Summary
In vitro traumatisk hjärnskada modeller utvecklas för att reproducera in vivo hjärnan deformation. Stretch-inducerad skada har använts för astrocyter, neuroner, gliaceller, aorta, och hjärnan endotelceller. Dock använder vårt system en blodhjärnbarriären (BBB) modell som har egenskaper som utgör en legitim modell för BBB att etablera en in vitro TBI modell.
Abstract
På grund av den höga dödligheten incidenten följd av traumatisk hjärnskada (TBI), metoder som skulle göra det möjligt att bättre förstå de underliggande mekanismer som är inblandade i det är användbart för behandling. Det finns både in vivo och in vitro-metoder som finns för detta ändamål. In vivo-modeller kan efterlikna verkliga skallskada som inträffar under TBI. Dock får in vivo tekniker inte utnyttjas för studier på cellfysiologi nivå. Följaktligen, in vitro-metoder är mer fördelaktiga för detta ändamål eftersom de ger lättare tillgång till cellerna och den extracellulära miljön för manipulering.
Vår protokoll presenterar en in vitro modell av TBI med stretch skada i hjärnan mikrovaskulära endotelceller. Den använder tryck som appliceras på de celler odlade i flexibel-formade brunnar. Trycket appliceras lätt kan kontrolleras och kan producera skada som sträcker sig från låg till svår. Den murinahjärnan mikrovaskulära endotelceller (cEND) genereras i vårt laboratorium är en väl lämpad modell för blodhjärnbarriären (BBB) vilket ger en fördel till andra system som använder en liknande teknik. Dessutom, på grund av enkelheten i metoden är experimentella uppställningar lätt dupliceras. Således kan denna modell användas för att studera de cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i TBI hos BBB.
Introduction
Traumatisk hjärnskada (TBI) är en av de vanligaste dödsorsakerna i världen. Omkring 10 miljoner människor drabbas årligen av TBI vilket gör det ett stort hälso-och medicinska problem 1. På grund av detta, har olika in vivo och in vitro modeller av TBI etablerats och utvecklats för att studera dess mekanismer 2,3,4. En bättre förståelse av TBI kan förbättra patientens behandling och minska tillhörande dödlighet, sjuklighet och kostnad.
Många modeller för hjärnskada som utnyttjar både in vivo och in vitro-metoder finns. In vivo-modeller skulle kunna imitera den faktiska händelsen av huvudskada. Men, på grund av komplexiteten av in vivo-situationen, tillgång till vävnaden av intresse blir begränsad 2. För att förstå den fysiologiska svaret hos individuella celler till följd av den tillfogade skadan, är det viktigt att cellerna är isolerade från de systemiska effekter somkan hämma eller förändra deras individuella svar 5. Av denna anledning, cellulära modeller av trauma ge värdefulla fördelar jämfört med djurmodeller eftersom den mekaniska miljön av cellerna kan styras exakt 6.
In vitro-system som använder användningen av mekaniska belastning som celler eller vävnader för att bestämma förändringar som orsakas av sådan metod av skada har utvecklats. Exempelvis har en metod för att studera effekten av mekanisk skada på celler fastställts för astrocyter, neuroner, gliaceller och aortaendotelceller 7,8,9. In vitro trauma modell fastställts för studier av gnagare och människa astrocyternas reaktivitet 10 anställda en tryckregleringsanordning identisk med vad vi använder för vår modell. Samma metod tillämpades för att framkalla skada genom sträckning i mushjärna mikrokärlsbildning endotelceller (bEnd3) 11 och kortikala neuroner 12,13 liksom, cerebral endothelial celler från nyfödda grisar 14. Anordningen deformeras botten av odlingsbrunn varigenom mekanisk stretch skada 10. Det tillfogar skada vid odlade celler genom applicering av lufttryck över cellerna. Detta tryck kan böja membranet på vilket cellerna växer, och därigenom sträcker cellerna. Olika grader av stretch (dvs. "låg," måttlig "eller" allvarlig ") kan uppnås genom att luften varaktighet trycket puls och intensitet därefter. Denna metod för stretch-induced skadan har samband med traumatiska skador in vivo 7. Dessutom , denna metod för skada möjliggör exakt styrning av den extracellulära miljön och kan lätt reproduceras.
Även ett liknande tillvägagångssätt har använts för många andra typer hjärncell inklusive bEnd3, är vår modell av en fördel i att den använder sig av de murina endothelial hjärnan mikrovaskulära celler (cEND) genererasi vårt laboratorium. Denna cellinje är en väl lämpad modell av blodhjärnbarriären (BBB). I kulturer vitro cell används som BBB: modeller bör ha egenskaper som skulle göra det möjligt för dem att fungera som permeabilitet skärmen. Ett viktigt kriterium för en in vitro cell modell för att vara en spåman av BBB permeabilitet är att det borde ha fysiologiskt realistiska cellarkitektur 15. Trots bEnd3 celler uppvisar distinkta spindel-liknande skivepitelcancer morfologi i kultur 16, de uppvisar oregelbundna morfogenetisk beteende in vitro varvid de bildar cysta-liknande håligheter i stället för de vanliga rörkonstruktioner i fibrin geler 17. Dessutom, när cellerna injicerades in i embryonala och nyfödda möss, framkallade de snabbt växande tumörer dödliga till embryonala möss men inte hos nyfödda och unga möss. Det är därför föreslagit att en eller flera processer som styr normal endothelial tillväxt, migration och differentiering har ändrats eller elied i denna cellinje 18. Å andra sidan, morfologisk, immuncytokemiska utvärdering av endotel-och BBB-markör uttryck, bioelektrisk och paracellulär flödesmätningar att visa att vår BBB modell cEND är verkligen en lämplig modell av BBB-19.
Brain endotel in vivo karaktäriseras av en extremt snäv permeabilitet med trans-endothelial elektriskt motstånd (TEER) som sträcker sig från 2000-5000 Qcm 2. För studier av barriär hjärnan mikrovaskulatur egenskaper som läkemedel, bör paracellulär restriktivitet och täthet av cellerna övervägas. I de flesta hjärnans kapillära endotelceller (BCEC), är detta inte bevaras eftersom cellerna uppvisar TEER sträcker 50-100 Qcm 2 20. Den förevigade hjärnan endotelcellinje bEnd3 genererar Teer värden inte är större än 60 Qcm 2 15. I motsats differentiering av cEND celler med medium innehållande minskat serum displayTeer värden mellan 300-500 Qcm 2 19,21.
Hittills in vitro-modeller av stretch skador på odlade hjärnans endotelceller är knappa. Därför kan en in vitro modell för trauma genom stretch skada med odlade hjärnans endotelceller som fungerar som modell för BBB visa sig vara användbart. I detta protokoll, presenterar vi en in vitro-modell som skulle kunna imitera den faktiska inverkan som hjärnceller, speciellt hjärnan mikrovaskulära endotelceller i BBB, mottar under TBI. Den största fördelen med denna modell är att mängden av skada tillämpas på celler såväl som den extracellulära miljön kan enkelt kontrolleras på ett precist sätt möjliggör enkel reproducerbarhet av experimentell uppsättning.
Protocol
Ett. Ympning av endotelceller in brunnsplattor
- Odla murina hjärnan mikrovaskulära endotelceller (cEND) i T75 odlingskolv, ändra medium (DMEM innehållande 10% FCS, 50 U / ml penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin) två gånger i veckan, tills konfluens uppnås. (För generering och odödliggörande av hjärnan mikrovaskulära endotelceller, se Burek et al, 2012;. Förster et al, 2005 21,19.).
- Tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort PBS och trypsinize cellerna med 2 ml varmt trypsin-EDTA-lösning.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C under 5 min eller tills cellskiktet är dispergerad.
- Tillsätt 8 medelstora ml odling i cellerna. Tryck kolven flera gånger för att lossa cellerna.
- Visa celler under mikroskop för att säkerställa fullständig avskildhet från kolv.
- Pipettera medium med lösgjorda celler upp och ner. Snurra flaskan för att blanda cellen upphängningvidare.
- Ta 20 | il av cellsuspensionen, tas i en hemocytometer och räkna antalet celler.
- Bestäm celldensiteten och utsäde 20.000 celler / cm 2 i brunnen.
- Överför cellsuspensionen i collagen1 förbelagda 6-brunnars flexibel botten odlingsplattor (57,75 cm 2) i en total volym av 3 ml / brunn. Varje brunn har en yta på 9,62 cm 2.
- Odla cellerna vid 37 ° C under en vecka tills konfluenta. Ändra odlingsmedium två gånger per vecka.
2. Celldifferentiering Före Stretch-inducerad skada
- Ändra odlingsmedium av cellerna med differentieringsmedium (DMEM innehållande 1% serum-strippad fetalt kalvserum (ssFCS), 50 U / ml penicillin / streptomycin).
- Inkubera cellerna vid 37 ° C under 24 timmar.
Tre. Stretch-inducerad skada av endotelceller
- Slå på cellskada styranordning.
- Ställ in fördröjningen till 50 msek.
- Ställ regulatorn trycket till 15 psi och tryck på avtryckaren ett par gånger tills det registrerade topp trycket blir stabilt.
- Ställ regulatorn tryck till det önskade värdet. Använd tabell 1 som en guide för att generera olika grader av stretch skada.
- Placera 6-väl flexibel botten kultur plattan (57,75 cm 2) i hållaren. Se till att det väl är inställd på rätt bra storlek (dvs. stora väl).
- Placera adaptern kontakten ordentligt över brunnen. Håll kontakten ordentligt med ena handen medan den andra handen trycker på avtryckaren.
- Spela toppen trycket alstras.
- Omedelbart satte plattan tillbaka till 37 ° C inkubator för önskad tid eller använda omedelbart för efterföljande experiment eller utvärdering.
4. Bedömning av Stretch skada genom färgämnesupptagning analys
- Omedelbart efter att cellerna var stretsat (steg 3,7), tillsätt 30 ul av en 1 mg / ml lösning av livskraft fläcken som fungerar som en cytotoxicitet markör (se kompletterande tabell av material och utrustning) till cellodlingsmediet (Obs: 10 ul färgämneslösningen skall användas för varje ml cellodlingsmedium).
- Vid tillsats av färgämnet till cellerna, omedelbart visa under ett fluorescensmikroskop.
Fem. Bedömning av Stretch skada genom laktatdehydrogenas (LDH) Release
- Omedelbart efter sträckning cellerna (steg 3.7), avlägsna 200 pl cellodlingsmedium från brunnen. Gör samma sak för varje tidpunkt efter skada du vill inkludera i din undersökning av LDH-frisättning (dvs. t.ex. 30 min, 1 tim, 2 tim, osv.)
- Centrifugera cellodlingsmedium vid den högsta inställningen av en mikrocentrifug under 5 minuter för att avlägsna eventuella cellrester. Avlägsna supernatanten och använda denna för de efterföljande stegen.
- När du have färdiga steg 5,1 och har vidtagit nödvändiga prover du vill ha från de olika tidpunkter du vill undersöka, lysera celler med lyslösningen ingår i LDH analyssatsen (se kompletterande tabell av material och utrustning).
- Sätt 100 | il av analysmediet ingår i analysen kitto varje brunn i en 96-brunnars platta som medföljer satsen.
- Sätt 100 pl av det cellfria cellodlingsmedium i två parallella brunnar i en 96-brunnars platta som ingår i analyssatsen.
- Inkubera plattan vid 37 ° C under 30 min.
- Läs av absorbansen vid 492 nm.
Representative Results
Celler odlade på kollagen I förbelagda 6-brunnars flexibla bottnade odlingsplattor (57,75 cm 2) utsattes för olika grad av stretch skada som använder den enhet cell bår. Efter att ha utsatt att cellerna på skada, var de undersöktes under mikroskop för effekterna av stretch-inducerad skada på cellmorfologi. Det observerades att som större grad av sträckning applicerades till cellerna en högre grad av cell distorsion iakttogs också (figur 1). Som visas i figur 1A, kontroll celler som inte utsattes för skada visas som regelbundet formade cerebrovaskulära endotelceller (cEND) utan någon indikation på cellernas svullnad eller distorsion. När stretch skada applicerades (figurerna 1B-D), kunde deformationen observeras under ljusmikroskop. Efter stretching cellerna kraftigt med en topp tryck mellan 3,5-4,5 psi, verkade cEND cellerna markant indragen, svullna och deformeras med inte kunna intracellulära utrymmen. Dessutom upptag av viabilitet fläck (100 nM slutlig koncentration) ökade också som graden av sträckning skada ökades (figur 2). Livskraften fläcken som används är ett färgämne ogenomträngligt för friska celler som blir permeant när plasmamembranet integritet celler äventyras. Färgämnet uteslöts från de flesta kontrollerna cellerna, därmed var bara ett fåtal av de färgades cellerna (Figur 2A) jämfört med sträckta celler (Fig. 2B-D). Fler celler fluorescerade grönt med en ökad grad av stretch skada.
Som en biokemisk markör av skada, frisättning av laktatdehydrogenas (LDH) enzymet undersöktes även enligt tillverkarens anvisningar. Figur 3 visar att en ökande cell stretch skador orsakade ökande LDH-frisättning.
928/50928fig1.jpg "width =" 500px "/>
Figur 1. Ljusmikroskopi undersökning av normala kontra skadade celler. (A) Normal osträckta sammanflytande cellmonoskiktet istightly packade och långsträckt. När cellerna sträcktes genom att applicera en topp tryckpuls av 1,8-2,0 psi (dvs låg stretch) de verkar mindre kompakt, indikeras utrymmen med pilar (B). När cellerna måttligt skadades med en 2,5-3,0 topptrycket puls, verkade en del av dem svullna och deformerade (C). Cellerna blir indragen med svår sträcka av 3,5-4,5 psi, såsom indikeras av pilen (D). 100 gångers förstoring. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Fluorescence mikroskopisk undersökning av normala kontra skadade celler Celler behandlade med livskraft fläck 2 tim efter skada A: kontroll osträckta celler BD: sträckta celler (B - låg, C - måttlig, D - svår).... 100 gångers förstoring. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Laktatdehydrogenas (LDH) enzymfrisättning i supernatanten efter sträckning skada. LDH som avgivits till odlingsmediet mättes vid olika tidsintervall efter sträckning inducerad skada. LDH uttrycktes som en procent av den totala löstagbara LDH (LDH i media plus celler). Värdena är ± SEM. Den n för varje tidpunkt är 5, med undantag för 0 hr value utsättas för kraftiga sträcka där n = 3. LDH-frisättning från celler som utsattes för låga och måttliga stretch skilde sig inte signifikant från den hos osträckta kontroller och från varandra. Celler som drabbades sträckte ut en betydligt större mängd LDH jämfört med alla andra prover, utom för den måttligt sträckt prov på 1 timme. (P <0,05, En faktor ANOVA, Holm-Sidak metoden). Klicka här för att se större bild .
Tabell 1. Guide för att generera olika grader av stretch skador.
| Regulator Pressure | Topptryck | Grad av skada |
|---|---|---|
| 15 psi | 1.2-1.5 psi | <Låg |
| 20-25 psi | 1,8-2,0 psi | Låg |
| 30-35 psi | 2,5-3,0 psi | Måttlig |
| 40-50 psi | 3,5-4,5 psi | Svår |
| 60 psi | 4,8-6,0 psi | > Svår |
Discussion
Effekterna av mekanisk skada in vitro har studerats och metoder har fastställts för astrocyter, neuroner, gliaceller och aortaendotelceller 8, 9, 22. Det finns emellertid hittills fortfarande ingen känd in vitro-modell av stretch skada i odlade hjärnans endotelceller. Cellulära modeller av trauma ge värdefulla fördelar jämfört djurmodeller eftersom den mekaniska miljön av cellerna kan styras exakt 6. Därför, en in vitro-modell för trauma genom stretch skada med odlade endotelceller hjärnceller som fungerar som modell av blodhjärnbarriären (BBB) som vad våra protokoll presenterar kan vara till nytta.
Detta protokoll använder cEND celler, en etablerad BBB-modellen i vårt laboratorium. Eftersom BBB uppdelning ofta dokumenterat i TBI patienter och TBI är ofta kopplad till störningar av BBB som kan leda till ödem bildning 23, 24, pres metodenterade här kan specifikt används vid utförande BBB: studier i förhållande till TBI.
I denna modell är det viktigt att ta hand om hur mycket sträckningsgraden skada appliceras till cellerna. I så mycket som cellerna skadas i alla fall, och med vilken mängd tryck appliceras, graden av skada som kan påverka endotelceller skiljer mycket kraftigt från andra celltyper. Aortaendotelceller är mer motståndskraftiga mot sträcka skada än astrocyter eller blandade gliaceller 9. Dessutom reparera de snabbare efter skadan jämfört med andra celltyper. Därför är för hjärnans endotelceller, särskilt cEND celler, större mängd stretch skada behövs för att producera en hög grad av skada. Man skulle kunna uppnå den önskade graden av skada genom att tillämpa motsvarande tryck som anges i tabell 1. För cEND celler emellertid allvarlig skada föredra på grund av deras motståndskraft mot påfrestningar. LDH genomförda analyserna visadeatt som graden av stretch ökar, mer LDH utsöndras i supematanten. I motsats härtill producerade de celler som fick en låg mängd stretch skada LDH i en mängd liknande med kontrollceller. Som nämndes i protokollet, måste man se till att lämplig mängd medium används eftersom en ökning eller minskning av mängden av mediet kan leda till skillnader i högsta trycket appliceras till brunnarna. Till exempel registrerar en brunn innehållande 5 ml vätska en topp tryck i genomsnitt 4,0 psi medan en tom väl registrerar ett genomsnitt på 3,8 psi då 45 psi tryck appliceras. Därför är det bäst att driva de aktiverande flera gånger över en kontroll väl för att säkerställa att det topptryck som kommer att genereras motsvarar den önskade mängden.
I våra experiment använde vi en viabilitet fläck för att bestämma effekten av sträckning till permeabiliteten av cellmembranet. Optiken i de flexibla-bottnade odlingsplattor vi använde gör att vi kan vi:ew de färgade cellerna direkt under mikroskop. Men när man vill genomföra inmärkning studier direkt efter stretch-skada, kan svårigheter uppstå. Först, kan storleken och tjockleken av plattan utgör ett problem med vissa plattformar mikroskop visning. Andra kan optiken i det flexibla membranet av brunnen vara ett hinder för att rensa visning.
Trots de ovan nämnda begränsningarna, kan emellertid det beskrivna förfarandet användas som en modell för in vitro mekanisk skada av BBB. Traumatisk hjärnskada (TBI) omfattar två komponenter, nämligen, ischemi och trauma. Ischemi kan uppstå som en sekundär skada efter TBI i fall då det råder allvarlig blodförlust leder till lågt blodtryck eller som en följd av svullnad av hjärnan begränsar syretillförseln till hjärnan. Det anses som en försenad, icke-mekanisk skada som representerar rad patologiska processer som har inletts vid tidpunkten för skadan 25. Förekomsten av hypoxi enfter svår traumatisk hjärnskada är vanlig 26. Syre glukos deprivation (OGD) är den metod som för tillfället används för att modellera ischemi in vitro. Således kan utsätta celler för att OGD som en sekundär förolämpning till cellerna efter stretch efterlikna incidensen av TBI följt av ischemi. Därför, för att förbättra vår nuvarande in vitro modell av TBI och mönster så nära som möjligt till en faktisk TBI eftersom det sker in vivo, i framtiden kommer vi också anställa OGD i kombination med stretch skada.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tyska forskningsstiftelsen) under licensnummer FO 315/4- och Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtal nr HEALTH-F2-2009 till 241.778 till CF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Injury Controller II | Custom Design and Fabrication, Virginia, USA | ||
| Bioflex Culture Plate - Collagen Type I | Flexcell, Dunn Labortechnik | BF - 3001C | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
| L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
| MEM Vitamin | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
| Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
| Non-essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
| Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS) | Life Technologies | 12676-011 | |
| Trypsin-EDTA solution | PAA Laboratories | L11-004 | Storage: ≤ -15 °C |
| Image-iT DEAD Green | Life Technologies | I10291 | Storage: ≤ -15 °C, protected from light |
| Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) | Roche | 4744926001 | Storage: ≤ -15 °C |
References
- Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. The impact of traumatic brain injuries: a global perspective. NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).
- Morrison, B. III, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review. J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).
- Albert-Weissenberger, C., Sirén, A. L.
- Morrison, B., Elkin, B., Dollé, J. P., Yarmush, M. In vitro models of traumatic brain injury. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).
- Cargill, R. S., Thibault, L. E. Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma. J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).
- Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma. J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).
- Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes. J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).
- McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase. Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).
- Wanner, I. B., Deik, A., et al. A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth. Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).
- Wanner, I. B. An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity. Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).
- Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells. Brain Res. 1436, 1-12 (2011).
- Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons. Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).
- Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons. Science. 274, 1921-1923 (1996).
- Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).
- Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier. J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).
- Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).
- Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene. Cell. 62, 435-445 (1990).
- RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta. J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).
- Förster, C., Silwedel, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).
- Rubin, L. L., Hall, D. E., et al.
- Burek, N. M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J. Vis. Exp. (66), (2011).
- Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons. Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).
- Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).
- Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury. Crit. Care Med. , (2013).
- Werner, C., Engelhard, K.
- Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins. J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).
