Summary
Denne studie benyttet en multi-brønn-plate mikrofluidsystem, i betydelig grad å øke gjennomstrømningen av celle rullende studier henhold fysiologisk relevant skjærflyt. Gitt viktigheten av celle rulle i det flertrinns celle homing kaskade, og viktigheten av celle homing etter systemisk levering av eksogene populasjoner av celler hos pasienter, har dette systemet potensial som et screening-plattform for å forbedre celle-basert terapi.
Abstract
En hovedutfordring for celle-basert terapi er den manglende evne til systemisk rettet mot et stort antall av levedyktige celler med høy effektivitet til vev av interesse etter intravenøs eller intraarteriell infusjon. Følgelig øker celle homing er for tiden studert som en strategi for å forbedre celle terapi. Cell rulle på blodåreendotelets er et viktig skritt i prosessen med celle homing og kan bli analysert in-vitro ved hjelp av en parallell plate flyt kammer (PPFC). Men dette er en ekstremt kjedelig, lav gjennomstrømning analysen, med dårlig kontrollert strømningsforhold. I stedet har vi brukt et multi-brønn-plate mikrofluidsystem som muliggjør undersøkelse av cellulær valseegenskapene i en høyere gjennomstrømning henhold nøyaktig styrt, fysiologisk relevant skjærflyt 1,2. I denne artikkelen viser vi hvordan de rullende egenskapene til HL-60 (human promyelocytic leukemi) celler på P-og E-selektinantistoffer-belagte flater samt på cellemonolag-belagte overflater kan være readily undersøkt. For bedre å simulere inflammatoriske tilstander, ble mikrofluidkanal overflate belagt med endotelceller (ECS), som så ble aktivert med tumor nekrose faktor-α (TNF-α), i betydelig grad øker interaksjoner med HL-60-celler under dynamiske forhold. Den forbedrede gjennomstrømning og integrert multi-parameteranalyse software-plattform, som muliggjør hurtig analyse av parametere som for eksempel valsehastigheter og rullende bane, er viktige fordeler for å vurdere celle rullende egenskaper in vitro. Å tillate hurtig og nøyaktig analyse av tekniske tilnærminger er utformet for å påvirke celle rullende og homing, kan denne plattform hjelp forhånd eksogene cellebasert terapi.
Introduction
En av de store utfordringene i den vellykkede kliniske oversettelse av cellebasert terapi er ineffektiv levering eller målretting av systemisk tilført celler til ønskede områder 3,4. Det er derfor en konstant søken etter måter å forbedre celle homing, og spesielt celle rullende, som en strategi for å forbedre celle terapi. Cell rullende på blodårer er et viktig steg i cellen homing kaskade, klassisk definert for leukocytter som er rekruttert til sykdom nettsteder fem. Dette trinnet er regulert av spesifikke interaksjoner mellom endotelceller selektiner, det vil si P-og E-selectin (P-og E-sel), og deres mot-ligander på overflaten av leukocytter 5,6. Bedre forståelse og økt effektivitet av celle homing, og spesielt den rullende trinnet, er av stor betydning i jakten på nye plattformer for å forbedre celle-basert terapi. Hittil har dette blitt oppnådd ved hjelp av parallelle plate strømningskammere (PPFCs), omfattende to flate plates med en pakning mellom dem, med en innstrømning og utstrømning port plassert på den øvre plate, gjennom hvilken en cellesuspensjon blir perfusert ved hjelp av en sprøytepumpe 7,8, 9. Den overflate av bunnplaten belegges med et relevant cellemonolags / substrater og samspillet mellom perfusert celler og til overflaten under skjærstrøm blir deretter undersøkt 7.. Imidlertid er PPFC en lav gjennomstrømning, reagens-forbruk, og ganske kjedelige metoden, med bobledannelse, lekkasje og dårlig kontrollert strømnings presenterer store ulemper.
En alternativ teknikk til den tradisjonelle PPFC er en multi-brønn-plate mikrofluidsystem, som tillater høyere gjennomløp utførelse av cellulære analyser (opp til 10 ganger høyere enn PPFCs) i henhold til nøyaktig, datastyrt skjærflyt med lavt reagens forbruk 1,10. Cell rullende eksperimenter utføres inne i microfluidic kanaler, som kan være belagt med celle-monolag eller modifiserte substrater og avbildes USIng et mikroskop, med rullende egenskaper lett analyseres ved hjelp av en passende programvare. I denne studien, vi vise mulighetene dette multi-brønn plate microfluidic system ved å studere de rullende egenskaper av menneskelig promyelocytic leukemi (HL-60) celler på ulike overflater. HL-60 rullende på underlag som P-og E-sel, samt på celle-monolag som uttrykker forskjellige valse reseptorer, ble analysert. I tillegg er antistoffet (Ab) blokking ble anvendt for å demonstrere direkte involvering av spesifikke selektiner i mediering av den rullende bevegelse av HL-60 på disse overflater. Rullende eksperimenter ble utført med økt gjennomstrømning under stabil skjærflyt med minimal reagens / celle forbruk, slik at effektiv analyse av viktige rullende parametere som valsehastighet, antallet av rullende celler, og rullende baneegenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Cell Culture
- Humant promyelocytic leukemi (HL-60)-celler
- Kultur HL-60-celler i 75 cm 2 kolber med 15 ml av Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM), supplert med 20% (v / v) føtalt bovint serum (FBS), 1% (v / v) L-Glutamin, og en % (v / v) Penicillin-Streptomycin.
- Endring media hver 3. dag ved å aspirere halvparten av cellesuspensjonen volum og erstatte den med komp IMDM medium.
- For karboksyfluorescein diacetat, succinimidyl-ester (CFSE) farging, sentrifuger HL-60 cellesuspensjon (400 x g, 5 min), resuspender i en 1 pM CFSE løsning (fremstilt i forvarmet PBS) og inkuberes i 15 min ved 37 ° C. Deretter sentrifuger celler, aspirer supernatanten og resuspender celler i frisk prewarmed medium for 30 min. Vask cellene i PBS og deretter bruke for rullende eksperimenter (se Figur 1B for representativt bilde av CFSE-farget HL-60 celler på P-sel-belagte overflaten).
- Lung mikrovaskulære endotelceller (LMVECs)
- Coat 100 mm petriskåler med 0,1% gelatin-oppløsning (volum / volum i PBS) og inkuberes ved 37 ° C i minst 30 min.
- Kultur LMVECs på gelatin-belagt 100 mm petriskåler i fullstendig endotelial vekstmedium (endothelial basal medium-2 (EBM-2)), supplert med en bestemt vekst supplement kit, se REAGENTS). Endre media annenhver dag og sub-kultur celler ved å nå 80-90% samløpet.
- For sub-kultur, vaskes cellene med PBS, og deretter løsne cellene med 4 ml av 1 x Trypsin-EDTA i 3 min ved 37 ° C og nøytraliserer i et likt volum av komplett EBM-2-medier. Overfør cellesuspensjonen til en 15 ml rør og centrifuge (400 x g, 5 min). Etter sentrifugering, resuspender pelleten i 1 ml komplett endoteliale media og telle celler med et hemocytometer. Ikke over-passasje cellene, da dette påvirker deres morfologi og funksjon-bruk bare cellene under passering 7 for alle eksperimenter.
- Chinese hamster eggstokk-P-selektin (CHO-P) Celler
- CHO-P celler, som er CHO celler stabilt transfekterte å uttrykke menneskelige P-sel, ble gitt av samarbeidspartnere (Beth Israel Medical Center diakonale, Harvard Medical School) 11,12.
- Kultur CHO-P-celler i T175 cm kolber 2 i 25 ml F-12 medium.
- For aging, vaskes cellene med 10 ml PBS i 4-5 sekunder, og deretter trypsinize i 10 ml 1x Trypsin-EDTA i 3 min ved 37 ° C, etterfulgt av nøytralisering i hele mediet.
- Sentrifuger cellesuspensjonen (400 x g, 5 min), forsiktig Aspirer supernatanten, cellepelleten suspenderes i 1 ml fullstendig media og telle celler meden hemocytometer.
2. Drift av Integrert Multi-vel Plate Microfluidic System
- Sørg for at alt utstyr er riktig tilkoblet og slå på de forskjellige moduler: datamaskin, controller, invertert mikroskop, og CCD kamera.
- Åpne bildebehandlingsprogrammer, sørg for at den multi-brønn plate modul og bildebehandling modulen er riktig presentert på skjermen.
- Koble rørene til dampfelle (koblet til kontrolleren) og også koble dem til Trykk Interface.
- Plasser multi-brønn plate i platevarmer / adapter. Legg reagenser til brønnene (beskrevet nedenfor), og feste-grensesnitt på toppen av platen. Plasser plate for bildebehandling på automatisert scenen.
- Grensesnittet er festet til toppen av platen, og gjelder et pneumatisk trykk fra styreenheten til toppen av brønnen, å drive fluidum gjennom microfluidic kanaler på den definerte strømningshastighet, lett kontrolleres ved hjelp av multi-brønn-platemodul skjermbildet under manuell modus.
- Reagenser i kanalen strømmen over en observasjonsområdet befinner seg mellom brønnene. Microfluidic kanal dimensjoner er 350 mikrometer brede x 70 mikrometer høy. Lengden av den lineære kanalen er 1 mm og bunnen av kanalene består av en 180 mikrometer dekkglass, som er kompatibel med lysfelt fase, fluorescens og konfokal mikroskopi.
- Acquire videoer ved hjelp av et CCD-kamera (bekk oppkjøpet, 11 bilder / sek) og analysere via kompatibel programvare.
Tre. Belegg av Microfluidic Kanaler med en Protein Underlag eller en celle med ett lag
- Coating microfluidic kanal med fibronectin eller P-/E-selectin
- Forbered 1 ml 20 pg / ml fibronectin løsning i PBS. Alter volum basert på det antall kanaler som skal males (bruke 25-50 pl av fibronektin pr kanal).
- Legg 25-50 mL av fibronektin løsning til hver innløp godt. Påfør skjærkraft av to dyn / cm 2i 5 min for å gjennomstrømme kanalen. Vær oppmerksom på perlen av væsken som vises i uttaket godt. Inkuber i 30-45 min ved RT
- Aspirer løsning fra brønner (ikke aspirer direkte fra midten sirkel som mater kanal) 1,13. Til 200 til 500 mL med PBS inn i utløps godt og vasker kanal med PBS ved å anvende skjærflyt 2 dyn / cm 2 til 5 min. Kanalen er nå riktig belagt med fibronektin, og klar til å benyttes.
- For å belegge med P-eller E-sel, forberede en 5 mikrogram / ml oppløsning av det ønskede human rekombinant protein i PBS, og belegge de kanaler som er beskrevet ovenfor, med 1 timers inkubasjon ved 37 ° C for å tillate overflatebelegg.
- Opprettelse av CHO-P eller LMVEC monoskikt inne microfluidic kanal
- Forsiktig trypsinize celler fra kultur retter i 3 min, slukke ved hjelp av en to-ganger volumet av komp medier og sentrifuge (5 min ved 400 xg). Resuspender cellene med 10 ml fullstendig media og sentrifugen (5 min ved 400 x g) igjn.
- Tell cellene for å bestemme cellekonsentrasjonen i suspensjonen. For å sikre dannelsen av et sammenflytende monolag LMVEC inne i kanalen, bringe celle-konsentrasjon på 15 til 20 millioner celler / ml. For en konfluent CHO-P cellemonosjikt, bruker fra 50 til 60 millioner celler / ml. Bruk 25-50 pl av cellesuspensjonen for hver kanal - bestemme startcellenummer brukes for tilsvarende eksperiment.
- Til 25-50 pl av cellesuspensjonen i den passende konsentrasjon til innløpet godt. Sett platen på objektbordet og innføre cellene inn i kanalen (2 dyn / cm 2) til cellene observeres på skjermen fylle hele kanaler, og deretter stoppe strømningen.
- Fyll både utløp og innløp med 200 mL av enten full LMVEC eller CHO media. La cellene seg og holder i 3 timer i en inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Etter 3 timers inkubering, vaskes kanalen med full media (2 dyn / cm 2, 10-15 min) for å fjerne løseceller. Cellene skal nå vises helt konfluent og kanalen er nå klar til bruk. Avhengig av startcelle seeding tetthet, kan ytterligere 2-3 timer for settling tid være nødvendig for å sikre fullstendig dekning av overflaten med cellene.
4. LMVEC Pro-inflammatorisk Aktivisering og Antistoff Blokkering av P-/E-selectin
- Forbered en TNF-α-løsning (10 ng / ml) i LMVEC basal medier.
- For å indusere inflammatorisk aktivering av LMVEC i kanalene, tilsett 100 pl av den TNF-α-løsning til innløpet godt og innføre løsningen inn i kanalen ved å anvende skjærflyt 2 dyn / cm 2 til 5 min. For styrekanaler (ikke-aktiverte ECS), tilsett 100 pl av LMVEC basalmedier til innløpet godt og introdusere inn i kanalen (2 dyn / cm 2 i 5 min). Kanal er nå klar for en rullende assay.
- Hvis du vil blokkere P-sel og E-sel på LMVECs og CHO-P celler, innføre nøytralisere P-sel (klone AK4, 5 mikrogram / ml i BAsal medier) eller E-sel (klon P2H3, 5 mikrogram / ml i basal media) antistoffer inn i kanalen og inkuberes i 1 time ved 37 ° C. Deretter vaske kanaler med basal media (2 dyn / cm 2 for 5 min). Kanaler er nå klar for en rullende assay.
5. HL-60 Rolling analysen på Substrat / cellemonolag-Coated Microfluidic kanaler
- Nøye undersøke kanaler under mikroskopet for å bekrefte at kanalene er riktig belagt (i tilfellet med belegg med celler, bør en fullstendig sammenflytende cellemonolag observeres).
- For å fremstille HL-60 cellesuspensjon for valseforsøk, sentrifuge HL-60 cellesuspensjon (5 min ved 400 x g) og vaskes en gang med basalmediet. Telle celler og resuspender i IMDM (basal medier, som inneholder Ca 2 + og Mg 2 +) for å lage en HL-60 cellesuspensjon med 5 millioner celler / ml. Bruk 25-50 pl av cellesuspensjonen for hver kanal for å utføre rulle-analysen.
- Til 25-50 pl av celle suspension til uttak godt, sted platen inne i temperaturkontrollerte plate holder (37 ° C) og plass på mikroskopet scenen. Deretter innfører celler inn i kanalen ved å anvende skjærkraft av 2 dyn / cm 2 (celler bør observeres i løpet av 10-15 sek strømmer fra uttaket til innløps).
- For å undersøke den rullende responsen som en funksjon av skjærspenning, redusere skjær til 0,25 dyn / cm 2, og skaffe 20 til 30 sek filmer (ved hjelp av "stream anskaffelse"-funksjon) i hver ønsket skjær (øke skjær gradvis fra 0,25 opp til 5 dyn / cm 2. Det er også mulig å bruke høyere sakser).
- Acquire videoer ved hjelp av et CCD-kamera (bekk oppkjøpet, 11 bilder / sek) og analysere rullende stier og rullende hastigheter via kompatibel programvare.
6. Flowcytometri å oppdage Expression Of overflatemolekyler
- Etter trypsinering, forberede en cellesuspensjon (med 1-2 x 10 5 celler / prøve) av det ønskede celletype (HL-60, CHO-P or LMVECs) i PBS (- / -), supplert med 2% FBS. Vask cellene to ganger og ta med prøvevolum på 50 pl (ved hjelp av den samme buffer).
- Inkuber hver prøve med ønsket fluoroforen-konjugert Ab (se vedlagt tabell for detaljert informasjon) ved 4 ° C i 20 min (dekk til med aluminiumsfolie).
- Vask cellene to ganger (samme buffer) og bringe sluttvolumet av farget cellesuspensjon til 200 mL. Analyser prøvene ved hjelp av et flyt-cytometer for å detektere ekspresjon av overflatemolekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HL-60-celler rulle på P-og E-selektin flater, men ikke på fibronectin
HL-60-celler er ansett gullstandard "valser" som uttrykker de forskjellige målsøkende ligander, inkludert de rullende ligander P-sel glykoprotein ligand-1 (PSGL-1) og sialyl-Lewis-X (SLEX) 5,14 (Fig. 1A ). Overflateproteinet PSGL-en fungerer som et stillas for tetra-saccharide SLEX, formidling spesifikk interaksjon med P-og E-sel, som er oppregulert på endotelet under betennelse 5,6,15. For å teste egenskapene til multi-brønn plate microfluidic system, ble mange microfluidic kanaler belagt samtidig med forskjellige underlag og rullende interaksjoner av HL-60 celler med disse overflatene ble analysert. HL-60-celler viste en robust rullende oppførsel på P-sel-belagte overflate, med celler først tatt fra strømning, fulgt av et distinkt rullende bevegelse. Som vist på figur 1C, og bestårent med litteraturen, HL-60 celler viser en lignende rullende oppførsel på E-sel overflater, men ikke på fibronectin-belagte underlag 14,16-19. Cell hastighet, analysert via kompatibel programvare, ble plottet mot skjærspenning, som viser et robust rullende respons av celler på P-og E-sel med en gjennomsnittlig hastighet mellom 1-12 um / sek.
HL-60-celler rulle på CHO-P monolag belegge den mikrofluidkanal
Deretter rettet vi å vurdere muligheten for å bruke denne mikrofluidsystem for effektivt å teste interaksjoner mellom cellene av interesse og et cellemonosjikt belegg på overflaten. Utforske samspillet av HL-60 celler med en cellemonolag som uttrykker rullende markører, brukte vi CHO-P celler, som er transfektert til stabilt uttrykker P-, men ikke E-, sel (figur 2A. Se også figur 2B for representant Bildet av HL-60-celler på CHO-P monolag belegg av mikrofluidkanal) 11,12. HL-60 celler vises en sterk rullende respons på CHO-P celler (Figur 2C). For å teste hvorvidt denne rullebevegelse faktisk blir mediert av P-sel, ble CHO-P monolag preinkuberes med blokkerende antistoffer for enten P-eller E-sel, før perfusjon av HL-60-celler inn i kanalen. Som vist i figur 2C, blokkerer CHO-P monolag med en P-sel AB resulterte i en betydelig reduksjon i antallet av rullende HL-60-celler på overflaten, noe som viser at P-sel faktisk medierer HL-60 rulle som beskrevet tidligere 14,18. Utføring av analysen i et mikrofluidkanal tillater hurtig filtrering av forskjellige tilstander og effektiv blokkering av reseptorene ved å bruke bare små volum, så lite som 25 pl. Isotype kontroll eller Ab blokkerer E-sel (som uttrykkes ikke på CHO-P celler) ikke påvirke antallet rullende celler på CHO-P celler, noe som viser styrken av denne analysen i nøyaktig pin-peker direkte involvering av spesifikke surface markører i cellulære rullende interaksjoner.
Valsing av HL-60 celler på TNF-a-aktivert LMVECs er mediert av E-selektin
Endotelceller er kjent for å opp-regulere festeflate markører, for eksempel P-og E-sel, under betennelse, bistå i rekruttering av leukocytter til områder av betennelse 5,6. Imidlertid, mens murin EKB uttrykker både P-og E-sel i respons til inflammatoriske stimuli som interleukin-1 (IL-1) og tumornekrosefaktor-α (TNF-α), human EKB bare uttrykke E-sel som reaksjon på disse cytokiner 20,21. Dette ble validert i vårt strømningscytometri-analyse, som viser ekspresjon av E-sel, men ikke P-sel, på lunge mikrovaskulære endotelceller (LMVEC) i respons på TNF-α stimulering (figur 3A). Den multi-brønn mikrofluid plate består av mange separate microfluidic kanaler, som tillater høyere gjennomløp testing av flere forskjellige betingelser. Vi brukte denne fordelaktige utformingtil plate LMVECs inne microfluidic kanaler (Figur 3B) å raskt analysere interaksjoner av HL-60 celler med egenkapitalbevis under flere forhold. For å simulere inflammatoriske innstillinger, ble LMVECs forbehandlet med den pro-inflammatoriske cytokin, TNF-α. Interessant, gjorde HL-60 celler ikke samhandle med un-aktivert LMVECs, og cellene ble ikke observert å rulle på denne flaten. Tvert imot, HL-60-celler viste en sterk rulling oppførsel på TNF-α-aktiverte LMVECs, med gjennomsnittshastighet på 5-15 mikrometer / sek (figur 3C).
Vi tok sikte på å utforske involvering av P-sel eller E-sel i det bølgende samspillet mellom HL-60 celler og de aktiverte LMVECs. Til dette ble det TNF-α-aktivert EKB preinkuberes med P-sel-eller E-sel blokkerende antistoffer, og rulling av HL-60-celler som ble analysert. Som vist i figur 4A, blokkerer E-sel, som var oppregulert på TNF-α-aktivert LMVECs, resulterte i en significmaur nedgang i antall rullende celler på aktivert endothelial monolayer. Derimot syntes å bruke en isotype kontroll eller en Ab mot P-sel, som ikke ble uttrykt på den aktiverte egenkapitalbevis, ikke ha en betydelig effekt på HL-60 rullende på aktivert endothelial lag. Denne informasjonen viser direkte involvering av E-sel i HL-60 rullende på TNF-α-aktivert egenkapitalbevis, i samsvar med tidligere rapporter 20,21. Fra de oppkjøpte videoer, tillater analyse programvare man å spore banene til individuelle celler i samspill med underlaget. Vi brukte denne muligheten til å spesifikt spore banen av individuelle celler som samhandlet med TNF-α-aktivert egenkapitalbevis w / wo E-sel blokkering. Som vist i figur 4B, antall rullende celler på ublokkerte aktivert LMVECs var betydelig høyere enn på E-sel-blokkert aktivert egenkapitalbevis. Videre viste det seg at den rullende bevegelse av HL-60 på ublokkerte LMVECs er kontinuerlig og robust, mens de rullende stier av cellerpå E-sel-blokkert ECS ble fragmentert (hver farge representerer en annen celle, se for eksempel celler af g. gl i figur 4B). I konsistens med dette funnet, valsehastigheten av HL-60-celler på ublokkerte TNF-α-aktivert EKB var signifikant lavere enn de valsehastighet på E-sel-blokkert EKB (figur 4C).
Figur 1. HL-60 celler rulle på P-og E-selektinantistoffer-belagte overflater. (A) HL-60 celler uttrykker de rullende ligander PSGL-en og SLEX (B) Representant snap-shot bilde av CFSE-farget HL-60 celler på P-sel (Iso ctr - ingen antistoff - isotype kontroll, ingen Ab). -belagte overflate under strømning. (C) HL-60-celler robust rulle på P-og E-sel-belagte overflater, men ikke på fibronektin-belagte overflate. Rolling hastighet er plottet mot skjærspenning (n = 10-15 celler per datapunkt, ble hastigheter analysert av kompatibel programvare). Klikk her for å se større figur .
Figur 2. HL-60 rulle på CHO-P cellemonolaget er direkte mediert av P-sel. (A) CHO-P-celler uttrykker P-sel, men ikke e-sel. (B) Representative bilde av HL-60-celler på CHO-P monolag belegg på overflaten av den mikrofluidkanal (10X forstørrelse). (C) HL -60 celle rulle på CHO-P monolaget er direkte mediert av P-sel som demonstrert av Ab blokkering assay (avblokkert - CHO-P monolaget var ikke er inkubert med et antistoff, isotype ctr-CHO-P monolaget ble inkubert med en isotype-kontroll, * p <0,05, enveis ANOVA ble brukt med Tukey sin HSD post hoc test, feilfelt representererSEM, n = 3.
Figur 3. HL-60-celler rulle på TNF-α-aktivert LMVECs. (A) TNF-α aktivering av LMVECs indusere overflate ekspresjon av E-sel, men ikke P-sel. (B) Representative bilde av sammenflytende monolag LMVEC i to microfluidic kanaler (4X forstørrelse). (C) HL-60-celler som utviser en robust rullende respons på TNF-α-aktivert LMVECs, men ikke på un-aktivert LMVECs. Iso ctr - isotype kontroll, unact egenkapitalbevis - uaktiverte endotelceller, TNF-α-act egenkapitalbevis -. TNF-α-aktivert endotelceller Klikk her for å se større figur .
< br /> Figur 4. HL-60 rulle på TNF-α-aktiverte LMVECs medieres av E-selektin. (A) HL-60 rulle på TNF-α-aktivert LMVECs medieres av E-sel, i stedet for P-sel, som demonstrert av Ab blokkering assay (isotype ctr-EC monolayer inkuberes med en isotype kontroll, * p <0,05, enveis ANOVA ble brukt med Tukey sin HSD post hoc test, feilfelt representerer SEM, n = 3) (B) Cell banen analyse avslører kontinuerlig. og robust rulling av HL-60-celler på ublokkerte aktiverte EKB forhold til fragmentert, svakt rullende observert på E-sel-blokkert aktivert EKB (hver farge representerer en annen celle. analyse ble utført via egnet programvare). (C) HL-60 valse hastighet på TNF-α-aktivert egenkapitalbevis er tregere på ublokkerte aktiverte egenkapitalbevis i forhold til E-sel-blokkert aktivert egenkapitalbevis (Skjærspenning brukes:. 2 dyn / cm 2 * p <0,05, uparede to-tailed t-test, feilfelt representerer SEM, n = 17 til 36 celler pr gruppe).www.jove.com/files/ftp_upload/50866/50866fig4large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de store utfordringene i vellykket oversettelse av eksogene cellebasert terapi er manglende evne til å effektivt levere cellene til områder av skader og betennelser med høy engraftment effektivitet tre. Cell rullende representerer et viktig skritt i prosessen med celle homing, legge til rette for nedbremsing av celler på veggene i blodårene, til slutt fører til firmaet sitt heft og sjelevandring gjennom endotelet i vevet fem. Bedre forståelse av valsingen for kandidat celletyper kan føre til utvikling av teknikker for å forbedre celle homing og bidrar vesentlig til å forbedre celle-basert terapi.
PPFC er et mye brukt verktøy for å utforske celle rullende, samt andre cellulære atferd under skjæring flyt. Anvendelsen av PPFC for å undersøke nøytrofile vedheft på endotelet ble først studert av Lawrence et al. I 1987, og siden da kommersielt tilgjengelig produksjonts har blitt utviklet 8,9. PPFCs består av to flate plater som er atskilt med en pakning som styrer dimensjonene til kammeret 7.. Den øvre plate inneholder en innstrømning og utstrømning port, som ved hjelp av en sprøytepumpe muliggjør perfusjon av cellesuspensjonen gjennom kammeret 7.8. Det er også en ytterligere port som gjelder et undertrykk (vakuum) for å holde platene presses sammen 7.. Selv om parallelle plate strømningskammere er blitt effektivt brukt til å undersøke cellulære responser, inkludert celle rulle, under skjærstrømningsforhold, er det mange begrensninger som reduserer dens effektivitet. En større begrensning av strømningskamrene er det høye antallet av celler og store volumer av reagenser som er nødvendige på grunn av den store dødvolum inne i strømningssystemet 7.. Et annet viktig problem er tilstedeværelsen av luftbobler, noe som lett kan oppstå flyt kammermontasjen, noe som kan hindre cellemonolaget og underlagetbelegg på bunnplaten 22.. Imidlertid er det gjort ytterligere modifikasjoner til tradisjonelle PPCFs å innlemme en ytterligere utgang på den øvre plate for å fungere som en boblefelle for å lette fjernelse av luftbobler 23.. Sette opp PPFC eksperimentet er også kjedelig, og strømningscellen er utsatt for lekkasje hvis pakningen er skadet eller ikke montert nøye. Til slutt er det en forskjell mellom den ønskede og eksperimentelt anvendte skjærhastigheter, noe som resulterer i et smalt område av ensartede strømningshastigheter. Ved teoretisk sammenligne fire PPFCs med varierende innløps-og utløps stillinger, ble det funnet at to av konfigurasjoner modellert skjær priser som avvek fra de beregnede skjær priser med opp til 75% 24. For å bruke samme kammer krever tidkrevende vasketrinn, og i kombinasjon med de ovenfor beskrevne utfordringer, og dette gjør det PPFCs forholdsvis omstendelig og liten produksjon.
I vår studie har vi brukt en fullt integrert multi-brønn psent microfluidic system, avhengig av nøyaktig kontrollert skjær flyt 1,2,13. Dette 48 godt microfluidic plate omfatter 24 microfluidic kanaler, med hvert par av tilstøtende brønner forbundet med en mikrofluidkanal 1,25. 10-12 rullende analyser kan bli utført i 1 time, noe som gir rask screening av flere dusin forhold i en enkelt dag. De microfluidic kanaler kan lett belegges med et protein-substrat eller cellemonolagene og samspillet mellom cellene av interesse og overflaten kan bli avbildet ved bruk av et mikroskop, overtatt av et CCD-kamera og analysert ved kompatible programvare. Viktige parametere som celle kvantifisering, beregning av rullende hastighet og bestemt spor banen analyse kan lett skaffes til effektivt analysere rullende atferd på flere underlag 13. I denne studien, vi vurderte effektiviteten av dette systemet i å studere celle rullende ved hjelp av HL-60 promyelocytic leukemi cellelinje, godt etablerte "ruller" som uttrykker nøkkelenrullende ligander, som PSGL-en og SLEX, som sammen fungerer som motstykket ligander for P-og E-sel 15,26. I sammenheng med tidligere rapporter, HL60 celler faktisk viste en robust rullende oppførsel på P-og E-sel-belagt microfluidic kanaler, med langsomme rullende hastigheter på 1-12 mikrometer / sek 14,17-19. HL-60 celler ikke rulle på fibronectin overflaten, i samsvar med tidligere rapporter som viser at udifferensierte HL-60 celler ikke viser selvklebende interaksjoner med fibronectin 16. Utformingen av multi-brønn-plate mikrofluidsystem, slik at opp til 10 til 12 assays / time sammenlignet med bare 1-2 assays / time som kan testes ved hjelp av PPFCs, øker betydelig gjennomstrømning av minst 5 ganger. Videre PPFCs må settes sammen og vasket før hver gjenbruk, ytterligere sakker ytelse rate. I tillegg er den lett kontrollert strømning muliggjør hurtig utførelse av skjæravhengig eksperimenter, som deretter kan lett analyseres via egnet programvare.
Vi testet ved denne multi-brønn plate-system ved å analysere interaksjoner mellom HL-60 celler og EKB belegging av mikrofluidkanal. EKB er kjent for å uttrykke P-og E-sel under den inflammatoriske prosessen 5. Å gi egenkapitalbevis med en inflammatorisk stimulans, forbehandlet vi dem med TNF-α. Mens E-sel var oppregulert, P-sel ikke var i overensstemmelse med litteraturen som viser at humant EKB uttrykke E-sel, men ikke P-sel, som respons på TNF-α aktivering siden primate P-sel-promoteren mangler TNF -α responselementer, resulting i transcriptional induksjon av bare E-sel 20,21. Inflammatoriske tilstander ble deretter simulert på innsiden av kanalen ved inkubering av EC monolag med TNF-α, etterfulgt av perfusjon av HL-60-celler til å oppdage dens interaksjon med EF-overflaten. Mens HL-60 ikke samhandle med unactivated egenkapitalbevis, gjorde de viser en robust rullende respons på TNF-α-aktivert egenkapitalbevis (Figur 3C), korrelert med deres rapporterte svar i litteraturen 22. Ab blokkerer eksperimenter (Figur 4A) viste at E-sel, men ikke P-sel, blokking resulterte i en betydelig reduksjon i HL-60 rulle på aktivert egenkapitalbevis. Disse dataene viser direkte involvering av E-sel, og ikke P-sel, i formidling rulling av HL-60 på TNF-α-aktivert menneskelig egenkapitalbevis 20,21. Ab blokkerer eksperimenter omvendt viser E-sel-mediert rullende på aktivert egenkapitalbevis vs P-sel-mediert rullende på CHO-P, validerer gjennomførbarhet og relevans av Ab blocki videreng eksperimenter raskt utført i denne microfluidic system. Interessant nok er dette hemming av rullende ikke var fullstendig (ca. 70% reduksjon) som tyder på at andre overflatereseptorer, for eksempel VCAM-1, også delta i HL-60 rulle på aktivert EKB 27.. Track banen analyse videre avdekket et annet interessant fenomen - mens rulling av HL-60 på ublokkerte aktivert egenkapitalbevis var sammenhengende og robust, lavt antall celler som fortsatt rullet på E-sel blokkert aktivert egenkapitalbevis vises en fragmentert rullende bane på den blokkerte egenkapitalbevis ( Figur 4B). Dette fenomenet ble ikke observert i egenkapitalbevis inkuberes med P-sel blokkering eller isotype kontroll (data ikke vist). Dette tyder sterkt på at mens en rullende reaksjon er mulig via andre markører når EC E-sel er blokkert, avhengig dette rullende på svake, delvis HL-60-EC interaksjoner, støtter bare en løs, delvis rullende respons ved aktivert egenkapitalbevis 5,22 ,27-29. Dette støttes av dataene er vist i figur 4C 30-33, og forbedre gjennomstrømningen av MicroFluidics via multi-brønn plate system som presenteres her, ytterligere høydepunkter potensialet i denne teknologien for effektiv og presis analyse av viktige rullende egenskaper mot bedre terapeutiske anvendelser .
Denne studien fokuserer på undersøkelse av HL-60 celle rullende på protein underlag og cellemonolagene i henhold til fysiologisk relevant og presist kontrollert skjær flyt hjelpen multi-brønn-plate mikrofluidsystem. På samme måte kan andre celletyper og andre substrater / cellemonolagene lett brukes til å studere deres valseegenskaper. Enkel bruk og enkel analyse tillater en nøyaktig analyse av viktige rullende egenskaper og Ab blokkering eller aktivering med andre vekstfaktorer eller hemmere kan benyttes for å oppdage potensielle engasjement i molekylære markører ved rulle respons. Dette kan være spesielt nyttig til å studere stamcelle rullende og homing, som kan være konstruert for å forbedre stamcelle-basert terapi 34-36. Viktigere, kan flere vilkår testes med forbedret gjennomløp (5 til 10 ganger høyere sammenlignet med PPFCs), som tillater rask og effektiv undersøkelse av rullende egenskaper på grunn av platekonstruksjonen. Andre analyser er relevante for celle homing, for eksempel celle adhesjon, kjemotaksis og sjelevandring kan også studeres ved hjelp av dette systemet 1,10,13. Samlet sett fremstår dette microfluidic system som en kraftig teknikk for å studere celle rullende og should tjene som et nyttig verktøy for å hjelpe til i den kliniske oversettelse av eksogen cellebasert terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
CHO-P cellene var en slags gave fra Dr. Barbara Furie (Beth Israel Medical Center diakonale, Harvard Medical School). Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health tilskudd HL095722 til JMK Dette arbeidet ble også støttet delvis av en Movember-Prostate Cancer Foundation Challenge Award til JMK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics | ||
References
- Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
- Ankrum, J., Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).
- Karp, J. M., Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Ley, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J. Vis. Exp. (10), e1644 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C. Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation. Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).
- Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1. J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).
- Conant, C. G., et al. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).
- Larsen, G. R., et al. P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities. J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).
- Varki, A. Selectin ligands: will the real ones please stand up. J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).
- Bohnsack, J. F., Chang, J. Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation. Blood. 83, 543-552 (1994).
- Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).
- Moore, K. L., et al. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A.
- Yao, L., et al. Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates. Blood. 94, 3820-3828 (1999).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. , e1009 (2009).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W.
- Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
- Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).
- Varki, A.
- Ramos, C. L., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).
- Yago, T., et al. Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- Yago, T., et al. E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling. Blood. 116, 485-494 (2010).
- Simone, G., et al. Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system. Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition. Small. 8, 2886-2894 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations. Electrophoresis. , (2013).
- Simone, G., et al. A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics. Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).
- Sarkar, D., et al.
- Cheng, Z., et al. Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance. Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).
- Enoki, C., et al. Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).
