Tidig Metamorf Inser Teknik för Insect Flight beteendeövervakning

Introduction

Infoga elektroder, även med bifogade elektroniska system för insekter för telemetriska inspelning applikationer, har varit en viktig metod för att förstå hur neurala systemen fungerar under naturlig flyg ^1. Fästa eller implantera artificiella system i insekter har ställt många utmaningar som innebär potential att störa den naturliga flygningen av insekten. Ytlig kvarstad eller kirurgisk insättning av konstgjorda plattformar på den vuxna insekten är otillförlitlig på grund av eventuell förskjutning av de insatta enheter som orsakas av kropps-inducerad tröghets och stresskrafter. Ytligt fäst eller inopererad elektroder är också benägna att avvisas av insekterna som en främmande kropp. Vidare kräver implantation driften avlägsnandet av skalor och högar runt exoskelett. Det tjocka nagelband lagret måste också penetreras för kirurgiska innervations som kan orsaka säkerheter vävnadsskada och därmed störa den naturliga flygning av insekten. Alla tessa faktorer kan göra en kirurgisk eller ytlig implantation drift en utmanande och grannlaga uppgift. För att mildra dessa farhågor som deltar i externt fästa kontroll-och sensorsystem för insekterna, kommer en ny metod som innebär metamorf tillväxt beskrivs i den här artikeln.

Den metamorphic utveckla holometabolic insekter börjar med omvandlingen av larven (eller nymf) till en vuxen med en intermediär puppstadium (Figur 1). Den metamorfos process innebär en omfattande vävnads omprogrammering inklusive degeneration följt av ombyggnad. Denna omvandling förvandlar en marksänd larv till vuxen insekt visar flera komplexa beteenden ^2,3.

Överlevnaden av insekter efter extrema parabiotic operationer har visats där operationer utfördes under de tidiga metamorfa stadier ^4,5. I dessa operationer, de utvecklings histogenes caused kirurgiska sår som ska repareras i kortare löptider. Efter dessa observationer, har en ny teknik som utvecklats där implantation av elektriskt ledande elektroder utfördes under tidigare stadier av metamorf tillväxt (Figur 1). Detta möjliggör ett biomekaniskt säker fastsättning på insekten ^6. En mycket tillförlitlig gränssnittet är också säkrad med insektens neurala och neuromuskulära system ^7. Denna teknik är känd som "tidig metamorfos Insertion Technology" (EMIT) ^8.

Efter ombyggnaden av hela vävnadssystem, strukturer insatta i puppan fram med den vuxna insekten. Flygmuskelgrupper fyll upp till 65% av den totala thoraxkroppsmassa, och således är ett relativt bekvämt mål för EMIT procedur ^9. Under grundvingslag, förändringar i morfologi flygningen driver dorsolongitudinal (dl) och dorsoventral (dv) muskler orsakar vingen articulation geometri att generera lyft ^10. Därför den funktionella samordning av DL och dv muskler har varit en aktiv forskningsområde inom flygneurofysiologi. Tethering insekter i elektroniskt programmerade visuella miljöer har varit den vanligaste metoden för att studera neurofysiologi av komplexa motoriskt beteende ^11,12. Cylindriska arenor består av lysdiod paneler har använts för dessa virtuella-reality-miljöer, där flygande insekter är tjudrade i mitten och den rörelse simuleras genom att dynamiskt uppdatera omgivande panorama visuell display. I fallet med små insekter, exempelvis fruktflugan Drosophila, är tjudra uppnås genom att fästa ett metallstift på den dorsala torax av insekten och placera stiftet enligt en permanentmagnet ^13,14. Denna metod tillåter endast kvantifiering av motorsvar genom visuella observationer med höghastighetskameror utan elektrofysiologiska analyser. Dessutom detta method har varit ineffektivt att avbryta större och tyngre kropp Manduca sexta. För att lösa detta problem, vi dragit nytta av magnetiskt svävande ramar där låg vikt ramar med magneter kopplade till deras botten är att sväva genom elektromagnetiska krafter. I kombination med kommersiellt tillgängliga neurala förstärkare och LED-arrayer, ger detta en plattform för att styra flyg-motoreffekt och registrera relaterade elektrofysiologi i Manduca sexta.

Protocol

OBS: Källan till de material och reagens som krävs för att följa protokollet finns i "Reagenser" tabell nedan.

1. Förbereda kretskort (PCB) för inspelning elektrod Connection

OBS: För att kunna erbjuda en praktisk experimentell procedur, är trådelektroder lödda till ett kretskort för att infoga dessa elektroder i en FFC (flexibel flatkabel)-kontakt.

1. Skär en 0.5x5 cm ² bit kopparklädda laminat.
2. Med hjälp av en fin spets markör, rita tre 0.1x5cm ² rektangulära kuddar som etsning maskmönster.
3. Etsa exponerad laminatet med hjälp av en PCB etsningsmedel i ett ventilerat utrymme eller dragskåp. Täck ca 1 cm av laminat utskärning längd med icke-reaktivt band. Fyll en graderad bägare med åtminstone 100 ml av PCB etsmedel och tejp kopparlaminat stansa till insidan av den graderade bägare med scotch tape. Hälften av kopparlaminat cutout ska vara nedsänkt i PCB etsningsmedel.
4. Placera bägaren på en roterande plattform i 20 min.
5. Avlägsna utskärningen ur etsmedlet och placera det i en bägare fylld med vatten i 10 min.
6. Med hjälp av ett silkespapper, tillämpa isopropylalkohol och ta bort markeringarna för att avslöja de icke etsade kopparpads.
7. Skär det tryckta kretskortet i mindre kvadrater ungefär 1 cm lång.
8. Klipp två bitar av tråd belagd, glödgat, rostfritt stål (0,11 "belagda, 0.008" nakna) med hjälp av en vass kniv till längder på 3 cm vardera. Dessa bitar av tråd av rostfritt stål är de aktiva elektroderna som kommer att sättas in i bröstkorgen av insekten.
9. Med hjälp av en kniv, avlägsna 4-5 mm av plastbeläggningen från varje ände av varje tråd. Användning av ett mikroskop rekommenderas.
10. Skär en 0,7 cm bit av elektrisk tråd av rostfritt stål för att skapa ett tips förlängning för jordelektrod. Ta försiktigt bort beläggningen med ett blad eller smälta det med värmen i en lödning irpå så utförs i steg 1,9.
11. För jordanslutning, skär en bit av flexibla (Litz eller induktor) ledningen till en längd av 4,5 cm.
12. Löd den 0,7 cm bit av rostfritt stål framställd i steg 1,10 till jordanslutningskabeln beredd i steg 1.11. En utsatt spets av rostfritt stål bör vara i slutet av jordanslutning.
13. Tape det beredda elektroden bräda stadigt mot lödning arbetsyta med användning av ett icke-reaktivt band. Använd tejp för att dölja alla utom 1-2 mm av kuddarna på tavlan där elektroderna ska lödas. Denna maskerat, löd-fria änden av dynorna kommer att införas i den FFC-kontakten beskrivs i steg 4.1.
14. Rikta in de tre elektrodtrådarna, så att en ände av varje kan lödas till motsvarande dynor på elektrodkortet. Applicera rostfritt stål flux över elektroderna för enklare lödning.
15. Löd vardera av de exponerade elektroderna på elektroderna.
16. Doppa ned elektroderna i aceton och isopropylalkohol under 10 minvarje rengöra lödstift rester. Användning av ett ultraljudsbad förbättrar rengöringseffekten.

2. Kirurgisk Insättning till Manduca Sexta Puppor

OBS: Insekterna kommer att vara mest aktiv under övergångarna mellan dag och natt. Därför bör en konstgjord dag / natt cykel inrättas inom en insekt kammare med hjälp av automatisk utlopps timers. Dessa bör vara inställd för att simulera en 7 h mörker och 17 timmars ljus-cykel.

1. Undersök Manduca sexta puppor varje dag för att bestämma en lämplig inför tid. Det puppor är redo för insättning ungefär en dag efter vingarna uppvisar mörka fläckar.
2. Att söva puppor, placera dem i kylskåp (4C) för ca 6 timmar.
3. Förbered insättnings arbetsyta. Arbetsytan bör innefatta isopropylalkohol, vassa pincett, blad, och en 30 G injektionsnål. Som tillval kan cyanoakrylatlim användas för att öka elektrodfixering.
4. Sterilisera nålen, pincett, och elektroderna genom att doppa dem i eller avtorkning med isopropylalkohol.
5. Ta puppan ur kylskåpet och överföra den till arbetsytan.
6. Bestäm platsen på thorax som motsvarar den muskelgrupp av intresse. Fokus för arbetet i detta exempel är de dorsoventral muskler som svarar för ving upstroke rörelse.
7. Med hjälp av en vass kniv, försiktigt skrapa en 1x1 cm ² rektangel genom exocutical lagret. Med hjälp av pincett, sakta dra av dessa bitar.
8. (Valfritt) Använd ett vakuum för att avlägsna ving hår från den exponerade delen av bröstkorgen.
9. Långsamt in nålen ca 5 mm i mesothoraxen där vingarna fäster på bröstkorgen för att skapa två inmatningspunkter med inriktning på muskelgrupp.
10. Med hjälp av en pincett, vägleda de två registreringselektroderna i de två inmatningspunkterna.
11. (Valfritt) För att öka den mekaniska hållbarheten, rengör håret runt elektrodoch generöst tillämpa cyanoakrylatlim runt varje insättningspunkten på bröstkorgen med en tråd applikator.
12. Förbered en bur för uppkomst med rätt material (grov och texturerade) som täcker väggar och tak så att insekten kan klättra på uppkomst. Perforerade kartong eller förpackning papper kan användas.
13. Förbered en styv fixering pinne med ca 6 cm lång och 2 mm i diameter. Plast omrörare, en bomullspinne eller metalltrådar kan användas för detta steg.
14. Skjut försiktigt denna pinne genom hålet under den utskjutande snabel.
15. Fix båda sidor av käpp på buren ytan så att puppan inte kan rulla runt. Placera puppa insidan av buren, så att mesothoraxen är vänd uppåt. Omfattande rörelse kan orsaka skada på elektroden, förlust av hemolymfa eller göra insättningen värdelös.

3. Sätta jordelektroden i Manduca Sexta

OBS: Marken (seence) elektrod bör införas i buken eller distala delarna av bröstkorgen för att undvika signalkoppling. Denna insättning kan göras antingen under de senare stadierna av PUPP utveckling eller efter insekten framträder. Fönstret för jordelektroden måste förberedas i puppstadium för antingen en pupal eller vuxenstadiet jordelektrod insättning.

1. För puppstadium insättning: Efter skalning av mesothoracic nagelband runt den aktiva elektroden (se steg 2.7), skrapa en rektangel genom exocutical lagret (cirka 0.5x0.5 cm ²⁾ på rygg buken nära bröstkorgen genom att använda 30 G injektion nålen. Sätt i marken elektroden i det här fönstret genom att använda den teknik som beskrivs i avsnitt 2.
2. För vuxna stadium jordelektrod insättning: när insekten har uppstått, placera den i kylskåp vid 4 ° C under 6 till 24 timmar för att immobilisera.
   De återstående stegen är desamma för både pupal och vuxenscen infogningar.
3. Förbered att man för in tion arbetsyta inklusive isopropylalkohol, vassa pincett, en 30 G injektionsnål, cyanoakrylatlim, en bit tråd för applicering av lim, en termisk cauterizer (tillval), och en tand vax pinne (tillval).
4. Leta upp en insättningspunkt ca 1-2 cm från registreringselektroderna längs den bakre delen av magen.
5. Långsamt in nålen för att punktera buken och ger en insticksstället.
6. Med hjälp av en pincett försiktigt in jordelektrod i insättningsstället och pressa tills den är 3-4 mm djup. Håll elektroden på plats och använder en tråd för att applicera lim runt insättningsstället.
7. (Valfritt) För att öka den mekaniska hållfastheten, använd den termiska cauterizer och samla en liten (2-3 mm) sträng av vax i spetsen. Placera spetsen nära insticksstället och värm så att vaxet omger elektroden och håller den stadigt på plats.

4. Beredning av Adapter Board

ontent "> OBS:. är en adapterkortet krävs för att ansluta elektroden kortet till den trådlösa inspelningshuvudsteg genom en FFC (Flat Flexible Cable)-kontakt För detta, en styrelse som liknar elektroden kortet måste förberedas genom att följa steg från 1,1 till 1,7 .

1. Löd en FFC-kontakt till en ände av den beredda ombord.
2. Löd tre 30 AWG (American Wire Gauge) ansluta kablarna till tre kuddar på den andra änden.
3. Löd tre minikontakterna till tre kuddar på adapterkortet oscilloskop-avläsningar såsom beskrivs i nästa steg.
4. Löd den andra änden av dessa tre kablar till huvudsteg kontakt.
5. Fäst huvudsteg kretskort ovanpå levitation ramen.

5. Förinspelning med oscilloskop (tillval)

OBS: För att kunna bedöma tillförlitligheten av elektroderna och observera signal-brus-förhållande, uppbundna oscilloskop inspelningar kan erhållas innan du distribuerar det wireless registreringssystem. Mini tråd kontakterna på adapterkortet ska användas för detta.

1. Anslut oscilloskopet till ett extracellulärt neural inspelningsförstärkare. Ställ in förstärkarens parametrar till en hög-pass cut-off frekvens på 1 Hz, ett lågpass-cut-off-frekvens på 20 kHz, och en förstärkning på 100.
2. Anslut var och en av de kvinnliga mini tråd kontakterna på adapterkortet till förstärkaren ingångskanaler.
3. Avlägsna insekt med den implanterade elektroden bräda från buren när den är i ett aktivt tillstånd (under dess gryning tid). Placera en bit silkespapper under insekten för den att vila på innan mätningar utförs.
4. Med hjälp av en pincett, skjut elektroden kortet i FFC-receptorn på adapterkortet. Observera en platt och låg spänning utgångsvärdet då insekten vilar och generering av elektromyogram (EMG) spikar som insekten flaxar med sina vingar.
   OBS: Se avsnitt 6: Beaktande insekt flygning med den trådlösa Recording System för representative oscilloskop resultat.
5. Justera visningsparametrarna för oscilloskopet efter behov. Fånga data på oscilloskopet och spara data.

6. Observation Insect Flight med Wireless Recording System

OBS: En elektromagnetisk levitation plattform kan byggas för trådlös inspelning av EMG-signaler under tjudrad Manduca sexta flygning. Den levitation plattform består av en ram utformad för att balansera en tjudra mekanism. Den levitation tillåter ramen, och därför insekten, att gira under testning utan begränsning av tjudra trådar. Ramen kan vara snabb-prototyper med hjälp av en smält nedfall modellering (FDM) maskin. En magnet måste anslutas till botten av denna ram och som kan sväva genom en serie av magneter i bas-plattformen. Insekten är ansluten till FFC kontakten upphängd från toppen av ramen. Denna sväva plattform ligger inne i LED arena som byggdes using 60 paneler som består av en matris med 5x7 individuella lysdioder. Detta system bygger på etablerade metoder för att utveckla en miljö för visuell stimulering av fruktflugor ^{15, 16, 17.} Arenan styrs av en mikrokontroller möjliggör simulering av både medurs och moturs rotation samt kontroll av rotationshastigheten.

1. Ställ in den trådlösa inspelningssystem genom att ansluta huvudsteg till adapterkortet på levitation plattformen.
2. Avlägsna insekt från buren när den är i ett aktivt tillstånd företrädesvis under dess gryningen tid.
3. Med hjälp av en pincett, försiktigt in elektrodkortet i FFC-receptorn på svävar ramen så att insekten är upphängd ordentligt i installationen.
4. Placera den magnetiska trollspö nära magnetbrytare på huvudsteg för att aktivera trådlös dataöverföring. En blå lampa tänds indikerar att huvudsteg är aktiv.
5. Släck ljuset iplats för totalt mörker. En röd lampa kan användas för att lägga till belysning till rummet. Öppna insamling telemetri uppgifter på en dator och välj lämpligt förinstallerade konfigurationsfilen om sådan finns. Starta datainsamling för att börja visa signaler.
6. Välj aktuell användargränssnitt för observation av EMG-signaler på den trådlösa inspelningssystem för att säkerställa en tillförlitlig trådlös anslutning och elektroddrift.
7. Slå på alla LED Arena komponenter: Reglerad DC strömförsörjning och mikrokontroller. Mikrostyrenheten kan justera rotationer per minut av den cykliska ljusmönstret och kan även styra riktningen av ljuset rotation.
8. Sakta balansera levitation plattform inom arenan. Rikta ram ovanför centrum av levitation bas noggrant, annars ram kommer att dras snabbt till marken möjligen skadar insekt.
9. Starta videoinspelning systemet.
10. Välj aktuell inspelningsfliken av programvarangränssnitt. Utse inspelningstiden och Arkiv Spara destination. Välj lämpliga inställningar utgångs att spara data. Klicka på startknappen för att starta en inspelning i mjukvaran. Detta kommer att spara den datafil som kan importeras i numeriska datormiljöer.
11. Observera eftersom insekten flyger i den riktning som överensstämmer med rörelsen av lysdioderna. Omvänd riktning lysdioderna och bekräfta att insekten ändrar riktning. Gör detta så många gånger som önskas.

Representative Results

En schematisk bild av det övergripande förfarandet EMIT presenteras i figur 1, som visar de viktigaste stegen i hawkmoth s metamorphic cykeln och de motsvarande elektrodinföringssteg. Elektrod insättning bör utföras i slutet puppstadium 4 till 7 dagar före eclosion. Detta medger att muskelfibrerna att utvecklas kring elektroderna och fixera implantatet i insekt.

Det typiska resultatet av en färdig sent puppstadium reklaminslag, när de två aktiva elektroderna och jordelektroderna har införts visas i figur 2.

Det typiska resultatet av en färdig vuxna stadium reklaminslag, när de två aktiva elektroder och jordelektroden har införts visas i figur 3.

Lysdioden arenan används för att inducera att vrida under flygning för Manduca sexta är visad i figur 4. En mikro wsom programmerats att tillåta styrning av rotationshastighet LED array vertikala mönster. Vinkelhastigheten hos lysdioden mönster var inställd på 7,3 grader per sekund. Den magnetisk levitation plattformen placerades i mitten av LED-arena för att låta insekten att fritt vända sig som svar på lysdioder.

Figur 5 visar den muskelpotentialsignal förvärvad från dorsoventral muskler med oscilloskopet före och efter vingflaxande. Signalen har bearbetats med 100 gånger amplifiering och ett högpassfilter av 1 Hz och ett lågpassfilter av 20 kHz. Under viloperiod, inga muskelpotentialer observerats. De muskelpotentialer under flaxa med vingarna inträffar vid ungefär 15 Hz-20 Hz.

Figur 6 visar den muskelpotentialsignal förvärvad med den trådlösa instrumentering före och efter vingflaxande. Under viloperiod, inga muskelpotentialer observerats. De muskelpotentialer DURing vingflaxande inträffar vid ungefär 15 Hz-20 Hz.

Figur 1. EMIT ordningen. Ett schematiskt diagram av EMIT ingrepp som utförs på Manduca sexta, såsom beskrivs i protokollet.

Figur 2. Pupa Inser. Fotografi av ett sent skede puppa direkt efter inspelningen elektroderna sattes in med hjälp av EMIT.

Figur 3. Mal Emergence. Fotografi av en vuxen mal med implanterad registreringselektroderna enfter eclosion.

Figur 4. Inspelningsinställningar. Den magnetisk levitation plattform och LED-arena som används för att spela in EMG-signaler från Manduca sexta flygmuskler. Här en Manduca sexta utför en gir manöver som svar på den roterande LE mönstret.

Figur 5. Oscilloskop EMG. En 2,5 sek EMG inspelning av ett dorsoventral muskeln med användning av en förstärkare och ett oscilloskop.

Figur 6. Trådlös EMG. 1,9sek EMG inspelning av dorsoventral muskeln med hjälp av den trådlösa huvudsteg inspelningsenhet och datainsamling programvara.

Discussion

Det finns flera viktiga steg under kirurgisk insättning av registreringselektroderna som påverkar möjligheten att spela in data i de senare stegen i protokollet. De registreringselektroderna bör infogas i puppan en dag efter uppvisar vingfläckar på ryggsidan. Om insättnings utförs två eller flera dagar efter denna tid kommer insektens vävnaden inte har tillräckligt med tid att utvecklas runt och stabilisera de insatta elektroder. Detta kan leda till förflyttning av de implanterade elektroder och opålitliga inspelningar i vuxenstadiet.

Det är viktigt att inte sätta in registreringselektroderna i PUPP flygmuskler på ett djup av mer än 5 mm. Annars kommer hemolymfa avsluta insättningspunkter och leda till utveckling av svagare flygmuskler. Om hemolymfa inte dyka upp, stoppa proceduren och låta puppan 24 timmar att återhämta sig innan du försöker sätta elektroderna igen. Införingsstället bör rengöras: eoroughly av alla ving hår innan elektroderna sätts in i puppan. Detta hindrar håret från att komma in i införingshålen och störa elektrodvävnadsgränssnittet.

För att säkerställa optimal vinge hälsa i vuxen fjäril, införingsstället bör åter rengöras från flygeln hår dagen innan eclosion använder pincett. Dessutom är det rekommenderat att använda en pincett för att lossa kanterna av nagelband fönstret som skars med injektionsnålen för att bistå eclosion inträffar på följande dag. Om något lim eller hemolymfa har torkat nära kanterna på nagelbanden fönstret kommer mal inte att kunna blåsa upp sina vingar efter eclosion och detta exemplar kommer inte att vara användbart för experiment.

Även insättningstider ges i dag, kan dessa variera något som tidslinjen för metamorf utveckling är en funktion av de uppfödnings temperaturer för poikilotherms. De som dagarna är för insekter som fötts upp i RT. Om en standard 25 °, C insectary inkubator används, kommer utvecklingen att vara ungefär 10-20% snabbare och insättningstider behöva justeras i enlighet därmed.

En begränsning av denna studie skulle vara den rotationströghet infördes till installationen av den snabba prototyper ABS plast levitation ram. Massan av ramen kan vara upp till 200 g medan massan av en mal är ca 4 gram. Fördelen med att använda en elektromagnetiskt levitated ram är förlust av friktionskontakt mellan ramen och en stödstruktur. Emellertid har användningen av en relativt tung ram bringar insekten att förbruka mer energi för att fullborda gir manövrar som svar på den roterande LED mönster. En ändring av uppbindning ram som används i denna studie skulle kunna vara användningen av ett mindre tätt material och / eller bygga en tunnare ram för att minska tröghetsbelastning.

De utvecklingsmässiga förändringar under metamorfos ge nya möjligheter till neurala ingenjörsmetoder för att lära dig hur insekter flyger.Det är ett anmärkningsvärt observationen att elektroden införing under PUPP stadier medför lindras vävnadsreaktioner med avseende på sitt vuxna stadium infogningar. Därför avger baserade införanden säkerställa mekanisk infästning av syntetiska system i eller på en insekt, samtidigt som en förutsägbar neuromuskulär gränssnitt med minimal kortsiktig effekt på insekts motoriskt beteende. Under de senaste två decennierna har robotists som arbetar på mycket liten skala obemannade luftfarkoster inspirerats av insekt flygning. Utöver att möjliggöra en ny elektrofysiologisk teknik, EMIT förfarande gör det också möjligt för insekt-maskin-gränssnitt (IMI) som kan ge tillgång till neurala ingenjörer att de elektriskt retbara celler av insekten för att kontrollera dess sensoriska och beteendefysiologi ^8. Detta har potential att "biobotically" tämja och kontrollera insekter förflyttning. Därför är inte bara användbart för att studera insekten flygningen, men också för den specifika metod som presenteras i denna artikeldomestice insekter som hybrid centimeter-skala flygande BioBots ^18. En ansökan om en sådan hybridplattform är att omvandla insekter i mobila miljö sensorsystem. Dessa arbetsgrupper djur kan potentiellt hjälpa människor i övervakningen av co-delade ekosystem genom att samla in och lagra miljöinformation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated stainless steel wire	A-M Systems	791900	0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed
Flexible electrode wire			Litz or inductor wire can be used.
Surface-mount FFC connector	Hirose Connector	FH28E-20S-0.5SH(05)
Tweezers	Grobet USA		Clean with 70% alcohol before use on the insect.
Kim-Wipes	Kimberly-Clark Worldwide	34155	Any size delicate-wipe tissues can be used.
Teflon tape			5 mm width Teflon tape.
Hypodermic Needle	Becton Dickinson & Co.	30511	20-30 G hypodermic needle can be used. Video showed 30 G.
Rigid fixation stick			Variety of materials can be used (e.g., coffee stirrers)
Insect emergence cage			Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.
Thermal cauterizer	Advanced Meditech International	CH-HI CT2103 (tip)	Optional equipment used for application of dental wax.
Dental wax	Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma		Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.
Magnetic levitation platform			Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping.