Summary
Deze studie gebruikte een multi-well plaat microfluïdische systeem aanzienlijk verhogen doorvoer cel rollen studies onder fysiologisch relevante schuifkracht. Gezien het belang van cel rollen in het multi-step cel homing cascade en het belang van cel homing na systemische toediening van exogene populaties van cellen bij patiënten, biedt dit systeem potentieel als een screening platform om celtherapie verbeteren.
Abstract
Een belangrijke uitdaging voor celtherapie is het onvermogen om systemisch doel een grote hoeveelheid levensvatbare cellen met een hoge efficiëntie weefsels van belang na intraveneuze of intra-arteriële infusie. Bijgevolg toenemende cel homing wordt momenteel bestudeerd als een strategie om celtherapie verbeteren. Cel rollen op het vasculaire endotheel is een belangrijke stap in het proces van cel homing en kan worden gesondeerd in vitro met een parallelle plaat stroming kamer (PPFC). Echter, dit is een uiterst vervelend, lage throughput assay, met slecht gecontroleerde stroming. In plaats daarvan, gebruikten we een multi-well plaat microfluïdische systeem bestuderen van cellulaire roleigenschappen maakt een hogere doorvoer onder nauwkeurig gecontroleerde, fysiologisch relevante schuifstroom 1,2. In dit artikel laten we zien hoe de roleigenschappen van HL-60 (menselijke promyelocytenleukemie) cellen op P-en E-selectine-gecoate oppervlakken, alsmede op cel-monolaag gecoate oppervlakken readil kan zijny onderzocht. Om beter te simuleren ontstekingen, werd de microfluïdische kanalen oppervlak bedekt met endotheelcellen (EC), die vervolgens werden geactiveerd met tumornecrosefactor-α (TNF-α), aanzienlijke verhoging interacties met HL-60 cellen onder dynamische omstandigheden. De verbeterde doorvoer en geïntegreerde multi-parameter software analyse platform, dat een snelle analyse van parameters zoals het rollen snelheden en glooiende pad maakt, zijn belangrijke voordelen voor de beoordeling cel rollen woningen in-vitro. Waardoor een snelle en nauwkeurige analyse van technische oplossingen ontwikkeld om cellen rollen en homing beïnvloeden, kan dit platform helpen vooraf exogene celtherapie.
Introduction
Een van de belangrijkste uitdagingen in de succesvolle klinische vertaling van cel-gebaseerde therapie is de inefficiënte levering of targeting van systemisch toegediend cellen aan gewenste locaties 3,4. Bijgevolg is er een voortdurende zoektocht naar benaderingen cel homing verbeteren, en in het bijzonder cel rollen, als een strategie voor celtherapie verbeteren. Cel rollen op de bloedvaten is een belangrijke stap in de cel homing cascade, klassiek gedefinieerd voor leukocyten die zijn aangeworven om ziekteplaatsen 5. Deze stap wordt geregeld door specifieke interacties tussen endotheliale selectine namelijk P-en E-selectine (P-en E-sel), en de teller liganden op het oppervlak van leukocyten 5,6. Beter begrip en een grotere efficiëntie van de cel homing, en in het bijzonder de rollende stap, zijn van groot belang in de zoektocht naar nieuwe platforms om celtherapie verbeteren. Tot op heden dit is bereikt door het gebruik van parallelle plaat stromingskamers (PPFCs), bestaande uit twee platte plates met daartussen een pakking met een instroom en uitstroom poort aan de bovenste plaat, waardoor een celsuspensie wordt geperfuseerd met een spuitpomp 7,8, 9. Het oppervlak van de bodemplaat kan worden bekleed met een relevant celmonolaag / substraten en de interactie tussen geperfundeerde cellen en het oppervlak onder schuifkracht wordt vervolgens onderzocht 7. Echter, PPFC is een lage omzet, reagens-consumeren, en tamelijk vervelend methode, met belvorming, lekkage en slecht gecontroleerde stroom presenteren belangrijke nadelen.
Een alternatieve techniek voor de traditionele PPFC is een multi-well plaat microfluïdische systeem, waardoor hogere doorvoercapaciteit van cellulaire assays (tot 10 keer hoger dan PPFCs) onder nauwkeurige computergestuurde schuifstroom met lage reagensverbruik 1,10. Cell rollen experimenten worden uitgevoerd binnen het microfluïdische kanalen, die kunnen worden bekleed met cel monolagen of speciale substraten en afgebeeld using een microscoop, met rollende eigenschappen gemakkelijk geanalyseerd met behulp van een geschikte software. In deze studie demonstreren we de mogelijkheden van deze multi-well plaat microfluïdische systeem bestuderen van de roleigenschappen van de menselijke promyelocytische leukemie (HL-60) cellen op verschillende oppervlakken. HL-60 rollen op substraten zoals P-en E-sel, en op cel monolagen die verschillende rollen receptoren werd geanalyseerd. Bovendien antilichaam (Ab) blokkeren gebruikt om directe betrokkenheid van specifieke selectinen bij het mediëren van de rolbeweging van HL-60 op de oppervlakken te tonen. Rolling experimenten werden uitgevoerd met een verhoogde doorvoersnelheid, onder stabiele afschuifstroming, met minimale reagens / cel verbruik, waardoor efficiënte analyse van de belangrijkste rollen parameters zoals walsen snelheid, het aantal rollen cellen, en glooiende pad eigenschappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek
- Human promyelocytenleukemie (HL-60) cellen
- Cultuur HL-60 cellen in 75 cm2 flessen met 15 ml van Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM), aangevuld met 20% (v / v) foetaal runderserum (FBS), 1% (v / v) L-glutamine en 1 % (v / v) Penicilline-streptomycine.
- Opnieuw media om de 3 dagen met afzuigen helft van de celsuspensie volume en vervangen door volledig IMDM medium.
- Voor carboxyfluoresceïne diacetaat, succinimidylester (CFSE) kleuring centrifuge HL-60 celsuspensie (400 xg, 5 min.), resuspendeer in een 1 uM CFSE-oplossing (bereid in voorverwarmde PBS) en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Dan centrifuge cellen, aspireren supernatant en resuspendeer cellen in vers voorverwarmd medium voor 30 minuten. Was de cellen in PBS en vervolgens gebruiken voor rollende experimenten (zie Figuur 1B voor representatief beeld van CFSE-gekleurde HL-60 cellen op P-sel-gecoate oppervlak).
- Lung microvasculaire endotheelcellen (LMVECs)
- Coat 100 mm petrischalen met 0,1% gelatine-oplossing (v / v in PBS) en incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten.
- Cultuur LMVECs op gelatine gecoate 100 mm petrischaaltjes in volledige endothelial growth medium (endotheel basaal medium-2 (EBM-2)), aangevuld met een specifieke groei supplement kit, zie REAGENTIA). Wijzig de media om de andere dag en subcultuur cellen bij het bereiken van 80-90% samenvloeiing.
- Voor subcultuur, wassen cellen met PBS en los cellen met 4 ml 1 x trypsine-EDTA gedurende 3 min bij 37 ° C en geneutraliseerd in een gelijk volume van volledige EBM-2 medium. Breng de celsuspensie om een 15 ml buis en centrifugee (400 xg, 5 min). Na centrifugatie, resuspendeer de pellet in 1 ml compleet medium en endotheliale cellen te tellen met een hemocytometer. Niet over-passage van de cellen, omdat dit invloed heeft op hun morfologie en functie-gebruik alleen cellen onder passage 7 voor alle experimenten.
- Chinese hamster ovarium-P-selectine (CHO-P) Cellen
- CHO-P cellen, die CHO-cellen stabiel getransfecteerd menselijke P-sel te uiten zijn, werden door medewerkers (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School) 11,12.
- Cultuur CHO-P cellen in T175 cm2 kolven in 25 ml F-12 media.
- Voor passage, wassen cellen met 10 ml PBS gedurende 4-5 seconden en vervolgens trypsinize in 10 ml 1 x trypsine-EDTA gedurende 3 min bij 37 ° C, gevolgd door neutralisatie volledige media.
- Centrifugeer de celsuspensie (400 xg, 5 min.), voorzichtig zuig de supernatant, resuspendeer de celpellet in 1 ml volledige media en tel de cellen meteen hemocytometer.
2. Werking van de geïntegreerde Multi-well plaat Microfluidic System
- Zorg ervoor dat alle apparatuur goed is aangesloten en zet de verschillende modules: computer, controller, omgekeerde microscoop, en CCD-camera.
- Open de imaging software, zorg ervoor dat de multi-well plaat module en de beeldvorming module goed worden gepresenteerd op het scherm.
- Sluit de buizen naar de damp val (aangesloten op de controller) en sluit ze aan de Pressure Interface ook.
- Plaats de plaat met meerdere holtes in de plaat verwarmer / adapter. Reagentia Naar putjes (hieronder beschreven) welke interface bovenkant van de plaat. Plaats plaat voor de beeldvorming op geautomatiseerde podium.
- De interface hecht aan de bovenkant van de plaat en past een pneumatische druk van de controller naar de top van de putten, het besturen van de vloeistof door de microfluïdische kanalen met de gedefinieerde stroomsnelheid gemakkelijk geregeld met de multi-well plaatmodule scherm onder de handmatige modus.
- Reagentia in het kanaal stroom over een observatie gebied, gelegen tussen de putten. Microfluïdische kanaal afmetingen zijn 350 micrometer breed x 70 micrometer lang. De lengte van het lineaire kanaal 1 mm en de bodem van de kanalen bestaat uit een 180 urn dekglaasje glas, die verenigbaar met helderveld, fase fluorescentie en confocale microscopie.
- Verwerven van video's met behulp van een CCD-camera (acquisitie stroom, 11 beelden / sec) en analyseren via compatibele software.
3. Coating van microfluïdische kanalen met een eiwitsubstraat of een celmonolaag
- Microfluïdische kanaal bekleden met fibronectine of P-/E-selectin
- Bereid 1 ml van 20 ug / ml fibronectine-oplossing in PBS. Alter volume op basis van het aantal kanalen te coaten (gebruik 25-50 gl fibronectine per kanaal).
- Voeg 25-50 ul van fibronectine oplossing voor elke inlaat goed. Solliciteer dwarskracht van 2 dyn / cm 2gedurende 5 minuten om het kanaal doortrekken. Let op de hiel van de vloeistof die in de uitlaat ook. Incubeer 30-45 minuten bij kamertemperatuur
- Verstuif de oplossing uit putten (niet direct te zuigen uit de midden cirkel die het kanaal voedt) 1,13. Voeg 200-500 ul PBS in het stopcontact en goed wassen met PBS kanaal door het toepassen van schuifkracht 2 dyn / cm 2 gedurende 5 minuten. Het kanaal is nu goed bedekt met fibronectine en klaar voor gebruik.
- Om jas met P-of E-sel, stelt een 5 ug / ml oplossing van de gewenste menselijk recombinant eiwit in PBS, en laag de kanalen zoals boven beschreven, met 1 uur incubatie bij 37 ° C coating mogelijk.
- Creatie van CHO-P of LMVEC monolaag binnen de microfluïdische kanaal
- Voorzichtig trypsinize cellen van kweekschalen gedurende 3 min, uitdoven met een 2-voudig volume van volledige media en gecentrifugeerd (5 minuten bij 400 xg). Resuspendeer cellen met 10 ml volledige media en centrifugeer (5 minuten bij 400 xg) tegn.
- Tel de cellen celconcentratie bepalen de suspensie. Om de vorming van een confluente monolaag LMVEC in het kanaal te waarborgen, brengen celconcentratie 15-20 miljoen cellen / ml. Voor een confluente CHO-P celmonolaag Gebruik 50-60.000.000 cellen / ml. Gebruik 25-50 gl celsuspensie per kanaal - bepalen oorspronkelijke aantal cellen voor het experiment gebruikt dienovereenkomstig.
- Voeg 25-50 gl celsuspensie in de geschikte concentratie aan de inlaat goed. Plaats de plaat op de microscoop podium en cellen te introduceren in het kanaal (2 dyn / cm 2) tot cellen worden waargenomen op het scherm vullen het gehele kanalen, en dan stoppen de stroom.
- Vul beide afvoer en toevoer met 200 ul van een van beide vol LMVEC of CHO media. Laat de cellen regelen en hechten gedurende 3 uur in de incubator (37 ° C, 5% CO2).
- Na de incubatie van 3 uur, was het kanaal met volledige media (2 dyn / cm 2, 10-15 min) niet gehecht te verwijderencellen. Cellen moet nu volledig samenvloeiing en het kanaal is nu klaar voor gebruik. Afhankelijk eerste cel zaaidichtheid kunnen aanvullende 2-3 uur van afwikkeling tijde aan volledige dekking van het oppervlak van met de cellen.
4. LMVEC Pro-inflammatoire Activering en Antibody Blokkeren van P-/E-selectin
- Bereid een TNF-α-oplossing (10 ng / ml) in LMVEC basale media.
- Inflammatoire activatie van LMVEC induceren in de kanalen, voeg 100 ul van de TNF-α oplossing voor de inlaat goed en introduceren van de oplossing in het kanaal door toepassing schuifkracht van 2 dyn / cm 2 gedurende 5 minuten. Voor controle kanalen (niet-geactiveerde EC), voeg 100 ul van LMVEC basale media om de inlaat goed en introduceren in het kanaal (2 dyn / cm 2 voor 5 min). Kanaal is nu klaar voor een rollende assay.
- P-sel en E-sel op LMVECs en CHO-P cellen blokkeren, introduceren neutraliseren P-sel (kloon AK4, 5 ug / ml in basal media) of E-sel (kloon P2H3, 5 ug / ml in basale media) antilichamen in het kanaal en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Vervolgens wassen kanalen met basale media (2 dyn / cm 2 gedurende 5 minuten). Kanalen zijn nu klaar voor een rollende assay.
5. HL-60 Rolling Assay op Substraat / Cel-Monolayer Coated Microfluidic Channels
- Zorgvuldig onderzoek van de kanalen onder de microscoop te bevestigen dat kanalen correct zijn bekleed (bij bekleding met cellen zou volledig confluente monolaag worden waargenomen).
- HL-60 cel suspensie te bereiden voor het rollen experimenten centrifuge HL-60 celsuspensie (5 min bij 400 xg) en eenmaal wassen met basale media. Tel de cellen en resuspendeer in IMDM (basale media, met Ca2 + en Mg2 +) om een celsuspensie HL-60 maakt met 5.000.000 cellen / ml. Gebruik 25-50 ul van celsuspensie voor elk kanaal tot de voortschrijdende analyse uit te voeren.
- Voeg 25-50 ul van de cel Suspension goed uitlaat, plaat plaats binnen de temperatuurgecontroleerde kentekenplaathouder (37 ° C) en plaats op de microscoop podium. Vervolgens cellen te introduceren in het kanaal door het toepassen van dwarskracht van 2 dyn / cm 2 (cellen worden waargenomen binnen 10-15 sec voortvloeien uit uitlaat naar inlaat).
- Om de rollen zelf een functie van schuifspanning onderzoeken verminderen afschuiving 0,25 dyn / cm 2 en verwerven 20-30 seconden video (met de functie "overname stroom") in elke gewenste afschuiving (shear stijgen geleidelijk van 0,25 tot 5 dyn / cm 2. Ook kunnen hogere schaar gebruiken).
- Verwerven van video's met behulp van een CCD-camera (acquisitie stroom, 11 beelden / sec) en analyseren glooiende paden en glooiende snelheden via compatibele software.
6. Flowcytometrie om de expressie van Surface moleculen te detecteren
- Na behandeling met trypsine, bereiden een celsuspensie (met behulp van 1-2 x 10 5 cellen / monster) van de gewenste celtype (HL-60, CHO-P of LMVECs) in PBS (- / -), aangevuld met 2% FBS. Was de cellen tweemaal en breng monstervolume 50 pl (met dezelfde buffer).
- Incubeer elk monster met de gewenste fluorofoor-geconjugeerde Ab (zie bijgevoegde tabel voor gedetailleerde informatie) bij 4 ° C gedurende 20 minuten (afdekken met aluminiumfolie).
- Was de cellen tweemaal (dezelfde buffer) en breng uiteindelijk volume van gekleurd celsuspensie tot 200 pi. Analyseer de monsters met een flow cytometer om expressie van oppervlaktemoleculen detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HL-60 cellen rollen op P-en E-selectine oppervlakken, maar niet op fibronectine
HL-60 cellen beschouwd gouden standaard "rollen" of drukken zij diverse doelzoekende liganden, waaronder de rollen liganden P-sel glycoproteïne ligand-1 (PSGL-1) en Sialyl-Lewis X (SLEX) 5,14 (figuur 1A ). Het oppervlakte-eiwit PSGL-1 werkt als een steiger voor de tetra-saccharide SLEX, bemiddelen specifieke interactie met P-en E-sel, die up-gereguleerd op het endotheel tijdens ontsteking 5,6,15. Om de mogelijkheden van de multi-well plaat microfluïdische systeem te testen, werden talloze microfluïdische kanalen tegelijkertijd gecoat met verschillende substraten en rollen interacties van HL-60 cellen met deze oppervlakken werden geanalyseerd. HL-60 cellen vertoonden een sterke kantelgedrag van P-sel beklede oppervlak met cellen eerst gevangen van stroom, gevolgd door een afzonderlijk rolbeweging. Zoals getoond in figuur 1C, en bestaanent met de literatuur, HL-60 cellen vertonen een soortgelijke rollen gedrag E-sel oppervlakken, nog niet op met fibronectine gecoate substraten 14,16-19. Cell snelheid via compatibele software geanalyseerd, werd uitgezet tegen afschuifspanning, die een krachtige rollende respons van cellen op P-en E-sel met een gemiddelde snelheid tussen 1-12 um / sec.
HL-60 cellen rollen op CHO-P monolaag coaten van de microfluïdische kanaal
Vervolgens hebben we geprobeerd om de haalbaarheid van het gebruik van deze microfluïdische systeem om efficiënt te testen interacties tussen cellen van belang en een celmonolaag coating het oppervlak beoordelen. Om de interactie van HL-60 cellen staand met een celmonolaag die rollen markers tot expressie, gebruikten we CHO-P cellen die getransfecteerd stabiel P-expressie, maar niet E-, sel (figuur 2A. Zie ook figuur 2B voor representatieve beeld van HL-60 cellen op de CHO-P monolaag coating de microfluïdische kanaal) 11,12. HL-60 cellen vertoonden een sterke rollende reactie op CHO-P cellen (figuur 2C). Om te testen of deze rolbeweging inderdaad wordt gemedieerd door P-sel, werd de CHO-P monolaag gepreïncubeerd met blokkerende antilichamen voor zowel P-of E-sel, voorafgaand aan de perfusie van HL-60 cellen in het kanaal. Zoals getoond in figuur 2C, het blokkeren van de CHO-P monolaag met een P-sel Ab resulteerde in een significante daling van het aantal rollen HL-60 cellen op het oppervlak, hetgeen aantoont dat P-sel inderdaad bemiddelt HL-60 rollen zoals eerder beschreven 14,18. Het uitvoeren van de assay in een microfluïdische kanaal maakt snelle screening van verschillende omstandigheden en efficiënte blokkering van de receptoren met slechts kleine volumes vanaf 25 ul. Isotype controle Ab of blokkering E-sel (die niet wordt uitgedrukt op CHO-P cellen) had geen invloed op het aantal rollen cellen op CHO-P cellen, waaruit de kracht van deze assay nauwkeurig pin wijzende directe betrokkenheid van specifieke oppervlakteactievee markers in cellulaire rollen interacties.
Rolling van HL-60 cellen op TNF-a-geactiveerde LMVECs wordt gemedieerd door E-selectine
Endotheliale cellen is bekend om reguleren wrijvingscoëfficiënt merkers, zoals P-en E-sel, tijdens inflammatie, helpen bij het rekruteren van leukocyten naar plaatsen van ontsteking 5,6. Hoewel muizen EC expressie zowel P-en E-sel als reactie op inflammatoire stimuli, zoals interleukine-1 (IL-1) en tumornecrosefactor-α (TNF-α), humane EC alleen drukken E-sel in reactie op deze cytokinen 20,21. Dit werd bevestigd in ons flowcytometrie test toont expressie van E-sel, maar geen P-sel, op long microvasculaire endotheelcellen (LMVEC) als reactie op TNF-α stimulatie (Figuur 3A). De multi-well microfluïdische plaat bestaat uit een groot aantal afzonderlijke microfluïdische kanalen, waardoor hogere throughput testen van meerdere verschillende omstandigheden. We gebruikten deze voordelige ontwerpaan LMVECs binnen de microfluïdische kanalen (Figuur 3B) om snel analyseren van de interacties van HL-60 cellen met EC onder meerdere voorwaarden plaat. Inflammatoire instellingen simuleren, werden LMVECs voorbehandeld met de pro-inflammatoir cytokine TNF-α. Interessant is dat HL-60 cellen niet interageren met-un geactiveerde LMVECs, en cellen werden niet waargenomen te rollen op dit oppervlak. Integendeel, weergegeven HL-60 cellen een sterke kantelgedrag op TNF-α-geactiveerde LMVECs met gemiddelde snelheid van 5-15 um / sec (Figuur 3C).
Wij dan gericht op de rol van P-sel of E-sel in het glooiende interactie tussen de HL-60 cellen en geactiveerde LMVECs verkennen. Hiervoor werden TNF-α-geactiveerde EC gepreïncubeerd met P-sel of E-sel blokkerende antilichamen en het rollen van HL-60 cellen werd geanalyseerd. Zoals getoond in figuur 4A, blokkeren E-sel, die opwaarts gereguleerd on-TNF-α geactiveerde LMVECs, met een significmier afname van het aantal rollen cellen op de geactiveerde endotheliale monolaag. In tegenstelling met een isotype controle en een Ab tegen P-sel, die niet is uitgedrukt op geactiveerde EC, had geen significant effect op HL-60 rollen op de geactiveerde endotheliale laag hebben. Deze gegevens tonen de directe betrokkenheid van E-sel in HL-60 rollen op TNF-α-geactiveerde EC, in overeenstemming met eerdere rapporten 20,21. Uit de verkregen video, de analysesoftware mag een om de paden van afzonderlijke cellen interactie met het substraat te volgen. We gebruikten deze mogelijkheid om specifiek te volgen het pad van de individuele cellen die in wisselwerking met TNF-α-geactiveerde EC w / wo E-sel blokkeren. Zoals getoond in Figuur 4B, het aantal rollen cellen op gedeblokkeerd geactiveerd LMVECs was significant hoger dan bij E-sel-geblokkeerde geactiveerd EC. Voorts bleek dat de rolbeweging van HL-60 op gedeblokkeerd LMVECs continu en robuust, terwijl de rollen paden cellenover e-sel geblokkeerde EC werd gefragmenteerd (elke kleur vertegenwoordigt een andere cel, zie bijvoorbeeld cellen af tegen gl figuur 4B). In samenhang met deze bevinding, de rollende snelheid van HL-60 cellen op geblokkeerde TNF-α-geactiveerde EC was beduidend lager dan hun voortschrijdende snelheid op de E-sel geblokkeerde EC's (Figuur 4C).
Figuur 1. HL-60 cellen rollen op P-en E-selectine-gecoate oppervlakken. (A) HL-60 cellen brengen de rollen liganden PSGL-1 en SLEX (Iso ctr - isotypecontrole, geen Ab - geen antilichaam). Vertegenwoordiger snap-shot beeld van CFSE-gekleurde HL-60 cellen op P-sel (B) beklede oppervlak onder stroom. (C) HL-60 cellen krachtig rollen op P-en E-sel gecoate oppervlakken, maar niet op met fibronectine gecoate oppervlak. Rolling snelheid wordt uitgezet tegen schuifspanning (n = 10-15 cellen per meetpunt, werden snelheden geanalyseerd door compatibele software). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. HL-60 rollen op CHO-P cel monolaag direct gemedieerd door P-sel. (A) CHO-P cellen brengen P-sel, maar geen E-sel. (B) Representatieve beeld van HL-60 cellen op de CHO-P monolaag coating het oppervlak van microfluïdische kanalen (10x vergroting). (C) HL -60 cel rollen op CHO-P monolaag direct gemedieerd door P-sel zoals aangetoond door Ab blokkerende test (gedeblokkeerd - CHO-P monolaag niet geïncubeerd met een antilichaam isotype ctr-CHO-P monolaag geïncubeerd met een isotype controle; * p <0,05, one-way ANOVA werd gebruikt met Tukey HSD post-hoc test, fout balken gevenSEM, n = 3.
Figuur 3. HL-60 cellen rollen op TNF-α-geactiveerde LMVECs. (A) TNF-α activering van LMVECs induceren oppervlakte-expressie van E-sel, maar geen P-sel. (B) representatief beeld van confluerende LMVEC monolaag in twee microfluïdische kanalen (4x vergroting). (C) HL-60 cellen vertonen een robuuste rollen respons op TNF-α-geactiveerde LMVECs, maar niet on-un geactiveerd LMVECs. Iso ctr - isotypecontrole, unact EC - niet-geactiveerde endotheelcellen, TNF-α-act EC -. TNF-α-geactiveerde endotheelcellen Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
< br /> Figuur 4. HL-60 rollen op TNF-α-geactiveerde LMVECs wordt gemedieerd door E-selectine. (A) HL-60 rollen op TNF-α-geactiveerde LMVECs wordt gemedieerd door E-sel, in plaats van P-sel, zoals aangetoond door Ab blokkering assay (isotype ctr-EG monolaag geïncubeerd met een isotypecontrole; * p <0,05, one-way ANOVA werd gebruikt met Tukey HSD post-hoc test, fout balken geven SEM, n = 3) (B) Mobiele pad analyse blijkt continu. en robuuste rollen van HL-60 cellen op gedeblokkeerd geactiveerd EC vergeleken met gefragmenteerde, zwak glooiende waargenomen op E-sel-geblokkeerde geactiveerde EC's (elke kleur vertegenwoordigt een andere cel. Analyse werd uitgevoerd via geschikte software). (C) HL-60 rollen snelheid op TNF-α-geactiveerde EC trager op gedeblokkeerd geactiveerd EC vergelijking E-sel-geblokkeerde geactiveerde EC (Afschuifsterkte gebruikt. 2 dyn / cm 2 * p <0,05, ongepaarde tweezijdige t-test foutbalken vertegenwoordigen SEM, n = 17-36 cellen per groep).www.jove.com/files/ftp_upload/50866/50866fig4large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een van de belangrijkste uitdagingen succesvolle vertaling van exogeen celtherapie is het onvermogen om cellen efficiënt te leveren aan plaatsen van verwonding en ontsteking met een hoog rendement engraftment 3. Cell rollen is een cruciale stap in het proces van cel homing, de vertraging van cellen vergemakkelijken op de wanden van bloedvaten, uiteindelijk leidend tot de stevige adhesie en transmigratie door het endotheel in het weefsel 5. Beter begrip van het walsen verkregen voor kandidaat celtypen kunnen leiden tot de ontwikkeling van technieken om de cel homing verbeteren en een belangrijke bijdrage leveren aan de verbetering van celtherapie.
PPFC is een veel gebruikt middel voor cel rollen, alsook andere cellulaire gedrag staand onder schuifkracht. De toepassing van PPFC voor de behandeling neutrofieladhesie op het endotheel werd voor het eerst bestudeerd door Lawrence et al.. In 1987, en sindsdien is de handel verkrijgbare products zijn ontwikkeld 8,9. PPFCs bestaan uit twee vlakke platen gescheiden door een pakking die de afmetingen van de kamer 7 regelt. De bovenste plaat bevat een instroom en uitstroom poort, die door het gebruik van een spuitpomp kan de perfusie van de celsuspensie door de kamer 7,8. Er is ook een extra poort die negatieve druk (vacuüm) om de platen te behouden toepassing samengeperst 7. Hoewel parallelle plaat stromingskamers effectief zijn gebruikt om cellulaire reacties, waaronder cel rollen, onder afschuifstroming omstandigheden te onderzoeken, zijn er tal van beperkingen die de doeltreffendheid ervan te verminderen. Een belangrijke beperking van stromingskamers is het grote aantal cellen grote hoeveelheden reagentia die nodig zijn vanwege de grote dode volume in het stroomsysteem 7. Een ander cruciaal punt is de aanwezigheid van luchtbellen, die gemakkelijk kunnen ontstaan tijdens stromingskamer montage, potentieel schadelijk voor de cel monolaag en substraatcoating op de bodemplaat 22. Echter verdere wijzigingen aangebracht in traditionele PPCFs een extra poort omvatten over de bovenplaat om als een opvanginrichting voor het verwijderen van lucht te vergemakkelijken bellen 23. Het instellen van de PPFC experiment is vervelend en de stroomcel is gaan lekken wanneer de afdichting beschadigd of niet goed gemonteerd. Tenslotte is er een verschil tussen de gewenste en experimenteel toegepast afschuifsnelheden, wat resulteert in een smal traject van gelijkmatige stroomsnelheden. Door theoretisch vergelijken vier PPFCs met verschillende inlaat en uitlaat posities bleek dat twee configuraties gemodelleerde afschuifsnelheden die afweek van de berekende afschuifsnelheden tot 75% 24. Om dezelfde kamer opnieuw vereist tijdrovende wasstappen, en gecombineerd met de hierboven beschreven problemen, dit maakt de PPFCs vrij vervelende en lage doorvoer.
In ons onderzoek gebruikten we een volledig geïntegreerde multi-en plaat microfluïdische systeem, gebaseerd op nauwkeurig aangestuurd afschuifstroming 1,2,13. Deze 48 goed microfluïdische plaat bevat 24 microfluïdische kanalen, met elk paar aangrenzende putten verbonden met een microfluïdische kanalen 1,25. 10-12 rollen testen kunnen worden uitgevoerd in 1 uur, waardoor een snelle screening van tientallen omstandigheden in een enkele dag. De microfluïdische kanalen kunnen eenvoudig worden gecoat met een eiwit substraat of cel monolagen en de interactie tussen cellen van belang en het oppervlak kan worden afgebeeld met behulp van een microscoop, verkregen met een CCD camera en compatibele software geanalyseerd. Belangrijke parameters zoals mobiele kwantificering, berekend rolsnelheid en bepaalde track pad analyse kan gemakkelijk worden verkregen efficiënt analyseren kantelgedrag op verscheidene substraten 13. In deze studie hebben we de efficiëntie van dit systeem in het bestuderen van cel rollen door HL-60 promyelocytenleukemie cellijn, gevestigde "rollen" die toets te drukkenrollend liganden, zoals PSGL-1 en SLEX, die samen fungeren als de tegenhanger liganden voor P-en E-sel 15,26. In correlatie met de vorige verslagen, HL60 cellen inderdaad vertoonde een stevige rollende gedrag op P-en E-sel-gecoate microfluïdische kanalen, met langzame rollende snelheden van 1-12 micrometer / sec 14,17-19. HL-60 cellen niet rollen op fibronectine oppervlak, in overeenstemming met eerdere rapporten die aantonen dat ongedifferentieerde HL-60 cellen niet klevende interactie vertonen met fibronectine 16. Het ontwerp van de multi-well plaat microfluïdische systeem, waardoor tot 10-12 assays / uur vergeleken met slechts 1-2 assays / h die kan worden getest met behulp PPFCs, verhoogt doorvoer ten minste 5 keer. Bovendien moeten PPFCs worden teruggeplaatst en gewassen voor elk hergebruik, verder vertragen prestaties tarief. Bovendien, het gemakkelijk gestuurde maakt een snelle uitvoering van de shear-afhankelijke experimenten, die dan gemakkelijk kunnen worden geanalyseerd via geschikte software.
We vervolgens getest deze multi-well plaat systeem analyseren interacties tussen HL-60 cellen en EC bekleden de microfluïdische kanaal. EC bekend uitdrukken P-en E-sel gedurende het ontstekingsproces 5. ECS te voorzien van een inflammatoire stimulus, we voorbehandeld ze met TNF-α. Terwijl E-sel werd up-gereguleerd, P-sel was, consistent met de literatuur blijkt dat menselijke EC expressie E-sel, maar geen P-sel, als reactie op TNF-α activatie aangezien de primaat P-sel promoter mist TNF -α respons elementen, automalting in transcriptionele inductie van alleen E-sel 20,21. Ontstekingen werden vervolgens in het kanaal gesimuleerd door incuberen EG monolaag met TNF-α, gevolgd door perfusie van HL-60 cellen om de interacties met de EG oppervlak verkennen. Terwijl HL-60 hadden geen invloed op geactiveerde EC, ze hebben vertonen een krachtige rollende respons op TNF-α-geactiveerde EC (figuur 3C), correleerde met hun reactie gerapporteerd in de literatuur 22. Ab blokkerende experimenten (Figuur 4A), dan blijkt dat E-sel, maar geen P-sel, blokkeren resulteerde in een significante vermindering in HL-60 rollen op geactiveerde EC. Deze gegevens tonen aan de directe betrokkenheid van E-sel, en niet P-sel, in het bemiddelen het rollen van HL-60 op de TNF-α-geactiveerde humane EC 20,21. De Ab blokkerende experimenten, omgekeerd tonen E-sel-gemedieerde rollen op geactiveerde EC vs P-sel-gemedieerde rollen op CHO-P, bevestigt verder de haalbaarheid en relevantie van Ab Blocking experimenten snel uitgevoerd in deze microfluïdische systeem. Interessant is dat deze remming van rollen was voltooid (ongeveer 70% reductie) suggereert dat andere oppervlak receptoren, zoals VCAM-1, ook deel aan HL-60 rollen op geactiveerde EC 27. Track pad analyse bleek voorts een ander interessant fenomeen - terwijl het rollen van HL-60 op gedeblokkeerd geactiveerde EC was continu en robuust, het lage aantal cellen die nog gerold op E-sel geblokkeerde geactiveerd EC toonde een gefragmenteerde glooiende pad op de geblokkeerde EC ( Figuur 4B). Dit fenomeen werd niet waargenomen in EC geïncubeerd met P-sel blokkeringen of isotype controle (gegevens niet getoond). Dit wijst er sterk op dat terwijl een rollende respons is mogelijk via andere markers bij de EG E-sel wordt geblokkeerd, deze rollen is gebaseerd op zwakke, gedeeltelijke HL-60-EG-interacties, die alleen een losse, gedeeltelijke rollende respons met de geactiveerde EC 5,22 ,27-29. Dit wordt ondersteund door de gegevens getoond in figuur 4C 30-33, en het verbeteren van de doorvoer van microfluidics via de multi-well plaat systeem hier gepresenteerde verdere hoogtepunten van het potentieel van deze technologie voor een efficiënte en nauwkeurige analyse van de belangrijkste roleigenschappen naar betere therapeutische toepassingen .
Dit onderzoek richtte zich op onderzoek van de HL-60 cel rollen op eiwitsubstraten en celmonolagen onder fysiologisch relevante en nauwkeurig gecontroleerde afschuifstroming gebruikeen multi-well plaat microfluïdische systeem. Ook andere celtypen en andere substraten / cel monolagen kunnen gemakkelijk worden gebruikt om hun roleigenschappen bestuderen. Gebruiksgemak en eenvoudige analyse maakt een nauwkeurige analyse van belangrijke roleigenschappen en Ab blokkeren of activering met verschillende groeifactoren of inhibitoren kunnen gebruikt worden om potentiële betrokkenheid van moleculaire merkers in de glooiende reactie verkennen. Dit kan bijzonder nuttig zijn studiehouding stamcel rollen en homing, die kan worden gemanipuleerd om stamcellen celtherapie 34-36 verbeteren. Belangrijk is, kan meerdere voorwaarden worden getest met een verbeterde doorvoer (5-10 keer hoger versus PPFCs), waarbij een snelle en efficiënte studie van rollend eigenschappen als gevolg van de plaat ontwerp. Andere testen die relevant zijn voor cel homing, zoals cel adhesie, chemotaxis en transmigratie kunnen ook worden bestudeerd met behulp van dit systeem 1,10,13. Kortom, dit microfluïdische systeem naar voren als een krachtige techniek om cel rollen en s bestuderenhould dienen als een nuttig instrument om te helpen bij de klinische vertaling van exogene celtherapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
CHO-P cellen waren een soort geschenk van Dr Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health subsidie HL095722 aan JMK Dit werk werd mede ondersteund door een Movember-Prostaatkanker Stichting Challenge Award naar JMK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics | ||
References
- Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
- Ankrum, J., Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).
- Karp, J. M., Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Ley, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J. Vis. Exp. (10), e1644 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C. Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation. Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).
- Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1. J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).
- Conant, C. G., et al. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).
- Larsen, G. R., et al. P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities. J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).
- Varki, A. Selectin ligands: will the real ones please stand up. J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).
- Bohnsack, J. F., Chang, J. Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation. Blood. 83, 543-552 (1994).
- Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).
- Moore, K. L., et al. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A.
- Yao, L., et al. Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates. Blood. 94, 3820-3828 (1999).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. , e1009 (2009).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W.
- Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
- Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).
- Varki, A.
- Ramos, C. L., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).
- Yago, T., et al. Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- Yago, T., et al. E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling. Blood. 116, 485-494 (2010).
- Simone, G., et al. Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system. Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition. Small. 8, 2886-2894 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations. Electrophoresis. , (2013).
- Simone, G., et al. A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics. Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).
- Sarkar, D., et al.
- Cheng, Z., et al. Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance. Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).
- Enoki, C., et al. Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).
