Summary
체외에서 외상성 뇌 손상 모델은 생체 뇌의 변형으로 재현하기 위해 개발되고있다. 스트레치에 의한 손상은 성상 세포, 뉴런, glial 세포, 대동맥, 뇌 혈관 내피 세포에 대한 고용되었습니다. 그러나 우리의 시스템은 체외 TBI 모델을 설정하는 BBB의 합법적 인 모델을 구성하는 속성을 가지고 혈액 뇌 장벽 (BBB) 모델을 사용합니다.
Abstract
외상성 뇌 손상 (TBI), 하나 더 그것에 관련된 기본 메커니즘을 이해 할 수있는 메소드가 낳은 높은 사망 사고로 인해 치료에 유용합니다. 생체 내에서 이러한 목적에 사용할 체외 방법에서 모두있다. 그것이 TBI 중에 발생으로 생체 내 모델은 실제 머리 부상을 모방 할 수 있습니다. 그러나 생체 기술에 세포 생리학 수준에서 연구에 악용 될 수 없습니다. 그들이 조작 세포와 세포 외 환경에 쉽게 액세스 할 수 있기 때문에, 따라서 체외 방법이 목적을 위해 더 유리하다.
우리의 프로토콜은 뇌 미세 혈관 내피 세포의 TBI 사용하여 스트레치 부상의 체외 모델을 제공합니다. 유연 바닥 우물에서 배양 세포에 적용되는 압력을 사용합니다. 압력은 쉽게 제어 할 수 있습니다 적용과 낮은에서 심한 범위하는 부상을 생성 할 수 있습니다. 쥐우리의 실험실에서 생성 된 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)는 이렇게 유사한 기술을 채택 다른 시스템에 이점을 제공하는 혈액 뇌 장벽 (BBB)에 대한 잘 적합 모델입니다. 또한, 방법의 단순성으로 인해, 실험 셋업을 쉽게 복제됩니다. 따라서,이 모델은 BBB에서 TBI에 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 연구에 사용할 수 있습니다.
Introduction
외상성 뇌 부상 (TBI) 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 만 10 사람들이 그 주요 건강 및 의료 문제 1하고 TBI에 의해 매년 영향을받습니다. 이로 인해 생체 내 및 TBI의 체외 모델에서 다양한이 확립 및 메커니즘 2,3,4을 연구하기 위해 개발. TBI의 더 나은 이해는 환자 치료를 개선하고 관련 사망률, 이환율과 비용을 감소 할 수있다.
생체 내 및 생체 방법 모두에서 사용 뇌 손상에 대한 많은 모델이 존재합니다. 생체 내 모델 머리 부상의 실제 이벤트를 모방 할 수 있습니다. 그러나 생체 내 상황의 복잡성, 관심의 조직에 접근성으로 인해이 제한됩니다. 입은 부상의 결과로 각각의 세포의 생리적 반응을 이해, 그것은 세포가 고립되는 것이 중요하다 전신 효과에서 어떤개별 응답 5를 억제하거나 변경할 수 있습니다. 이러한 이유 때문에, 외상의 휴대 전화 모델은 세포의 기계적 환경을 정확하게 6 제어 할 수 있기 때문에 동물 모델을 통해 중요한 이점을 제공합니다.
부상 등의 방법에 의한 변경을 결정하기 위해 세포 나 조직에 기계적인 부하의 사용을 고용 생체 시스템에서 개발되었다. 예를 들어, 세포에 기계적 손상의 효과를 연구하기위한 방법은 성상 세포, 신경 glial 세포 및 대동맥 내피 세포 7,8,9 설립되었습니다. 설치류 우리가 우리의 모델에 사용할 것과 동일한 압력 제어 장치를 채용 인간의 성상 세포 반응 (10)의 연구를 위해 설립 된 체외 외상 모델. 같은 방법은 마우스 뇌 미세 혈관 내피 세포 (bEnd3) 11 대뇌 피질의 뉴런으로 12,13뿐만 아니라, 대뇌 endoth에 스트레칭을 통해 부상을 유도하기 위해 적용신생 자돈 14 일부터 elial 세포. 장치하여 기계 스트레치 부상 10를 생산 아니라 문화의 바닥을 변형. 그것은 세포 위의 공기 압력의 응용 프로그램에 의해 배양 세포에 손상을 입 힙니다. 이 압력은 그로 인하여 세포를 스트레칭, 세포가 성장하는에 막 편향 수 있습니다. 스트레칭의 여러도 ( "즉,"낮은 "보통"또는 "중증)을 따라 공기 압력 펄스 지속 시간과 강도를 설정하여 달성 할 수있다. 스트레치에 의한 손상이 방법은 생체 내 7에 외상과 연관되어 있습니다. 또한 부상이 방법은 세포 환경의 정확한 제어가 가능하고 쉽게 재현 할 수 있습니다.
비슷한 방법이 bEnd3 포함하여 많은 다른 뇌 세포 유형에 사용되었지만, 우리의 모델은 쥐 뇌 미세 혈관 내피 세포의 사용 (CEnd를)이 발생하게된다는 점에서 장점입니다우리 연구실합니다. 이 셀 라인은 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 잘 적합 모델입니다. BBB 모델로 사용되는 체외 세포 배양에서 그들을 투과성 화면 역할을 할 수있는 것이 특징을 가지고해야합니다. BBB 투과성 예측 될 체외 세포 모델에서 하나의 중요한 기준은 생리적으로 실제 세포 구조에 15을 소유해야한다는 것입니다. bEnd3 세포가 표시에도 불구하고 특유의 스핀들과 같은 그들은 오히려 섬유소 젤 17 일반 관 구조보다 낭종과 같은 구멍을 형성 그것에 문화 16 편평 형태, 그들은 체외에서 불규칙한 형태 형성의 동작을 나타냅니다. 또한, 세포가 배아 및 신생아 생쥐에 주입했을 때, 그들은 있지만 신생아와 젊은 생쥐의 배아 생쥐에 치명적인 빠르게 성장하는 종양을 유도. 그것은 따라서 정상적인 내피 성장, 이동, 분화를 지배하는 하나 이상의 프로세스가 변경되거나 eliminat되었다는 것을 권장합니다이 셀 라인 18 ED. 반면에, 내피와 BBB 마커의 발현, 생체 및 paracellular 플럭스 측정의 형태 학적, 면역 세포 평가는 우리의 BBB 모델 CEnd를 실제로 BBB 19 적합한 모델이라고 보여줍니다.
생체 뇌 내피 세포는 횡단 내피 전기 저항 (티이)가 Ωcm 2 2,000-5,000 이르기까지와 매우 긴밀한 투과성이 특징입니다. 의약품에 대한 뇌 미세 혈관 장벽 특성 연구를 위해, 세포의 paracellular 제한성 및 견고이 고려되어야한다. 대부분의 뇌 모세 혈관 내피 세포 (BCEC)에서이 세포 전시 봉사자는 50 ~ 100 Ωcm 2에서 20까지로 유지되지 않습니다. 불후의 뇌 내피 세포 라인 bEnd3가없는 큰 15 2 Ωcm 60 이상의 봉사자 값을 생성합니다. 포함하는 배지로 CEnd를 세포의 대비 차별화 혈청 디스플레이를 감소300-500 Ωcm 2 19,21 이르기까지 티이 값.
지금까지 배양 된 뇌 혈관 내피 세포에서 스트레칭 부상의 체외 모델에서 부족합니다. 따라서, BBB의 모델로 역할을 배양 뇌 혈관 내피 세포를 사용하여 스트레치 부상을 통해 외상 체외 모델이 유용하다는 것을 증명하기 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 뇌 세포 BBB 구체적으로 뇌 미세 혈관 내피 세포, TBI 동안받는 실제적인 영향을 모방 할 수있는 체외 모델을 제시한다. 이 모델의 가장 큰 장점은 부상의 양이 세포뿐만 아니라 세포 환경이 쉽게 실험 셋업을 쉽게 재현성을 가능하게하는 정확한 방식으로 제어 할 수 있습니다에 적용되는 것입니다.
Protocol
1. 잘 접시에 내피 세포의 파종
- 합류에 도달 할 때까지 두 번 배지 (DMEM이 10 % FCS, 50 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % L-글루타민 포함) 주 변화, T75 문화 플라스크에 생쥐 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)을 육성. (. 포스터 등 2005 년 21,19. 뇌 미세 혈관 내피 세포의 생성 및 불멸화를 들어, Burek 외, 2012 참조).
- 인산 세포를 씻으 식염수 (PBS)가 버퍼. PBS를 제거하고 2 ㎖ 따뜻한 트립신-EDTA 용액으로 세포를 trypsinize.
- 세포 층이 분산 될 때까지 5 분 또는 37 ° C에서 세포를 품어.
- 세포에 8 ML 문화 매체를 추가합니다. 세포를 분리 플라스크를 여러 번 누릅니다.
- 플라스크의 완전한 분리를 보장하기 위해 현미경으로 세포를 볼 수 있습니다.
- 분리 된 세포를 위아래로 피펫 매체. 세포 suspensi을 혼합하는 소용돌이 플라스크합니다.
- , 세포 현탁액의 20 μl를 타고 혈구에 넣고 세포의 수를 계산합니다.
- 세포 밀도와 씨앗 20,000 세포 /도에 cm 2를 확인합니다.
- collagen1에 세포 현탁액을 전송 3 ML / 잘 총량의 6 자 유연한 바닥 배양 플레이트 (63,525 cm 2)로 코팅. 각각의 잘은 9.62 cm 2의 면적을 가지고 있습니다.
- 합류 할 때까지 일주일 동안 37 ° C에서 세포를 성장. 일주일에 두 번 배양액을 변경합니다.
2. 이전 스트레치에 의한 부상 세포 분화
- 분화 배지 (DMEM는 혈청 벗겨 송아지 태아 혈청 (ssFCS) 1 %, 50 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는)와 세포의 배양액을 변경합니다.
- 24 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어.
3. 내피 세포의 스트레치에 의한 손상
- 세포 손상 컨트롤러 장치의 전원을 켭니다.
- 50 밀리 초까지의 지연 시간을 설정합니다.
- 레귤레이터 압력 15 PSI로 설정하고 등록 된 피크 압력이 안정 될 때까지 트리거 몇 번을 누릅니다.
- 원하는 값으로 조절기 압력을 설정합니다. 스트레치 부상의 다양한 학위를 생성하기위한 가이드로 표 1을 사용합니다.
- 트레이 홀더에 6 자 유연한 바닥 배양 플레이트 (63,525 cm 2)를 놓습니다. 잘 선택이 올바른뿐만 크기 (즉, 큰 우물)로 설정되어 있는지 확인합니다.
- 확실히 잘 통해 어댑터 플러그를 놓습니다. 다른 한편으로는 트리거를 밀어 한 손으로 제자리에 플러그를 잡으십시오.
- 생성 된 피크 압력을 기록한다.
- 바로 시간의 원하는 기간 동안 37 ° C 배양기에 다시 접시를 넣어 또는 실험이나 평가를 성공을 즉시 사용합니다.
4. 염료 흡수 분석에 의해 스트레치 손상의 평가
- 세포는 STR이었다 직후에칭 (단계 3.7), 생존 얼룩의 1 MG / ML 솔루션의 30 μl를 추가하는 세포 배양 배지 (참고 독성 마커 (재료 및 장비의 보충 표 참조) 역할 : 염료 용액 10 μL ) 세포 배양 배지의 모든 ML을 위해 사용됩니다.
- 세포에 염료를 첨가되면, 즉시 형광 현미경으로 볼 수 있습니다.
5. 젖산 탈수소 효소에 의해 스트레치 상해의 평가 (LDH) 출시
- 즉시 세포 (단계 3.7) 스트레칭 후, 우물에서 세포 배양액 200 μl를 제거합니다. 당신은 LDH 방출의 수사에 포함 할 때마다 포인트 이후 부상에 대해 동일한 작업을 수행 (즉, 예를 들어, 30 분, 1 시간, 2 시간, 등.)
- 모든 세포 파편을 제거하는 5 분의 microcentrifuge의 가장 높은 설정으로 세포 배양액을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 후속 단계에 대해이 작업을 사용합니다.
- 당신 H 회AVE 단계 5.1를 완료하고 당신이, 조사 LDH 분석 키트 (재료 및 장비의 보충 표 참조)에 포함 된 용해 용액을 사용하여 세포를 용해하고 싶은 다양한 시간 지점에서하고 싶습니다 필요한 샘플을 촬영했습니다.
- 키트에 제공된 96 웰 플레이트의 각 잘 분석 키토에 포함 된 측정 배지 100 μl를 넣습니다.
- 분석 키트에 포함 된 96 웰 플레이트의 두 개의 병렬 우물에 세포 무료 세포 배양액 100 μl를 넣습니다.
- 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
- 492 nm에서 흡광도를 참조하십시오.
Representative Results
콜라겐에 배양 세포 나 세포 들것 장치를 사용하여 스트레치 부상의 다양한 학위를 받게 된 6 자 유연한 바닥 배양 플레이트 (63,525 cm 2)로 코팅. 부상 세포를 복종 후에는 세포 형태에 스트레치에 의한 부상의 효과를 현미경으로 관찰 하였다. 그것은 스트레칭으로 큰 정도가 세포 왜곡의 큰 정도도 관찰 할 수있는 세포 (그림 1)에 적용되었는지 관찰되었다. 그림 1A와 같이 부상에 노출되지 않은 컨트롤 세포는 세포의 팽창이나 왜곡의 표시없이 정기적으로 모양의 뇌 혈관 내피 세포 (CEnd를)를 나타납니다. 스트레치 부상이 적용되었을 때 (그림은 1B-D), 변형 광학 현미경으로 관찰 할 수있다. 3.5-4.5 PSI 사이의 최대 압력을 심각하게 세포를 스트레칭 후 CEnd를 세포는 크게, 수축 팽창이 아닌로 변형 등장 수 간 공간. 또한, 얼룩 생존 (100 nm의 최종 농도)의 섭취는 스트레치 부상의 정도 (그림 2) 증가로 증가했다. 가능성은 사용 염색은 세포의 세포막의 무결성이 손상 될 때 투과되고 건강한 세포에 염색 impermeant입니다. 염료 뻗어 세포 (그림 2B-D)에 비해 따라서, 세포의 단지 몇 (그림 2A) 염색 하였다, 제어 세포의 대부분에서 제외되었다. 많은 셀 스트레치 부상의 증가도 녹색 fluoresced.
젖산 탈수소 효소의 부상 릴리스 (LDH)의 생화학 적 마커로 효소는 제조업체의 지침에 따라 조사 하였다. 그림 증가 세포 스트레칭 부상 증가 LDH 방출을 야기하는 3 보여줍니다.
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그림 1. 정상 대 손상된 세포의 광학 현미경 검사. (A) 일반 늘어나지 합류 세포 단층이 istightly 포장 길쭉한. 세포들은 적은 소형 표시 1.8-2.0 PSI (즉, 낮은 뻗기)의 피크 압력 펄스를 적용하여 뻗어 때, 공간은 화살표 (B)로 표시. 세포가 적당히 2.5-3.0 피크 압력 펄스로 부상했을 때, 그들 중 일부는 부어 (C) 변형 나타났다. 세포는 화살표 (D)로 표시 3.5-4.5 PSI, 심한 스트레칭으로 철회된다. 100X 배율. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 형석정상 대 손상된 세포의 escence 현미경 검사 손상 후 생존 얼룩 2 시간 치료 세포 : 제어 늘어나지 세포 BD : 기지개 세포 (B - 낮은 C - 중간, D - 심한 경우도 있음).... 100X 배율. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 스트레치 부상 후 상층 액에 젖산 탈수소 효소 (lactate dehydrogenase, LDH) 효소 릴리스. LDH 배양액으로 방출이 스트레치에 의한 손상 후 다양한 시간 간격으로 측정 하였다. LDH는 총 박리 LDH (미디어 플러스 세포의 LDH)의 백분율로 표시 하였다. 값은 ± SEM 있습니다. 마다 포인트 n은 0 시간 V를 제외하고 5입니다alue n은 = 3 심한 스트레칭을 실시. 낮은 중간 스트레칭을 실시 하였다 세포 LDH 방출이 늘어나지 컨트롤의 그것과 서로 유의 한 차이가 없었다. 심각하게 뻗어 된 세포는 1 시간에 적당히 늘어 샘플을 제외한 모든 다른 시료에 비해 LDH의 상당히 큰 금액을 발표했다. (p <0.05, 하나의 요인 ANOVA, 홀름 - Sidak 방식). 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
표 1. 스트레치 부상의 다양한 학위를 생성하기 위해 안내합니다.
| 레귤레이터 압력 | 최대 압력 | 부상의 정도 |
|---|---|---|
| 15 PSI | 1.2-1.5 PSI | <저 |
| 20-25 PSI | 1.8-2.0 PSI | 낮은 |
| 30-35 PSI | 2.5-3.0 PSI | 중간 |
| 40-50 PSI | 3.5-4.5 PSI | 심한 |
| 60 PSI | 4.8-6.0 PSI | > 심한 |
Discussion
성상 세포, 신경 glial 세포 및 대동맥 내피 세포 8, 9, 22 체외에서 기계적 손상의 효과는 연구되어왔다 및 방법이 확립되었다. 여전히 배양 뇌 혈관 내피 세포에서 스트레칭 부상의 체외 모델에서 알려진 최신하지 않도록, 그러나,있다. 외상의 휴대 전화 모델은 세포의 기계적 환경을 정확하게 6 제어 할 수 있기 때문에 동물 모델에 중요한 이점을 제공합니다. 따라서 배양 된 내피 뇌 세포를 사용하여 스트레치 부상을 통해 외상 체외 모델에서 그러한 우리의 프로토콜 선물이 유용하다는 것을 증명 할 수있는 것과 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 모델 역할을합니다.
이 프로토콜은 CEnd를 세포의 사용, 우리의 실험실에서 설립 BBB 모델을 만든다. BBB 고장이 자주 TBI 환자에 문서화하고 TBI는 종종 부종 형성 23, 24 발생할 수 있습니다 BBB의 중단에 연결되어 있기 때문에,이 메소드는 PRES여기 성향의 구체적 TBI에 관하여 BBB 연구를 수행에 사용할 수 있습니다.
이 모델에서, 그것은 스트레치 부상의 정도가 세포에 적용되는 방법을 많이 돌봐 것이 중요합니다. 세포가 어떤 경우에, 그리고 적용되는 압력의 어떤 금액으로 부상하는만큼의 내피 세포에 영향을 미칠 수있는 손상의 정도가 다른 세포 유형에서 크게 많이 다릅니다. 대동맥 내피 세포는 성상 세포 또는 혼합 glial 세포 9보다 부상을 스트레칭하는 것이 더 저항. 다른 세포 유형에 비해 또한, 그들은 부상 후보다 신속하게 복구 할 수 있습니다. 따라서 뇌 혈관 내피 세포, 특히 CEnd를 세포 스트레칭 손상의 큰 금액에 대한 부상의 높은 수준을 생산하기 위해 필요합니다. 하나는 표 1의 해당하는 압력을 적용하여 부상의 원하는 수준을 달성 할 수 있습니다. CEnd를 셀, 그러나 심각한 부상은 긴장하는 그들의 저항에 따른 선호합니다. 실시 LDH 분석 실험 하였다스트레치 증가의 정도를 더 LDH는 상층으로 분비되어 있는지 확인합니다. 대조적으로, 스트레치 부상의 낮은 양을 주어진 세포는 세포를 제어 유사한 양 LDH를 생산. 프로토콜에서 언급했듯이, 하나는 매체의 적절한 양 매체의 양을 증가 또는 감소가 우물에 적용되는 피크 압력의 차이가 발생할 수 있으므로 사용되는주의해야합니다. 45 PSI 압력이 가해질 때 빈도 3.8 PSI의 평균을 등록 예를 들어, 유체의 잘 포함 5 ML 4.0 PSI의 평균에서 피크 압력을 등록합니다. 따라서 생성 될 최대 압력이 원하는 양에 해당되도록 잘 컨트롤에 트리거를 여러 번 밀어 좋습니다.
우리의 실험에서 우리는 생존이 세포막의 투과성을 스트레칭의 효과를 결정하는 얼룩 사용됩니다. 우리가 사용하는 유연한 바닥 문화 판의 광학은 우리가 vi를 할 수 있습니다EW 직접 현미경으로 스테인드 세포. 그러나 한 직접 스트레치 부상 후 immunolabelling 연구를 수행하고자 할 때, 어려움이 발생할 수 있습니다. 첫째, 접시의 크기와 두께는 약간의 현미경보기 플랫폼과 문제를 일으킬 수 있습니다. 둘째, 잘 유연한 막 광학 감상을 취소 장애가있을 수 있습니다.
앞서 언급 한 한계에도 불구하고, 설명 절차는 BBB의 생체 기계 부상의 모델로 사용할 수 있습니다. 외상성 뇌 부상 (TBI) 두 가지, 즉 구성 요소, 허혈 및 외상을 포함한다. 빈혈은 저혈압이나 뇌의 결과로 인한 심각한 혈액 손실이있을 때 경우에 TBI에 따라 뇌에 제한 산소 공급을 붓기 보조 부상으로 발생할 수 있습니다. 그것은 부상 (25)의 순간에 시작된 연속 병적 인 과정을 나타내는 지연, nonmechanical 피해로 간주됩니다. 저산소증의 발생따고 심각한 외상성 뇌 손상은 일반적으로 26이다. 산소 포도당 박탈 (OGD)는 현재 체외에서 모델 허혈에 사용되는 방법입니다. 따라서, 스트레칭 후 세포에 보조 모욕으로 OGD하는 세포를 가하면 국소 빈혈 다음 TBI의 발생을 모방 할 수 있습니다. 따라서 체외 모델에서 우리의 현재를 개선하는 TBI와 최대한 가까이 실제 TBI로는 생체 내에서 발생으로 패턴을, 미래에 우리는 또한 스트레치 부상과 함께 OGD 채용합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 보조금 협정 제 건강-F2-2009-241778에에서 부여 번호 FO 315/4- 아래 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG, 독일 연구 재단)과 유럽 연합 (EU) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)에 의해 지원되었다 CF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Injury Controller II | Custom Design and Fabrication, Virginia, USA | ||
| Bioflex Culture Plate - Collagen Type I | Flexcell, Dunn Labortechnik | BF - 3001C | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
| L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
| MEM Vitamin | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
| Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
| Non-essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
| Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS) | Life Technologies | 12676-011 | |
| Trypsin-EDTA solution | PAA Laboratories | L11-004 | Storage: ≤ -15 °C |
| Image-iT DEAD Green | Life Technologies | I10291 | Storage: ≤ -15 °C, protected from light |
| Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) | Roche | 4744926001 | Storage: ≤ -15 °C |
References
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