מותמרים החדרת טכנולוגיה מוקדמת לניטור התנהגות החרקים טיסה

Introduction

החדרת אלקטרודות, אפילו עם מערכות אלקטרוניות המצורפות לחרקים ליישומי הקלטת telemetric, כבר שיטה גדולה כדי להבין איך תפקוד מערכות עצביות במהלך הטיסה טבעית ^1. חיבור או השתלת מערכות מלאכותיות בחרקים הציבה אתגרים רבים מעורבים הפוטנציאל להפריע לטיסה הטבעית של החרקים. קובץ מצורף שטחי או החדרה כירורגית של פלטפורמות מלאכותיות על החרק הבוגר אינו מהימן בשל הסטה אפשרית של המכשירים הוכנסו שנגרמו על ידי כוחות אינרציה והלחץ-Induced גוף. באופן שטחי מצורף או אלקטרודות מוכנסות בניתוח הן גם נוטים להידחות על ידי החרקים כגוף זר. יתר על כן, ניתוח ההשתלה דורש את הסרת קשקשים וערימות סביב השלד החיצוני. שכבת הקוטיקולה העבה גם צריכה להיות חדרה לעצבוב כירורגית אשר יכול לגרום נזק לרקמות בטחונות, ובכך מפריעה לטיסה הטבעית של החרקים. כל tגורמי hese יכולים לעשות פעולת השתלה כירורגית או שטחית משימה מאתגרת ועדינה. על מנת להקל על החששות אלה מעורבים באופן חיצוני חיבור מערכות בקרה וחישה לחרקים, המתודולוגיה רומן מעורבת צמיחה מותמרים שיתואר במאמר זה.

הפיתוח מותמרים של חרקים holometabolic מתחיל עם הפיכתו של הזחל (או נימפה) למבוגרים עם שלב גלמי ביניים (איור 1). תהליך המטמורפוזה כולל תכנות מחדש של רקמות נרחבות הכוללים התנוונות ואחרי שיפוץ. השינוי הזה הופך זחל יבשתי למבוגרי חרקים מפגינים כמה התנהגויות מורכבות ^2,3.

ההישרדות של חרקים לאחר ניתוחי parabiotic קיצוניים הודגמה בי הניתוחים בוצעו בשלבים המוקדמים מותמרים ^4,5. בניתוחים אלה, קאוס histogenesis התפתחותייםפצעי ניתוח ed לתיקון במשכי זמן קצרים יותר. בעקבות תצפיות אלה, טכניקה חדשה פותחה בי השתלת אלקטרודות מוליך חשמלי בוצעה בשלבים המוקדמים יותר של צמיחה מותמרים (איור 1). זה מאפשר מצורף biomechanically מאובטח על החרקים ^6. ממשק מאוד אמין גם מאובטח עם העצבי של החרק ומערכות התוקפת ^7. טכניקה זו ידועה בשם "בתחילת גלגול החדרת הטכנולוגיה" (לפלוט) ^8.

לאחר הבנייה מחדש של מערכת הרקמה כולה, מבנים הוכנסו לגולם לצאת עם החרק הבוגר. קבוצות שרירים טיסה להפוך עד 65% מכלל מסת גוף ובית החזה, ובכך, מהווה מטרה נוחה יחסית להליך לפלוט ^9. במהלך פעימת האגף הבסיסי, השינויים במורפולוגיה של הטיסה הפעלת dorsolongitudinal (ד"ל) וdorsoventral (DV) שרירים לגרום articulat הכנףגיאומטריה יון לייצר עילוי ^10. לכן התיאום התפקודי של שרירי ד"ל וDV כבר נושא למחקר פעיל בנוירופיזיולוגיה טיסה. חרקים קשירה בסביבה חזותית אלקטרוני מתוכנת היו השיטה הנפוצה ביותר ללימוד נוירופיזיולוגיה של התנהגויות מורכבות locomotory ^11,12. זירות גליליות מורכבות מפנלי דיודה פולטות אור כבר משמשות עבור סביבות מציאות מדומה אלה, שבו חרקים מעופפים הם קשורים באמצע והתנועה היא מדומה על ידי דינמי מעדכן את התצוגה ויזואלית פנורמי שמסביב. במקרה של חרקים קטנים יותר, כגון זבוב פירות דרוזופילה, קשירה מושגת על ידי הצמדת סיכת מתכת לבית החזה הגבי של החרק ולמקם את הסיכה מתחת למגנט קבוע ^13,14. שיטה זו מאפשרת רק כימות של תגובות מוטוריות באמצעות תצפיות חזותיות עם מצלמות במהירות גבוהה ללא כל ניתוח אלקטרו. יתר על כן, ספיד זהOD כבר לא יעיל להשעות את הגוף הגדול יותר וכבד יותר של סקסטה Manduca. כדי לפתור בעיה זו, אנו נהנינו ממסגרות מגנטי מרחף שבו משקל קל מסגרות עם המגנטים מצורפים לתחתית שלהם לרחף באמצעות כוחות אלקטרומגנטיים. בשילוב עם מגברים עצביים זמינים מסחרי ומערכי LED, זה מספק פלטפורמה לבקרת פלט הטיסה מנוע ולהקליט אלקטרופיזיולוגיה הקשורה של סקסטה Manduca.

Protocol

הערה: המקור של החומרים וחומרים כימיים הדרושים כדי לעקוב אחר הפרוטוקול מסופק בטבלה "ריאגנטים" להלן.

1. הכנת מעגלים מודפסים לוחות (PCB) לחיבור ההקלטה אלקטרודה

הערה: על מנת לספק הליך ניסיוני מעשי, אלקטרודות חוט מולחמות למעגל מודפס להכניס אלקטרודות אלה לתוך מחבר FFC (כבל שטוח גמיש).

1. חותכים סנטימטר 0.5x5 ² חתיכת רבד נחושת בלבוש.
2. באמצעות סמן קצה קנס, לצייר שלוש כריות 0.1x5cm ² מלבן כתחריט דפוסי מסכה.
3. לחרוט רבד נחשף באמצעות etchant PCB בתוך אזור מאוורר או מנדף. מכסה כ 1 סנטימטר באורך של נתק רבד עם קלטת הלא מגיב. מלא כוס סיימה עם של etchant PCB וקלטת מגזרת רבד הנחושת לחלק הפנימי של הכוס סיימה עם נייר דבק לפחות 100 מיליליטר. מחצית cutou רבד הנחושתלא צריך להיות שקוע בetchant PCB.
4. מניחים את הכוס על במה מסתובב ל20 דקות.
5. הסר את נתק מetchant ולמקם אותו בכוס מלאה במים למשך 10 דקות.
6. שימוש בנייר טישו, להחיל איזופרופיל אלכוהול והסר את הסימונים לחשוף את רפידות נחושת שאינן חרוטות.
7. חותכים את לוח המעגל המודפס לריבועים קטנים יותר שאורכו כ 1 סנטימטר.
8. חותך שתי חתיכות של תיל פלדה מצופה, annealed, נירוסטה (0.11 "מצופים, 0.008" חשופות) באמצעות סכין חד לאורכים של 3 סנטימטר כל אחד. חתיכות של חוט נירוסטה אלה הן אלקטרודות הפעילה שתוכנסנה לתוך בית החזה של החרק.
9. באמצעות סכין, הסר 4-5 מ"מ של ציפוי פלסטיק מכל קצה של כל חוט. שימוש במיקרוסקופ מומלץ.
10. לחתוך חתיכת 0.7 סנטימטר אחד של חוט נירוסטה מבודד כדי ליצור סיומת טיפ לאלקטרודה הקרקע. בעדינות להסיר את הציפוי בסכין או להמס אותו עם החום של ir הלחמהבמבוצע כמו בשלב 1.9.
11. להארקה, לחתוך חתיכת חוט גמיש (ליץ או משרן) אחת לאורכו של 4.5 סנטימטר.
12. הלחם את פיסת הנירוסטה מוכנה בשלב 1.10 לחוט הארקה מוכן בשלב 1.11 0.7 סנטימטר. טיפ נירוסטה חשופה צריך להיות בסופו של חיבור הארקה.
13. תדביק את לוח האלקטרודה מוכן היטב לסביבת עבודת ההלחמה באמצעות קלטת הלא מגיבה. השתמש בסרט כדי להסוות את כל אבל 1-2 מ"מ של הרפידות על הלוח שבו אלקטרודות תהיה מולחמים. סוף זה רעול פנים, ללא הלחמה של הרפידות יוכנס לתוך מחבר FFC המתואר בשלב 4.1.
14. יישר שלושה חוטי האלקטרודה כך שקצה אחד של כל אחד יכול להיות מולחם לרפידות המתאימות על לוח האלקטרודה. החל שטף נירוסטה על פני רפידות אלקטרודה להלחמה קלה יותר.
15. הלחמה כל אחת מהאלקטרודות נחשפה על הרפידות.
16. לטבול את האלקטרודות באצטון ואלכוהול איזופרופיל עבור 10 דקותכל אחד כדי לנקות את שאריות ההלחמה. שימוש באמבטיה קולי משפרת את ביצועי הניקוי.

2. החדרה כירורגית לManduca סקסטה גלמים

הערה: החרקים יהיו פעילים ביותר במהלך המעברים בין היום ולילה. לכן, מחזור היום / לילה מלאכותי יש לקבוע בתוך חדר חרקים באמצעות טיימרים לשקע אוטומטיים. אלה צריכים להיות מוגדרים כדי לדמות כהים 7 שעות ו17 מחזור שעות אור.

1. לבחון את גלמי סקסטה Manduca יומי כדי לקבוע זמן כניסה מתאים. הגלמים מוכנים להכנסה כ יום אחד אחרי כנפי תערוכת כתמים כהים.
2. כדי להרדים את הגלמים, למקם אותם במקרר (4C) במשך כ 6 שעות.
3. הכן את סביבת העבודה של ההכנסה. סביבת העבודה צריכה לכלול אלכוהול איזופרופיל, פינצטה חדה, להבים, ומחט מזרק G 30. כאופציה, דבק cyanoacrylate ניתן להשתמש כדי לשפר את קיבעון האלקטרודה.
4. לעקר את המחט, פינצטה, ואת האלקטרודות על ידי הטבילה באו לנגב עם אלכוהול איזופרופיל.
5. הסר את הגולם מהמקרר ולהעביר אותו לסביבת העבודה.
6. לקבוע את המיקום בבית החזה שמתאים לקבוצת השרירים של עניין. ההתמקדות של העבודה בדוגמא זו היא שרירי dorsoventral אחראים על תנועת upstroke הכנף.
7. באמצעות סכין חד, בעדינות לגרד את מלבן ² סנטימטר 1x1 דרך שכבת exocutical. באמצעות פינצטה, להתקלף לאט יצירות אלה.
8. (אופציונאלי) השתמש בשואב אבק כדי להסיר שיער כנף מהאזור החשוף של בית החזה.
9. לאט לאט להכניס את המחט על 5 מ"מ לתוך mesothorax בי הכנפיים לצרף לבית החזה כדי ליצור שתי נקודות כניסה מיקוד קבוצת השרירים.
10. בעזרת פינצטה, להדריך את שתי אלקטרודות ההקלטה לשתי נקודות הכניסה.
11. (אופציונאלי) כדי לשפר את העמידות מכאנית, לנקות את השיער סביב אלקטרודותונדיבות להחיל דבק cyanoacrylate סביב כל נקודת כניסה בבית החזה עם המוליך חוט.
12. הכן את כלוב להופעה עם חומר מתאים (גולמי ומחוספס) המכסה את הקירות ותקרה, כך שהחרקים יכולים לטפס על הופעתה. ניתן להשתמש בקופסות קרטון מחוררים או נייר אריזה.
13. הכן את קיבעון מקל נוקשה עם אורך כ -6 ס"מ וקוטר 2 מ"מ. בוחשי פלסטיק, מקלון צמר גפן או חוטי מתכת יכולים לשמש לצעד זה.
14. מחליק בזהירות את המקל הזה דרך החור מתחת לחוטם הבולט.
15. תקן את שני הצדדים של המקל על פני השטח הכלוב כך שהגולם לא יכול להתגלגל. מקם את הגולם בתוך הכלוב כזה שmesothorax הוא פונה כלפי מעלה. תנועה נרחבת עלולה לגרום נזק לאלקטרודה, אובדן hemolymph, או להפוך את ההכנסה חסרת תועלת.

3. החדרת אלקטרודה הקרקע לManduca סקסטה

הערה: הקרקע (עייןence) אלקטרודה צריכה להיות מוכנסת לתוך חלקי בטן או הדיסטלי של בית החזה כדי למנוע צימוד אות. הכנסה זו יכולה להיעשות גם בשלבים מאוחר יותר של התפתחות גלמים או לאחר החרקים עולה. החלון לאלקטרודה הקרקע צריך להיות מוכן בשלב גלמים עבור שני גלמים או החדרת אלקטרודה קרקע שלב בוגר.

1. לכניסת שלב גלמים: לאחר הקילוף של ציפורן mesothoracic סביב האלקטרודה הפעילה (ראה שלב 2.7), לגרד מלבן אחר דרך שכבת exocutical (סביב 0.5x0.5 ² סנטימטר) על בטן הגב קרוב לבית החזה באמצעות מזרק G 30 מחט. הכנס את האלקטרודה הקרקע לחלון זה באמצעות הטכניקה שתוארה בסעיף 2.
2. להחדרת אלקטרודה קרקע שלב בוגר: פעם החרקים התפתחה, למקם אותו במקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 6 עד 24 שעות כדי לשתק.
   הצעדים הנותרים הם זהים בשני גלמים והוספות שלב בוגר.
3. הכן את inser סביבת העבודה tion כולל אלכוהול איזופרופיל, פינצטה חדה, מחט מזרק G 30, דבק cyanoacrylate, חתיכת החוט עבור יישום של דבק, cauterizer תרמית (אופציונלי), ומקל שיניים שעווה (אופציונלי).
4. אתר נקודת כניסה כ 1-2 סנטימטר מאלקטרודות ההקלטה לאורך הבטן האחורית.
5. לאט לאט להכניס את המחט לנקב את הבטן ולספק אתר הכנסה.
6. באמצעות פינצטה להכניס בזהירות את האלקטרודה הקרקע לכניסה לאתר ולהפעיל לחץ עד שהוא 3-4 מ"מ עמוק. החזק את האלקטרודה במקום ומשתמש בחוט להחלה דבק סביב הכניסה לאתר.
7. (אופציונאלי) כדי לשפר את החוזק המכני, השתמש cauterizer התרמית ולאסוף חרוז קטן (2-3 מ"מ) של שעווה בקצה. הנח את הקצה הקרוב לכניסה לאתר וליישם חום כזה שהשעווה מקיפה את האלקטרודה ומחזיקה אותו במקומו.

4. הכנת דירקטוריון המתאם

ontent "> הערה:. נדרש לוח מתאם לחיבור לוח אלקטרודה לheadstage ההקלטה האלחוטית דרך מחבר FFC (שטוח כבל גמיש) לשם כך, לוח דומה ללוח אלקטרודה צריך להיות מוכן על ידי ביצוע צעדים 1.1-1.7 .

1. הלחמה מחבר FFC לקצה אחד של הלוח מוכן.
2. הלחמה שלושה 30 AWG (מידת חוט אמריקנית) לחבר את חוטים לשלוש כריות בצד השני.
3. הלחמה שלושה מחברי מיני לשלוש כריות על לוח המתאם לקריאת אוסצילוסקופ כפי שמתואר בשלב הבא.
4. הלחם את הקצה השני של שלושת חוטים אלה למחבר headstage.
5. מאבטח את לוח מעגל headstage בחלק העליון של מסגרת הריחוף.

5. Prerecording עם אוסצילוסקופ (אופציונאלי)

הערה: כדי להעריך את האמינות של אלקטרודות ולבחון את יחס האות לרעש, ניתן להשיג הקלטות אוסצילוסקופ קשורות לפני פריסת wirelמערכת הקלטת ESS. יש להשתמש במחברי חוט המיני על לוח המתאם עבור זה.

1. חבר אוסצילוסקופ למגבר הקלטה עצבי תאי. הגדר את הפרמטרים מגבר לתדר חתוכים גבוהים לעבור של 1 הרץ, תדר חתוכים נמוך לעבור 20 קילוהרץ, ורווח של 100.
2. חברו כל אחד ממחברי חוט מיני הנשיים על לוח המתאם לערוצי קלט המגבר.
3. הסר את החרקים עם לוח האלקטרודה המושתלת מהכלוב כאשר הוא במצב פעיל (בזמן זריחתה). מניחים פיסת נייר הטישו מתחת לחרקים לזה לנוח על לפני מדידות נלקחות.
4. בעזרת פינצטה, חלק את לוח אלקטרודה לתוך קולט FFC על לוח המתאם. שים לב לנקודת התחלת מתח שטוחה ונמוכה כאשר החרק נח והדור של electromyogram (EMG) קוצים כמו החרק מנפנף בכנפיו.
   הערה: עיין בסעיף 6: טיסה חרקים התבוננות עם מערכת ההקלטה האלחוטית עבור representative תוצאות אוסצילוסקופ.
5. כוון את הפרמטרים הצפייה של האוסילוסקופ בהתאם לצורך. ללכוד את הנתונים על אוסצילוסקופ ולשמור את הנתונים.

6. התבוננות חרקים טיסה עם מערכת ההקלטה האלחוטית

הערה: פלטפורמת ריחוף האלקטרומגנטית יכולה להיות בנויה להקלטה אלחוטית של אותות EMG במהלך הטיסה סקסטה Manduca קשורה. פלטפורמת הריחוף מורכבת מסגרת שנועדה לאזן את מנגנון קשירה. הריחוף מאפשר המסגרת, ולכן החרקים, לסבסב במהלך בדיקה ללא המגבלה של חוטי קשירה. המסגרת יכולה להיות מהיר אב טיפוס באמצעות דוגמנות בתצהיר התמזגו (FDM) מכונה. מגנט צריך להיות מחובר לחלק התחתון של מסגרת זו כדי לרחף על ידי סדרה של מגנטים בפלטפורמת הבסיס. החרקים מחוברים למחבר FFC המושעה מהחלק העליון של המסגרת. פלטפורמה מרחפת זה ממוקמת בתוך זירת LED שנבנתה מנצלים60 פנלים גרם מורכבים ממערך של נוריות בודדות 5x7. מערכת זו מבוססת על שיטות שהוקמו לפיתוח סביבה לגירוי חזותי של זבובי פירות ^{15, 16, 17.} הזירה נשלטת על ידי סימולציה המאפשר מיקרו של שניהם עם כיוון השעון ונגד כיוון שעון סיבוב, כמו גם שליטה על מהירות הסיבוב.

1. הגדר את מערכת ההקלטה האלחוטית על ידי חיבור headstage למחבר לוח המתאם על פלטפורמת הריחוף.
2. הסר את החרקים מהכלוב כאשר הוא במצב פעיל רצוי בזמן זריחתה.
3. בעזרת פינצטה, הכנס בזהירות את לוח אלקטרודה לתוך קולט FFC על מסגרת המרחף כזה שהחרקים מושעה בתקיפות בתוך ההתקנה.
4. הנח את השרביט המגנטי ליד המתג המגנטי על headstage כדי להפעיל העברת נתונים אלחוטית. אור כחול יבוא על המציין כי headstage היא פעילה.
5. כבה את האורות במקום לחושך מוחלט. מנורה אדומה יכולה לשמש להוספת תאורה לחדר. פתח את תוכנת איסוף נתוני טלמטריה במחשב ובחר את קובץ תצורה שנטען מראש המתאים אם סיפק. התחל רכישת נתונים להתחיל אותות צפייה.
6. בחר את ממשק המשתמש הרלוונטי לתצפית של אותות EMG על מערכת ההקלטה האלחוטית כדי להבטיח פעולת חיבור ואלקטרודה אלחוטית אמינה.
7. הפעל את כל רכיבי LED ארנה: אספקה ​​מוסדרת DC כוח ומייקרו. מיקרו ניתן להתאים את הסיבובים לדקה של אור הדפוס המחזורי ויכול גם לשלוט על הכיוון של הסיבוב קל.
8. לאט לאט לאזן את פלטפורמת הריחוף בתוך הזירה. יישר את המסגרת מעל המרכז של בסיס הריחוף בזהירות, אחרת המסגרת תהיה משך במהירות לקרקע ואולי פוצע החרקים.
9. ליזום את מערכת הקלטת וידאו.
10. בחר בכרטיסייה ההקלטה הרלוונטית של התוכנהממשק. לייעד את זמן הקלטה ושמור קובץ יעד. בחר את הגדרות הפלט המתאימות כדי לשמור את הנתונים. לחץ על הכפתור התחל ליזום פגישת הקלטה בתוך התוכנה. זה יהיה לשמור את קובץ הנתונים שיכולים להיות מיובא לתוך סביבות מחשוב מספריות.
11. שים לב כחרק עף בכיוון שמתכתב עם התנועה של הנוריות. להפוך את הכיוון של הנוריות ולוודא כי החרקים הופכים כיוון. לבצע את זה כמה פעמים שרצויות.

Representative Results

סכמטי של ההליך לפלוט הכולל מוצג באיור 1, המציג את השלבים העיקריים במחזור מותמרים של hawkmoth וצעדי החדרת אלקטרודה המתאימים. החדרת אלקטרודה צריכה להתבצע בשלב מאוחר גלמי 4 עד 7 ימים לפני eclosion. זה מאפשר לסיבי השריר לפתח סביב אלקטרודות ולאבטח את השתל בחרקים.

התוצאה האופיינית של הכנסה השלימה מאוחר גלמי שלב שבו שתי אלקטרודות הפעילים ואלקטרודות הקרקע היו מוכנסות מוצגת באיור 2.

התוצאה האופיינית של החדרת שלב הבוגר הושלמה בו שתי אלקטרודות פעילים והאלקטרודה הקרקע היו מוכנסות מוצגת באיור 3.

זירת LED המשמשת כדי לעודד הפיכת במהלך הטיסה לסקסטה Manduca מוצגת באיור 4. מיקרו wכמתוכן כדי לאפשר שליטה על מהירות הסיבוב של התבנית האנכית מערך LED. מהירות זוויתית של דפוס LED נקבעה ל7.3 מעלות לשנייה. פלטפורמת הריחוף המגנטי הוצבה במרכז זירת LED לאפשר לחרקים להפוך באופן חופשי בתגובה למערך LED.

איור 5 מראה את אותות פוטנציאל השרירים נרכשו משרירי dorsoventral עם אוסצילוסקופ לפני ואחרי נפנוף כנפיים. האות עברה עיבוד עם הגברה 100 פעמים וגבוהות לעבור סינון של 1 הרץ ומסנן מעביר נמוך של 20 קילוהרץ. בתקופה שקטה, לא פוטנציאלי שרירים הם נצפו. פוטנציאלי השריר במהלך נפנוף כנף להתרחש בכ 15 Hz-20Hz.

איור 6 מציג את אות פוטנציאל השריר שנרכשה עם המכשור האלחוטי לפני ואחרי נפנוף כנפיים. בתקופה שקטה, לא פוטנציאלי שרירים הם נצפו. פוטנציאלי השרירים during נפנוף כנף להתרחש בכ 20-15Hz הרץ.

איור 1. אלבהד נוהל. תרשים סכמטי של ההליך לפלוט בוצע על סקסטה Manduca, כפי שתואר בפרוטוקול.

איור 2. פופה קלטי. תצלום של גולם שלב מאוחר מייד לאחר אלקטרודות ההקלטה הוכנסו באמצעות פולט.

איור 3. צמיחת עש. תצלום של עש בוגר עם הקלטה מושתל אלקטרודותeclosion חרי.

איור 4. הגדרת הקלטה. פלטפורמת הריחוף המגנטית וזירת LED המשמשים להקלטת אותות EMG משרירי הטיסה סקסטה Manduca. הנה סקסטה Manduca מבצעת תמרון סבסב בתגובה לדפוס LE המסתובב.

איור 5. אוסצילוסקופ EMG. הקלטת 2.5 שניות EMG של שריר dorsoventral באמצעות מגבר ואוסצילוסקופ.

איור 6. Wireless EMG. 1.9הקלטת שניות EMG של שריר dorsoventral באמצעות יחידת הקלטת headstage האלחוטית ותוכנת רכישת נתונים.

Discussion

ישנם מספר צעדים קריטיים במהלך ההחדרה כירורגית של אלקטרודות ההקלטה המשפיעות על היכולת להקליט נתונים בשלבים מאוחר יותר של הפרוטוקול. אלקטרודות ההקלטה צריכה להיות מוכנסות לתוך יום הגולם אחד אחרי מציג כתמי כנף בצד הגב שלה. אם ההכנסה מבוצעת שניים או יותר ימים אחרי כל הזמן הזה, הרקמה של החרק לא תהיה מספיק זמן כדי לפתח סביבו ולייצב את האלקטרודות מוכנסות. זה יכול להוביל לתנועה של אלקטרודות מושתלות והקלטות לא אמינות בשלב הבוגר.

חשוב לא להכניס את האלקטרודות ההקלטה לתוך שרירי טיסה גלמים בעומק של יותר מ -5 מ"מ. אחרת, hemolymph תצא מנקודתי הכניסה ולגרום להתפתחות של שרירי טיסה חלשים יותר. אם hemolymph אין לצוץ, להפסיק את ההליך ולאפשר שעות גולם 24 להתאושש לפני שתנסו להכניס את האלקטרודות שוב. אתר ההכנסה יש לנקות הoroughly של כל שיער הכנף לפני אלקטרודות מוכנסות בגולם. זה מונע שיער מלהיכנס לחורי הכניסה ומפריע לממשק רקמת האלקטרודה.

כדי להבטיח את בריאות אגף אופטימלית בעש הבוגר, אתר ההכנסה צריך להיות מחדש ניקה שיער אגף היום לפני eclosion באמצעות פינצטה. בנוסף, מומלץ להשתמש בפינצטה כדי לשחרר את הקצוות של החלון לציפורן שהיה חרות עם מחט המזרק כדי לסייע eclosion המתרחש ביום שלמחרת. אם כל דבק או hemolymph התייבש ליד הקצוות של החלון לציפורן, העש לא תוכל לנפח את כנפיו לאחר eclosion והדגימה זו לא תהיה שימושית עבור ניסויים.

אמנם ניתנות פעמים הכניסה בימים אלה עשויים מעט להשתנות כציר הזמן של ההתפתחות מותמרים הוא פונקציה של טמפרטורות הגידול לpoikilotherms. הימים הניתנים הם לחרקים גודלו בRT. אם 25 ° סטנדרטי; משמשת חממת insectary C, הפיתוח יהיה כ 10-20% מהר יותר ובזמני הכניסה צריכים להיות בהתאם.

מגבלה של מחקר זה תהיה האינרציה הסיבובית הציגה להתקנה על ידי מסגרת הריחוף המהירה ABS אב הטיפוס מפלסטיק. המסה של המסגרת יכולה להיות עד 200 גרם בעוד המסה של עש היא בערך 4 גרם. היתרון של שימוש במסגרת לרחף אלקטרומגנטית הוא אובדן קשר חיכוך בין המסגרת ומבנה תומך. עם זאת, השימוש במסגרת כבדה יחסית גורם לחרקים למבזבזים יותר אנרגיה כדי להשלים תמרוני סבסב בתגובה לדפוס LED המסתובב. שינוי למסגרת הקשירה שימשה במחקר זה יכול להיות שימוש בחומר פחות צפוף ו / או בניית מסגרת דקה יותר כדי להפחית את עומס האינרציה.

השינויים התפתחותיים במהלך המטמורפוזה להביא יכולות חדשות לשיטות הנדסה עצביות כדי ללמוד כיצד חרקים לעוף.זוהי תצפית מדהימה שהחדרת אלקטרודה בתוצאות שלבי גלמים בתגובות רקמות להקל ביחס להוספות שלב בוגר. הוספות לכן, פולטים מבוססים להבטיח התקשרות מכאנית של מערכות סינתטיות באו בחרקים, תוך מימוש ממשק התוקפת צפוי עם השפעה קצר טווח מינימאלי על התנהגות locomotory חרקים. במהלך שני העשורים האחרונים, robotists עובד על כלי רכב בלתי מאויש באוויר בקנה מידה קטנה מאוד כבר בהשראת הטיסה חרקים. מעבר המאפשר טכניקת אלקטרו רומן, הליך לפלוט גם מאפשר לחרקי מכונת ממשקים (תעש) שעשויה לספק גישה למהנדסים עצביים לתאים חשמליים להתרגש מהחרקים לשלוט בפיזיולוגיה החושית והתנהגותי שלה ^8. זו יש פוטנציאל "biobotically" לאלף ולשלוט בתנועת חרקים. לכן, המתודולוגיה הספציפית שהוצגה במאמר זה היא לא רק שימושית ללימוד הטיסה החרקים, אלא גם עבורלביית את החרקים מעופפים כסנטימטר בקנה מידה היברידית biobots ^18. יישום של פלטפורמה כזו היברידית הוא להמיר חרקים לתוך מערכות חישה סביבתית ניידת. בעלי חיים עובדים אלה יכולים באופן פוטנציאלי לסייע לבני אדם בפיקוח על המערכות האקולוגיות משותף שיתוף על ידי איסוף ואחסון של מידע סביבתי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated stainless steel wire	A-M Systems	791900	0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed
Flexible electrode wire			Litz or inductor wire can be used.
Surface-mount FFC connector	Hirose Connector	FH28E-20S-0.5SH(05)
Tweezers	Grobet USA		Clean with 70% alcohol before use on the insect.
Kim-Wipes	Kimberly-Clark Worldwide	34155	Any size delicate-wipe tissues can be used.
Teflon tape			5 mm width Teflon tape.
Hypodermic Needle	Becton Dickinson & Co.	30511	20-30 G hypodermic needle can be used. Video showed 30 G.
Rigid fixation stick			Variety of materials can be used (e.g., coffee stirrers)
Insect emergence cage			Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.
Thermal cauterizer	Advanced Meditech International	CH-HI CT2103 (tip)	Optional equipment used for application of dental wax.
Dental wax	Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma		Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.
Magnetic levitation platform			Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping.