します。
- 6ミリリットルの新たに調製し、P3でペレットを再懸濁します。スフェロプラストを破壊するために、各バーストの間に1分間の休止と氷上で1分間、連続的に試料を4回超音波処理する。
- 収穫細胞細片を10分間、10,000×gで試料を遠心分離する。超遠心管にピペットを用いて上清を転送します。
- 30分、100,000×gで膜画分をペレット化。それを溶解することなく、トリス緩衝液中で慎重にペレットを洗浄。紙の組織（ 例えばクリネックス）でチューブを乾燥させます。いつでもペレットを乱さないようにしてください。
- 丁寧に1ミリリットルのトリス緩衝液（=膜）ペレットを再懸濁。 例えば、BCAアッセイによりタンパク質濃度を決定するために、20μlのアリコートを使用する。このステップでは、膜は、リチウムでショック凍結することができる頭の良い窒素と-80℃で保存
3。 Strepタグメンブレンbaitタンパク質とSDS-PAGEの精製
- トリスバッファーで5 mg / mlの、膜画分のタンパク質濃度を正規化する。超遠心分離管に2.5ミリリットルの膜画分（5 mg / mlの）を取り、膜タンパク質を可溶化するために、2％の最終濃度に達するように、20％トリトンX-100 0.25mlの投稿。マイクロ磁気棒を加え、氷上で1時間撹拌する。
注：一般に、我々は洗浄剤としてトリトンX-100を使用して良い結果を持っていますが、最適化のための界面活性剤を変更することが役に立つかもしれません。この点において、我々は、それぞれの膜ベイトタンパク質の機能的な精製の ために使用されるもの清浄剤で最良の結果を有している。 - ステップ3.1を実行している間、（ 表1）から50ミリリットル液Wと5ミリリットル緩衝液Eを準備します。 10ミリリットルの5×50ミリリットルにW濃縮液をバッファリングし、150μlの20％トリトンX-100を追加埋める。
- 1ミリリットル5X buffeを埋めるR E 10ミリリットルに集中し、30μlの20％トリトンX-100を追加します。 8ミリリットルバッファーWに1ミリリットルのStrep-Tactinのスーパーフロー自然落下カラムを平衡化
注：これは、精製手順の間の任意の緩衝液中の臨界ミセル濃度（CMC）以上の濃度の10倍で可溶化に使用される界面活性剤を添加することが必須である。
- 1ミリリットル5X buffeを埋めるR E 10ミリリットルに集中し、30μlの20％トリトンX-100を追加します。 8ミリリットルバッファーWに1ミリリットルのStrep-Tactinのスーパーフロー自然落下カラムを平衡化
- 不溶性膜画分をペレット化し、30分間、100,000×gで可溶化サンプルと超遠心機からマイクロ磁気棒を取り外します。さらに精製するためにピペットを用いて上清を取り除きます。
- カラムに上清をロードします。唯一の重力流でカラムを実行します。 W.この洗浄工程を5回繰り返して、5ミリリットル緩衝液でカラムを洗浄します。
- この溶出ステップ4Xを繰り返して1ミリリットルバッファーEで膜ベイトタンパク質を溶出。
- 遠心式フィルターユニットで溶出画分2,3、および4から300μLを濃縮する。
- 50μlの5倍のSDS-PAGで各サンプルを200μlを混ぜてEローディングダイ。 125μlを各準備を分割します。ホルムアルデヒド架橋を逆にする、95℃で20分間の各製剤の1アリコートを沸かす。サンプルは作業台の上に、少なくとも10分間、室温まで冷却してみましょう。
- 免疫ブロッティングに適しポリアクリルアミドゲルの単一のレーンに負荷各サンプルから30μlの。最良の方向について予め染色した分子量マーカーを使用し、SDS-PAGE 10を実行します。
4。相互作用パートナーを確認するためのイムノブロット分析
- 一旦3.8は、例えばセミドライによりニトロセルロース膜に転写タンパク質を終了するステップ。
- 非特異的な標識を防ぐための膜をブロックします。 0.05％のTween-20（TBS-T）の最終濃度を補充したトリス緩衝食塩水で体積当たり3％の重量を達成するために、ウシ血清アルブミン（BSA）を秤量して、ブロッキング緩衝液調製する。メンブレンをカバーするために、ブロッキング緩衝液の十分なボリュームを使用。室温で1時間、膜をブロックします。
- 希薄NDいつものように獲物タンパク質特異的一次抗体をインキュベートする。二次抗体としてHRP結合抗体を使用してください。
- 高感度化学発光検出キットを用いたイムノブロットを開発。古典映画の処理手順やデジタルイメージング機器を用いて信号を監視します。
5。相互作用パートナーを識別するためにNanoLC-ESI-MS/MS高解像度実験
- 識別されるべきである特定の抗体が獲物タンパク質または未知の相互作用パートナーのために提供されていない場合には、識別のために質量分析（MS）を使用します。ケラチン汚染を防止するために、使用は、タンパク質分離のためにゲルをプレキャスト。
- 銀は、製造業者のプロトコルに従ってMS適合性染色キットを用いてSDS-PAGEを染色する。ガラスタンク内のすべての染色および洗浄の手順を実行します。
- 消費税各バンドと高分解能LC / MS 9でこれらを分析します。
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Representative Results
膜SPINE分析は、膜タンパク質の同時精製および一過性の相互作用タンパク質パートナーを可能にする。共精製は、架橋剤、ホルムアルデヒドを使用することによって達成される。ホルムアルデヒド濃度および架橋時間：2つのパラメータは、非特異的な架橋を防止するために重要である。ホルムアルデヒドのに十分ではなく、過度の使用を容易にイムノブロッティングによって制御することができる。ホルムアルデヒド架橋されたタンパク質複合体は、SDS処理により沸騰ではなくによって分離することができる。したがって、それらは、煮沸試料の免疫ブロットの上部のスメアとしてStrepタグ膜ベイトタンパク質をブロッティングした後に可視化することができる。
すべての必要なコントロールを含む膜SPINEアッセイの代表的結果を、 図2に示されている。ベイトタンパク質として大腸菌の内在性膜タンパク質CpxAは6,11を用いた。 CpxAはセンサーキナーゼであるとで構成されています大きな細胞質外センサードメインとC末端の高度に保存された細胞質触媒ドメイン12を統合する2つの膜貫通ドメイン（TMD）を有するN-末端センサードメイン。刺激後、CpxAはその同族のレスポンスレギュレーターCpxRを活性化させる。アクティブにCpxRは応答を媒介するためにオフに拡散する。メンブレンSPINEについては、StrepタグはCpxA（CpxA - ストレプトマイシン）のC末端に融合した。 CpxA -ストレプトマイシンは、他のタンパク質またはタンパク質複合体に架橋され、十分な架橋を示す生水ホルムアルデヒド-処理試料（ 図2、ライン3、ライン対1）でスメアとして検出される。また、獲物タンパク質としてその同族応答調節タンパク質CpxRとCpxA -ストレプトマイシンを直接タンパク質間相互作用は、ホルムアルデヒドの存在下でのみ検出可能である（ 図2、ライン4に対してライン2）ホルムアルデヒド架橋の特異性をサポートする。
メンブレン脊椎分析の代表的結果が提示され、IN 図3。図2のものに対応するサンプルは、銀染色した。矢印は、ゆでたサンプルに特異的なバンドをマーク。による背景に、MS分析はまたCpxR 6以外の他のタンパク質を同定した。したがって、非ホルムアルデヒド処理したサンプルは、常にバックグラウンドノイズとの特異的な相互作用パートナーを割り当てるために、分析されるべきである。
表1：メンブレン背骨に必要なバッファーおよび試薬。
| バッファ/試薬/ミディアム | 使用濃度 | コメント | |
|---|---|---|---|
| LB | 10グラムリプトン 5gの酵母エキス 1Lに10グラムのNaCl、 pHを7.0に調整 | ルリア·ブロス培地 | |
| IPTG | 1Mのイソプロピル-β-D-ガラクトピラノシド | 0.5 mMの | |
| トリス緩衝液 | 20mMのトリス-HCl、pH8の | NaOHを用いてpHを8.0に調整し | |
| 0,1 M EDTA、pH8の | 0.1 M EDTA | NaOHを用いてpHを8.0に調整し | |
| PMSF | 100％イソプロパノール中1 Mフェニルメチル | 10 mMの | PMSF、100％イソプロパノールではなく、水中で安定である！ストック溶液は-20℃で保存することができ、PMSF、バッファに希釈する前に室温に適応されなければならない; PMSFの緩衝液を含有する製剤は、10分以内で使用されるべきである。 |
| P1 | 20mMのトリス-HCl、pH8.0の 0.5Mのスクロース | ||
| P2 | 0.1MのEDTA、pH7.5中2 mg / mlのリゾチーム | ||
| P3 | 20mMのトリス-HCl、pH8.0の 10のPMSF | 直ちに使用ately調製後 | |
| 洗剤 | 20％トリトンX-100 | 可溶化のための2％ | |
| バッファW | 50ミリリットルを10ミリリットル5倍濃縮液を埋める 追加150μlの20％トリトンX-100 | 100mMのトリス-HCl、pH8.0の 150のNaCl 1mMのEDTA、0.06％トリトンX-100 | 5X濃縮液をStrepタグタンパク質精製バッファセット（IBA）の一部である |
| 緩衝液E | 10ミリリットルの1ミリリットル5倍濃縮物を埋める 追加30μlの20％トリトンX-100 | 100mMのトリス-HCl、pH8.0の 150のNaCl 1mMのEDTA 2.5 mMのデチオビオチン0.06％トリトンX-100 | 5X濃縮液をStrepタグタンパク質精製バッファセット（IBA）の一部である |
| 5X SDS-PAGEローディング色素 | 0.3125 Mトリス塩酸、pH 6.8 10％SDS 0.5 M DTT 50％グリセロール |
図1。 Strepタグ膜ベイトタンパク質を発現するベイトタンパク質として大腸菌の膜タンパク質を用いて、膜- SPINE手順のフローチャートA）バクテリア、ホルムアルデヒドで処理する。ホルムアルデヒドは、膜および架橋は、膜ベイトタンパク質にタンパク質を捕食貫通しているB）膜画分を調製し、膜タンパク質は、界面活性剤処理によって可溶化する。続いて、獲物タンパク質はベイトタンパク質と共精製される。C）ホルムアルデヒドクロスリンクは、煮沸することにより反転され、タンパク質をSDS-PAGEによって分離されている。最後に、獲物タンパク質は、（D）をイムノブロッティングによりモニターまたはMS-アナログによって同定される溶解（E）。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。代表的な免疫ブロットは 、細菌が膜ベイトタンパク質としてプラスミドからCpxA -ストレプトマイシンを製造する。膜タンパク質のPPIを監視するために使用される OD 1の600にLB培地中で増殖させ、20分間ホルムアルデヒド（CH 2 O）に曝露した。内膜画分は、膜タンパク質が界面活性剤処理によって可溶化し、調製し、CpxA - ストレプトマイシンを精製した（レーン1および2）。細菌は、ホルムアルデヒド処理（レーン3および4）なしでCpxA-連鎖球菌のどちらを生成するか、ホルムアルデヒド処理して、空のベクターを保持する（レーン5,5）を対照とした。各サンプルのアリコートを、20分間95℃で煮沸した（レーン2,4、および6）CpxA - ストレプトマイシンから架橋されたタンパク質を分離する。タンパク質を12.5％SDS-PAGEで分離した。 CpxA - ストレプトマイシン（51 kDa）のの大きさと、それぞれの獲物タンパク質CpxR（26 kDa）のに応じて免疫ブロッティングを実施し、ブロットを分離した。イムノブロットの2つの部分はそれぞれ、CpxAとCpxRに対するポリクローナル抗体と共にインキュベートした。次いで、ブロットを、抗ウサギウマ（HRP）抗体で処理し、スーパーシグナルウェストピコ化学発光基質を用いて発色させた。矢じりはCpxAの分解産物をマークします。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。私の同定のために使用される代表的な銀染色SDS-PAGEMS分析による膜タンパク質のnteractionパートナー。 図2のものに対応するサンプルを銀染色した。矢印は、MS分析により分析し、CpxA 5の相互作用パートナーとしてCpxRが確認されたバンドをマーク。レーン7ショーはCpxR抗His 6を精製し、レーン8は精製CpxA-彼の6タンパク質。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
膜脊椎分析は1を確認し、この時点まで膜タンパク質の未知の相互作用パートナーを識別でき、生化学的なアプローチである。メンブレン背骨がStrep-tag IIタグの膜ベイトタンパク質の精製をホルムアルデヒドによって生体内架橋を兼ね備えています。免疫ブロット法との併用は、予測された相互作用パートナー（ 図2）の確認を容易にする。さらに、MS解析との組み合わせは、未知の相互作用パートナー（ 図3）の同定を可能にする。両方のアプリケーションのために、あなたの獲物タンパク質を修飾するための必要はありません。また、メンブレン背骨が内因獲物タンパク質6の検出を可能にするために十分に敏感である。
ここでは、グラム陰性細菌の膜タンパク質のための最適化されたプロトコルを提示する。グラム陰性細菌のエンベロープは、他に、環境や武装隊から細胞質を分離する細胞膜、外膜とムレイン球形嚢。したがって、我々のプロトコルは、いわゆるフェロプラスト、その結果、外膜の除去とムレイン球形嚢が含まれています。そのようなプロトコルは、ほとんどの細胞型で使用可能であるため、我々のプロトコルは、ほとんどの膜タンパク質に適応する必要があります。さらに、以下の点を考慮する必要があります。
まず、膜ベイトタンパク質を過剰生産するために使用されるベクターのコピー数は、非特異的相互作用を防止するのに十分な膜タンパク質の精製およびローレベルを可能にするハイレベルの間でバランスされなければならない
第二に、いくつかの膜タンパク質のN末端融合は、C末端融合よりも最適かもしれません。両方の場合において、融合の機能は、トランス - 相補性によって確認されるべきである。
第三に、他のアフィニティー精製プロトコルはまた、FLAG精製、その後のMS分析と適合性であるとタンデムアフィニティー精製（TAP）。我々は、理由だけ8アミノ酸（WSHPQFEK）とのサイズが小さいStrepタグIIを好む。
第四に、使用されるホルムアルデヒドの濃度および架橋時間は、非特異的な架橋を防止するために最適化されるべきである。ホルムアルデヒドの過剰十分ではなく、使用が架橋されnonlinked膜ベイトタンパク質（ 図2）との間の比として煮沸試料のイムノブロッティングによってモニターすることができる。架橋されたタンパク質は、イムノブロットの上部にスミアとして移動。アンリンクされたタンパク質は、未処理のタンパク質として移動する。架橋したとリンクされていないタンパク質との間の比率は約3:1である必要があります。
第五に、可溶化のためのすべての膜タンパク質には「一般的な洗剤」はありません。したがって、いくつかの場合において、膜ベイトタンパク質の可溶化に適した洗浄剤は、決定されなければならない。これにより、選択した洗剤はStrepタグコラムと互換性がなければならないN。
最後に、銀染色手順は、その後のMS分析と適合性でなければならない。 MS互換の銀染色キットは、様々な供給業者から入手可能である。我々は同等の良好な結果と異なるものを使用していました。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、SHにドイツ学術振興GraKo1121、Hu1011/2-1とSFB940の補助金によって支えられて
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
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