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Bioengineering

Membrana-SPINE: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine ​​di membrana Published: November 7, 2013 doi: 10.3791/50810
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molekulare Mikrobiologie, Universität Osnabrück

Summary

Un approccio biochimico è descritto per identificare in vivo interazioni proteina-proteina (PPI) di proteine ​​di membrana. Il metodo combina proteina reticolazione, purificazione per affinità e spettrometria di massa, ed è adattabile a qualsiasi tipo cellula o organismo. Con questo approccio, anche l'identificazione degli IPP transitori diventa possibile.

Abstract

Le proteine ​​di membrana sono essenziali per la vitalità delle cellule e sono quindi importanti bersagli terapeutici 1-3. Dal momento che funzionano in complessi 4, sono necessari metodi per identificare e caratterizzare le loro interazioni 5. A questo scopo, abbiamo sviluppato l'esperimento di interazione Strep-proteina di membrana, denominata membrana SPINE 6. Questa tecnica combina in vivo reticolazione usando l'reversibile reticolante formaldeide con purificazione per affinità di una proteina di membrana esca Strep-tag. Durante la procedura, proteine ​​preda reticolati sono co-purificati con la proteina esca membrana e successivamente separati mediante ebollizione. Quindi, due compiti principali possono essere eseguiti quando si analizzano le interazioni proteina-proteina (PPI) di proteine ​​di membrana con membrana SPINE: in primo luogo, la conferma di un partner di interazione proposto da immunoblotting, e in secondo luogo, l'individuazione di nuovi partner di interazione mediante analisi di spettrometria di massa . Inoltre, anche low affinità, PPI transitori sono rilevabili da questa tecnica. Infine, membrana SPINE è adattabile a quasi ogni tipo di cellula, che lo rende applicabile come strumento di screening potente per identificare PPI di proteine ​​di membrana.

Introduction

Per comprendere la funzione di una proteina è fondamentale conoscere i suoi partner di interazione. Diverse tecniche classiche sono disponibili per l'identificazione di partner di interazione di proteine ​​solubili. Tuttavia, queste tecniche non sono facilmente trasferibili ad proteine ​​della membrana a causa della loro natura idrofoba 4. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato il Strep-proteina esperimento di interazione membrana (Membrane-SPINE) 6. Si basa sul metodo colonna vertebrale, che è adatto solo per le proteine ​​solubili 7.

Benefici membrana e colonna vertebrale da due vantaggi della formaldeide agente reticolante: primo, formaldeide possono facilmente penetrare le membrane e quindi genera un'istantanea precisa dell'interattoma di una cellula vivente 8. In secondo luogo, formaldeide cross-link possono essere invertite bollendo 9. Qui, questi due vantaggi sono utilizzati per identificare non solo gli IPP permanenti, ma anche transitori di membrana proteins 6.

In breve, un Strep-tag è fuso al C-terminale della proteina di membrana integrale esca. Cellule che esprimono la proteina esca membrane vengono incubate con formaldeide che legami incrociati preda proteine ​​alla proteina esca membrana (Figura 1). Non sono necessarie modificazioni delle proteine ​​preda. Successivamente, la frazione di membrana è disposta. Pertanto, proteine ​​di membrana vengono solubilizzati mediante trattamento detergente e esca proteine ​​sono co-purificati con le sue proteine ​​preda utilizzando purificazione per affinità. Successivamente, il cross-link è invertita mediante ebollizione, e l'esca e le sue proteine ​​preda co-eluiti sono separati mediante SDS-PAGE. Infine, le proteine ​​preda possono essere identificati mediante analisi immunoblot o spettrometria di massa.

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Protocol

Nota: Le informazioni per i buffer indicati nel protocollo è disponibile in Tabella 1.

1. Fissazione delle interazioni proteina-proteina da formaldeide Cross-linking nelle cellule viventi

  1. Per iniziare a preparare i terreni di crescita, soluzioni madre e tampone P1
    1. Preparare medie 500 ml: Il mezzo deve offrire le condizioni che supportano l'interazione tra proteina di membrana esca e proteine ​​preda. Inoltre, un esperimento deve essere effettuato in condizioni in cui si prevede alcuna interazione (ad esempio, senza cross-linking).
      Nota: Confrontiamo interazioni proteina-proteina nei batteri stressati e non stressati. Pertanto, ci prepariamo 500 ml Luria Bertani (LB) medio (Tabella 1) che ci completiamo con un agente stressante (ad esempio 0,5 M NaCl) in un pallone da 2 L Erlenmeyer. Per il controllo, usiamo normale medio LB con 0,17 M NaCl (pH 7,0).
    2. Preparare Tris-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) e 0,1 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), soluzione 8,0 archivio di pH (Tabella 1).
    3. Preparare tampone P1. Sciogliere saccarosio ad una concentrazione finale di 0,5 M in tampone Tris. Sterilizzare tampone P1 per filtrazione e conservarlo a 4 ° C.
  2. Crescere cellule che esprimono la proteina di membrana esca con un C-terminale Strep-tag fusion da un vettore. Indurre l'espressione di proteine ​​esca membrana per un tempo sufficiente.
    Nota: indurre l'espressione di proteine ​​di membrana esca batteriche in fase precoce-log (A 600 = 0,3) mediante aggiunta di 250 microlitri 1 M isopropil-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) a 500 ml di mezzo (concentrazione finale: 0,5 mM) . Per consentire l'espressione sufficiente, abbiamo incubare i batteri fino alla fase tardo-log (A 600 = 1.2).
  3. Preparare per ogni cultura due bicchieri centrifuga con un volume minimo di 300 ml ciascuno e disporli sul ghiaccio.
  4. Eseguire formaldeide cross-linking.
    CAUZIONE: La formaldeide è altamente tossico Si consiglia di lavorare sotto una cappa aspirante sicurezza..
    1. Trasferire il recipiente di coltura sotto una cappa di sicurezza. Dividere ogni campione in due campioni, uno omettendo reticolazione (- X) e uno compresa la formaldeide reticolante (+ X). Aggiungere la soluzione di formaldeide 4 ml 37% a 250 ml cultura per raggiungere una concentrazione finale di 0,6%.
  5. Trasferire i recipienti di coltura indietro e far crescere le cellule per ulteriori 20 minuti come prima.
  6. Riempite i vostri culture nelle provette da centrifuga sotto una cappa di sicurezza. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 3.000 xg per 30 min.
  7. Gettare il surnatante pipettando con cautela sotto una cappa di sicurezza. Raccogliere tossico-formaldeide contenente surnatante e smaltirla in modo appropriato.
  8. Al fine di raggiungere il rendimento ottimale durante la preparazione di proteine ​​di membrana, preparare prima sferoplasti. Qui, forniamo un protocollo per la formazione spheroplast di batteri Gram-negativi:
    1. Prepae tampone P2 (Tabella 1) da polvere liofilizzata. Sciogliere delicatamente 2 mg di lisozima in 0,1 M EDTA, pH 8, in una provetta da 1,5 ml. Sempre preparare tampone P2 fresco per il giorno dell'esperimento.
    2. Preparare tampone Tris con inibitore della proteasi (tampone P3). A 10 ml di tampone Tris, aggiungere 0,1 ml di 1 M phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (Tabella 1) ad una concentrazione finale di 10 mM. Utilizzare il buffer immediatamente, per garantire il corretto funzionamento di PMSF come inibitore della proteasi.
    3. Pellet cellulari risospendere in 10 ml di tampone Tris con inibitori della proteasi e la soluzione di trasferimento in una provetta da 15 ml.
    4. Aggiungere 1 ml di tampone P2 e incubare in ghiaccio per 30 min.
    5. Raccogliere sferoplasti per centrifugazione a 3000 g per 30 minuti e scartare con attenzione il surnatante.
  9. Incubare il pellet spheroplast notte a -20 ° C.

2. Purificazione di Strep-tag Membrane Protein (Bait)

  1. Mettere spheroplast pellet sul ghiaccio. </ Li>
  2. Durante il tempo i pellets spheroplast disgelo su ghiaccio, preparare 10 ml tampone P3 per ciascun preparato spheroplast. Sciogliere delicatamente 1 mg DNaseI in 10 ml di tampone Tris. Aggiungere 0,1 ml di 1 M PMSF prima dell'uso.
  3. Risospendere il pellet in 6 ml P3 preparati al momento. Sonicare il campione quattro volte per 1 minuto continuamente su ghiaccio con 1 min pausa tra ciascun burst, al fine di interrompere sferoplasti.
  4. Centrifugare il campione a 10.000 xg per 10 min a detriti cellulari raccolto. Trasferire il surnatante con una pipetta ad un tubo ultracentrifuga.
  5. Pellet la frazione di membrana a 100.000 xg per 30 min. Lavare il pellet con cura in Tris-buffer, senza scioglierla. Essiccare il tubo con un fazzoletto di carta (ad esempio Kleenex). Evitare di disturbare il pellet in qualsiasi momento.
  6. Risospendere accuratamente il pellet (= membrane) in 1 ml di tampone Tris. Usare un'aliquota di 20 microlitri per determinare la concentrazione proteica mediante saggio es BCA. A questo punto, le membrane possono essere scosse congelati in Liazoto quid e conservati a -80 ° C.

3. Purificazione di Strep-tag membrana Bait Proteine ​​e SDS-PAGE

  1. Normalizzare la concentrazione proteica della frazione di membrana a 5 mg / ml con tampone Tris. Prendere 2,5 ml frazione di membrana (5 mg / ml) in una provetta ultracentrifuga e aggiungere 0,25 ml di 20% Triton X-100 per raggiungere una concentrazione finale del 2%, in modo da solubilizzare le proteine ​​di membrana. Aggiungi una canna micro-magnetico e mescolare in ghiaccio per 1 ora.
    Nota: Anche se in generale abbiamo buoni risultati con Triton X-100 come detergente, potrebbe essere utile cambiare il detersivo per l'ottimizzazione. A questo proposito, abbiamo migliori risultati con quelli detergenti usati per la purificazione funzionale della rispettiva proteina di membrana esca.
  2. Durante l'esecuzione passo 3.1, preparare 50 ml di soluzione tampone W e 5 ml di tampone E da (Tabella 1). Riempire 10 ml tampone 5x W concentrato a 50 ml e aggiungere 150 microlitri 20% Triton X-100.
    1. Riempire 1 ml 5x buffer E concentrato a 10 ml e aggiungere 30 ml 20% Triton X-100. Equilibrare un Strep-Tactin superflow gravità colonna 1 ml di flusso con 8 ml di soluzione tampone W.
      Nota: E 'essenziale per il detersivo utilizzato per solubilizzazione in una concentrazione 10 volte superiore alla concentrazione micellare critica (CMC) in ogni buffer durante la procedura di purificazione.
  3. Rimuovere l'asta di micro-magnetico dal campione solubilizzazione e ultracentrifuga a 100.000 xg per 30 min, per far sedimentare la frazione di membrana insolubile. Rimuovere il surnatante con una pipetta per ulteriore purificazione.
  4. Caricare il supernatante alla colonna. Eseguire la colonna solo con il flusso di gravità. Lavare la colonna con 5 ml di tampone W. Ripetere questa fase di lavaggio 5x.
  5. Eluire le proteine ​​di membrana esca con 1 ml di tampone E. Ripetere questo passaggio eluizione 4x.
  6. Concentrato frazioni di eluizione 2, 3, e da 4 a 300 ul di un'unità filtro centrifugo.
  7. Mescolare 200 ml di ogni campione con 50 microlitri 5x SDS-PAGE colorante di caricamento. Split ogni preparazione in 125 microlitri aliquote. Bollire un'aliquota di ciascuna preparazione per 20 min a 95 ° C, per invertire formaldeide legami crociati. Lasciate raffreddare i campioni a temperatura ambiente per almeno 10 minuti sul banco superiore.
  8. Carico 30 microlitri di ciascun campione in una singola corsia di un gel di poliacrilammide-adatto per immunoblotting. Usare un pennarello prestained peso molecolare per la migliore orientamento ed eseguire SDS-PAGE 10.

4. Immunoblot analisi per confermare partner di interazione

  1. Una volta passo 3.8 è completato, proteine ​​di trasferimento ad una membrana di nitrocellulosa per es semisecco.
  2. Bloccare la membrana per impedire l'etichettatura aspecifica. Preparare tampone di bloccaggio mediante pesatura albumina di siero bovino (BSA) per ottenere 3% in peso per volume in soluzione salina tamponata con Tris supplementato con una concentrazione finale di 0,05% Tween-20 (TBS-T). Utilizzare un volume sufficiente di tampone di bloccaggio per coprire la membrana. Bloccare la membrana per 1 ora a RT.
  3. Diluire unnd incubare il primo anticorpo specifico proteine ​​preda come al solito. Utilizzare un anticorpo HRP-linked come secondo anticorpo.
  4. Sviluppare l'immunoblot utilizzando un kit rivelazione chemiluminescente ad alta sensibilità. Monitorare il segnale utilizzando una procedura classica lavorazione del film o apparecchiature di imaging digitale.

5. Esperimenti NanoLC-ESI-MS/MS ad alta risoluzione per identificare partner di interazione

  1. Nel caso in cui nessun anticorpo specifico è disponibile per la proteina preda o partner di interazione sconosciuti dovrebbero essere identificata, utilizzare la spettrometria di massa (MS) per l'identificazione. Al fine di prevenire la contaminazione cheratina, usare gel prefabbricato per la separazione delle proteine.
  2. Argento macchia la SDS-PAGE usando un kit di colorazione compatibile MS secondo il protocollo del produttore. Eseguire tutte le operazioni di colorazione e lavaggio in vasche di vetro.
  3. Accise rispettive bande ed analizzare questi per alta risoluzione LC / MS 9.

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Representative Results

Analisi membrana SPINE permette la co-purificazione di proteine ​​di membrana e transitoriamente interagenti partner proteici. Il co-purificazione è ottenuto utilizzando l'agente formaldeide reticolazione. Due parametri sono fondamentali per evitare aspecifiche legami incrociati: la concentrazione di formaldeide e il tempo di reticolazione. L'uso sufficiente, ma non eccessivo di formaldeide può essere facilmente controllato mediante immunoblotting. Complessi proteici formaldeide reticolati possono essere separati mediante ebollizione ma non mediante trattamento SDS. Quindi, essi possono essere visualizzati dopo blotting della proteina esca membrana Strep-tag come striscio nella parte superiore della immuno-blot di un campione non bollito.

Un risultato rappresentativo di un saggio membrana SPINE, compresi tutti i controlli necessari, è presentata nella Figura 2. Come proteina esca l'integrale proteina di membrana CpxA di Escherichia coli è stato utilizzato 6,11. CpxA è una chinasi sensore e consiste di unDominio sensore N-terminale con due domini transmembrana (TMD) che integrano un ampio dominio sensore extracitoplasmatico e altamente conservata citoplasmatica dominio catalitico 12 C-terminale. Dopo la stimolazione, CpxA attiva il suo affine regolatore di risposta CpxR. Attivato CpxR diffonde fuori per mediare la risposta. Per membrana SPINE, il Strep-tag è stata fusa al C-terminale della CpxA (CpxA-Strep). CpxA-Strep reticolato ad altre proteine ​​o complessi di proteine ​​viene rilevato come una macchia nel campione trattata con formaldeide non bollita (Figura 2, linea 1 vs linea 3) che indica sufficiente cross-linking. Inoltre, una diretta interazione proteina-proteina di CpxA-Strep con la sua affine regolatore proteina risposta CpxR come la proteina preda è rilevabile solo in presenza di formaldeide (figura 2, linea 2 contro riga 4) sostenere la specificità di formaldeide reticolazione.

Un risultato rappresentativo di un'analisi membrana SPINE è presentato in Figura 3. Campioni corrispondenti a quelli della figura 2 sono argento macchiato. La freccia indica una banda che è specifico per il campione bollito. Grazie allo sfondo, analisi MS ha inoltre individuato altre proteine ​​oltre CpxR 6. Pertanto, il campione non trattati con formaldeide deve sempre essere analizzato, per assegnare il rumore di fondo e specifico partner interazione.

Tabella 1: tamponi e reagenti necessari per la membrana SPINE.

Buffer / reagente / Media Concentrazione di lavoro commento
LB 10 g Triptone
5 g di estratto di lievito
10 g di NaCl a 1 L,
aggiustare il pH a 7,0 		Luria Broth medio
IPTG 1 M isopropil-β-D-thiogalactopyranoside 0,5 mm
Tampone Tris 20 mM Tris-HCl, pH 8 Regolare il pH a 8,0 con NaOH
0,1 M EDTA, pH 8 0.1 M EDTA Regolare il pH a 8,0 con NaOH
PMSF 1 M Phenylmethylsulfonylfluoride in 100% isopropanolo 10 mM PMSF è stabile in 100% isopropanolo ma non in acqua! Soluzione madre può essere conservato a -20 ° C; PMSF deve essere adattata a temperatura ambiente prima della diluizione in tampone; PMSF contenente buffer deve essere usata entro 10 minuti dalla preparazione.
P1 20 mM Tris-HCl, pH 8.0
0.5 M saccarosio
P2 2 mg / ml lisozima in 0,1 M EDTA, pH 7.5
P3 20 mM Tris-HCl, pH 8.0
PMSF 10 mM 		Utilizzare immediatamentediatamente dopo la preparazione
Detersivo 20% Triton X-100 2% per solubilizzazione
Buffer W Riempire 10 ml 5x concentrato a 50 ml
aggiungere 150 microlitri 20% Triton X-100 		100 mM Tris-HCl, pH 8.0
150 mM NaCl
1 mM EDTA 0,06% Triton X-100 		5x concentrato è parte di Strep-tag purificazione della proteina set tampone (IBA)
Buffer E Riempire 1 ml 5x concentrato a 10 ml
aggiungere 30 ml 20% Triton X-100 		100 mM Tris-HCl, pH 8.0
150 mM NaCl
1 mM EDTA
2.5 Dethiobiotin mM 0,06% Triton X-100 		5x concentrato è parte di Strep-tag purificazione della proteina set tampone (IBA)
5x SDS-PAGE loading dye 0,3125 M Tris-HCl, pH 6.8
10% SDS
0.5 M DTT
50% glicerolo

Figura 1
Figura 1. Diagramma di flusso della procedura di membrana SPINE utilizzando una proteina di membrana Escherichia coli come proteina esca. A) Batteri che esprimono la proteina esca membrana Strep-tag sono trattati con formaldeide. Formaldeide penetra membrane e legami incrociati preda proteine ​​alla membrana proteina esca. B) La frazione di membrana viene preparato e proteine ​​di membrana sono solubilizzati mediante trattamento detergente. Successivamente, proteine ​​preda sono co-purificati con la proteina esca. C) Formaldeide legami incrociati sono invertiti mediante ebollizione e proteine ​​sono separate mediante SDS-PAGE. Infine, le proteine ​​preda o sono controllati da immunoblotting (D) o identificate da MS-analisi (E). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2

Figura 2. Immunoblot rappresentativa utilizzata per monitorare un PPI di una proteina di membrana. Batteri che producono CpxA-Strep da un plasmide come proteina di membrana esca, sono state coltivate in terreno LB per una OD 600 di 1 ed esposto a formaldeide (CH 2 O) per 20 min. La frazione di membrana interna è stato preparato, proteine ​​di membrana sono stati solubilizzati mediante trattamento detergente e CpxA-Strep stato purificato (corsie 1 e 2). I batteri che producono sia CpxA-Strep senza trattamento formaldeide (corsie 3 e 4) o portando il vettore vuoto con trattamento con formaldeide (corsie 5 e 5) serviti come controlli. Aliquote di ciascun campione sono stati cotti a 95 ° C per 20 min(corsie 2, 4, e 6) per separare le proteine ​​cross-collegati a CpxA-Strep. Le proteine ​​sono state separate in un 12,5% SDS-PAGE. L'immunoblotting è stata eseguita e il blot è stato separato in base alla dimensione del CpxA-Strep (51 kDa) e le rispettive proteine ​​preda CpxR (26 kDa). Le due parti del immunoblot sono state incubate con anticorpi policlonali contro CpxA e CpxR rispettivamente. Successivamente, i blot sono stati ulteriormente trattati con un anticorpo anti-coniglio cavallo (HRP) e sviluppate utilizzando il substrato SuperSignal Ovest Pico chemiluminescente. La freccia indica prodotti di degradazione di CpxA. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 3

Figura 3. Rappresentativa-argento macchiato SDS-PAGE utilizzato per l'identificazione di un iPartner nteraction di una proteina di membrana mediante analisi MS. campioni corrispondenti a quelli della figura 2 sono state colorate argento. La freccia indica una banda che è stata analizzata mediante analisi MS e che ha confermato CpxR come partner interazione di CpxA 5. Corsia 7 spettacoli purificati CpxR-His 6 e 8 corsie spettacoli purificati CpxA-His 6 proteine. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Discussion

Analisi membrana colonna vertebrale è un approccio biochimico che permette di confermare e per identificare a questo punto sconosciuti partner di interazione di proteine ​​di membrana. Membrana SPINE combina in vivo reticolazione da formaldeide con purificazione di una proteina di membrana esca Strep-tag. La combinazione con immunoblotting facilita la conferma di partner di interazione previsti (Figura 2). Inoltre, la combinazione con analisi MS consente l'identificazione di partner di interazione sconosciuti (Figura 3). Per entrambe le applicazioni, non vi è alcun obbligo per modificare la vostra proteina preda. Inoltre, Membrana colonna vertebrale è sufficientemente sensibile per consentire la rilevazione di proteine ​​endogene preda 6.

Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per proteine ​​di membrana di batteri gram-negativi. La busta di batteri gram-negativi separa il citoplasma dall'ambiente e possiede, oltre allamembrana citoplasmatica, una membrana esterna e un sacculus murein. Quindi, il nostro protocollo comprende la rimozione della membrana esterna e sacculus murein, con conseguente cosiddetti sferoplasti. Poiché tali protocolli sono disponibili per la maggior parte dei tipi di cellule, il protocollo deve essere adattabile per la maggior parte delle proteine ​​di membrana. Inoltre, devono essere considerati i seguenti punti.

Prima di tutto, il numero di copie del vettore utilizzato per produrre in eccesso la proteina di membrana esca deve essere bilanciato tra un livello elevato per consentire membrana sufficiente purificazione di proteine ​​e un basso livello per evitare interazioni aspecifiche

In secondo luogo, per alcune proteine ​​di membrana una fusione N-terminale potrebbe essere più ottimale di una fusione C-terminale. In entrambi i casi, la funzionalità di fusione deve essere confermata da trans-complementazione.

Terzi diversi protocolli di purificazione, di affinità sono compatibili anche con successiva analisi MS, come la depurazione FLAG etandem purificazione per affinità (TAP). Noi preferiamo la Strep-tag II a causa delle sue piccole dimensioni con solo 8 aminoacidi (WSHPQFEK).

In quarto luogo, la concentrazione di formaldeide utilizzato e il tempo di reticolazione deve essere ottimizzata per evitare aspecifica reticolazione. Un uso sufficiente ma non eccessivo di formaldeide può essere monitorato mediante immunoblotting di campioni non bollito come rapporto tra reticolato e non collegati proteina esca membrana (Figura 2). Proteine ​​reticolate migrano strisciate nella parte superiore del immunoblot. Un proteine ​​legate migrano come proteina non trattato. Il rapporto tra reticolato e proteine ​​scollegato deve essere di circa 3:1.

In quinto luogo, non c'è un "detersivo generale" di tutte le proteine ​​di membrana per solubilizzazione. Quindi, in alcuni casi il detersivo adatta per solubilizzazione della proteina esca membrana deve essere determinato. In tal modo, il detersivo scelto deve essere compatibile con la Strep-tag Column.

Infine, la procedura di colorazione argento deve essere compatibile con successiva analisi MS. I kit di colorazione argento compatibili MS sono disponibili da diversi fornitori. Abbiamo usato quelli diversi con buoni risultati comparabili.

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Disclosures

Non abbiamo nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 e SFB940 di SH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% Formaldehyde Roth 4979.1 Should not be older than one year
DNaseI Sigma DN25
BCA protein assay kit Pierce 23225
Micromagnetic rod Roth 0955.2 5 mm in length, 2 mm in diameter
Triton X-100 Roth 6683.1 standard detergent for solubilization
n-Dodecyl-β-maltoside Glycon D97002-C the best detergent to solubilze CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column IBA 2-1207-050
Strep-tag protein purification buffer set IBA 2-1002-001 Contains buffer W and buffer E
Amicon Ultra-4 centrifugal filter Millipore UFC803024
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate Pierce 34080
SilverQuest Silverstaining kit Invitrogen LC6070
FireSilver Staining Kit Proteome Factory P-S-2001
Ultracentrifuge

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References

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Bioingegneria proteine ​​di membrana, formaldeide cross-linking MS-analisi Strep-tag
Membrana-SPINE: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine ​​di membrana<em&gt; In Vivo</em
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Müller, V. S., Tschauner, K.,… More

Müller, V. S., Tschauner, K., Hunke, S. Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo. J. Vis. Exp. (81), e50810, doi:10.3791/50810 (2013).

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