Summary
השתלת מערכים מאורגנים של microwires לשימוש בקלטות אלקטרו יחידה אחת מציגה מספר האתגרים טכניים. שיטות לביצוע טכניקה זו ואת הציוד הדרוש מתוארות. כמו כן, השימוש מועיל של מערכי Microwire מאורגנים להקליט מאזורי משנה עצביים שונים עם סלקטיביות מרחבית גבוהה נדון.
Abstract
בקלטות אלקטרו vivo בערים, חיה מתנהגת לספק שיטה רבת עוצמה להבנת איתות עצבית ברמת התא הבודד. הטכניקה מאפשרת הנסיינים לבחון temporally ואזורי דפוסי ירי ספציפיים על מנת לתאם פוטנציאל פעולה מוקלט עם התנהגות מתמשכת. יתר על כן, ניתן לשלב הקלטות יחידה אחת עם שפע של טכניקות אחרות על מנת לייצר הסברים מקיפים של תפקוד עצבי. במאמר זה, אנו מתארים את ההרדמה והכנה להשתלת Microwire. בהמשך לכך, אנו למנות את הציוד הנדרש וצעדים כירורגיים להוספת מערך Microwire למבנה יעד מדויק. לבסוף, נתאר בקצרה את הציוד המשמש להקלטה מכל אלקטרודה בודדת במערך. מערכי Microwire הקבועים שתוארו מתאימים היטב להשתלה כרונית ולאפשר להקלטות אורך של נתונים עצביים בכמעט כל preparati התנהגותייםהלאה. אנחנו דנים בהתחקות מסלולי אלקטרודה לtriangulate עמדות Microwire כמו גם דרכים לשלב השתלת Microwire עם טכניקות immunohistochemical על מנת להגדיל את הספציפיות האנטומי של תוצאות שנרשמו.
Introduction
קלטות אלקטרו לאפשר למדענים לבחון את התכונות חשמליות של תאים ביולוגיים. במערכת העצבים המרכזית, שבו דחפים חשמליים לשמש כמנגנון איתות, ההקלטות הללו הן בעלי חשיבות מיוחדת להבנת תפקוד עצבי 1-2. במהלך הקלטות יחידה אחת במתנהג בעלי חיים, microelectrode שהוכנסה לתוך המוח היא מסוגלת להקליט את השינויים בדור של נוירון של פוטנציאל פעולה לאורך זמן.
בעוד טכניקות רבות מאפשרות אחד כדי להקליט את פעילות המוח, אלקטרופיזיולוגיה יחידה אחת היא אחת השיטות מדויקות ביותר על ידי המאפשר רזולוציה ברמת תא העצב היחיד. כאשר רמה גבוהה של ייחוד המרחבי היא רצויה, ניתן להשתמש microwires למקד תת גרעינים או הרכבים של תאים בתוך brain3 בדידים. הקלטות יחידה אחת גם ליהנות מרזולוציה גבוהה זמנית כמו הקלטות מדויקות ברמת המיקרו. ו, in vivoהקלטות בעקבות לאפשר אינטראקציות מעגל שלמות, עם הסביבה הטבעית של תחזיות מביא וefferent, כימי מערכתיות והשפעות הורמונליות, ופרמטרים פיסיולוגיים. אותות עצביים נגזרים מקלט חושי, התנהגויות מוטוריות, עיבוד הקוגניטיבי, כימיה של המוח / פרמקולוגיה, או שילוב כלשהו. בהתאם לכך, ההפרדה של השפעות חושיות, מוטורית, קוגניטיביים, וכימיות מחייבת ניסויים היטב הגה עם מקרים יעילים ובקרות שעשויות לאפשר הערכה של כל אחת מההשפעות האמורות. בסך הכל, הקלטות במתנהגים בעלי חיים מאפשרים הנסיינים להתבונן האינטגרציה של מספר רב של מקורות מידע בתוך מעגל תפקוד ולגזור מודל מקיף יותר של תפקוד במעגל.
הקלטות יחידה אחת סובלות גם ממספר החסרונות שלה כל ניסוי צריך להיות מודע. בראש ובראשונה, הקלטות יכולות להיות קשות לנהל. ואכן, מאפיינים של המגברי headstage דואר וmicrowires המושתלים המאפשרים לסגולית מרחב ובזמן בהקלטות אלה גם עושה הקלטות רגישות להשפעתם של אותות חשמליים חיצוניים (כלומר "רעש" חשמלי). בהתאם לכך, היכולת לפתור בעיות במערכת אלקטרו מחייבת הבנה טכנית מפותחת של עקרונות ומכשירי אלקטרו. כמו כן, חשוב לציין כי, בנסיבות מסוימות, אותות חשמליים שנרשמו בהקלטות תאית יכולים לייצג את הסיכום של אותות עצביים מרובים. יתר על כן, ההכללה של פעילות יחידה אחת לפעילות אוכלוסייה בתוך אזור יעד יכולה לעתים קרובות להיות מוגבלת על ידי מידת ההטרוגניות סלולרית בתוך אזור היעד (אך ראה 4 קרדן). לדוגמא, אלקטרודות עשויות להיות מוטות לכיוון הקלטת נוירונים פלט משרעת גבוהה במקום תאים אחרים. Interpretability של הקלטות יחידה אחת הוא גדלעל ידי שילוב הקלטות עם טכניקות אחרות, כולל, אך לא מוגבל ל, חשמל (orthodromic או antidromic), כימי גירוי (למשל iontophoretic או קולט מעצב) או optogenetic 4, inactivations העצבי זמני, בדיקות הסנסורית 5, נהלי ניתוק, או אימונוהיסטוכימיה 3.
בפרוטוקול שלהלן אנו למנות את החומרים וצעדים הדרושים כדי להשתיל מערך Microwire מאורגן בחולדה (למרות שהפרוטוקול יכול להיות מותאמים לשימוש במינים אחרים). ההליך והסגנון של מערכים קבועים המשמשים במעבדה שלנו הוכיחו אמינים להקלטות אורכי ויכולים לקיים את הקלטות מאותו תא העצב ללאורך הזמן של חודש אחד 6-8. זה עושה את זה הליך אידיאלי לבחינת תגובות phasic לגירויים ניסיוניים, שינויים פלסטיים בתגובות עצביות, או מנגנונים של למידה ומוטיבציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
יש לנקוט בזהירות רבה כדי לשמור על תנאים אספטיים (כפי שמתוארת במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה 9) בזמן הכנות ולביצוע ההליך הבא. הפרוטוקול הבא עומד במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושר על ידי הטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש המוסדי, אוניברסיטת רטגרס. הערכה היא כי ההליכים שלאחר מכן ידרשו 3-6 שעות כדי להשלים.
השתלת מערך Microwire:
- בעלי חיים מקום בהרדמה באמצעות 50 מ"ג / נתרן pentobarbital קילוגרם (IP) ולנהל 10 מ"ג / קילוגרם של ניטראט מתיל אטרופין (IP; glycopyrrolate ניתן להחליף) ופניצילין 0.25 מ"ג (300,000 U / ml im) כדי לשמור על תפקוד מערכת הנשימה ולמנוע זיהום , בהתאמה.
שים לב: עם אורך 3-6 שעות של ניתוח השתלה זו, נתרן pentobarbital משמש כי זה חסכוני ומגביל את החשיפה אנושיתהרדמה (כפי שעלול להתרחש בשימוש ממושך של חומרי הרדמה בגז) תוך מתן הרדמה לטווח ארוך. החלפה של חומרי הרדמה אחרות היא מקובלת. - ודא שההרדמה נקטה השפעת שימוש במבחן קמצוץ זנב לפני שתמשיך.
- במידת צורך, לתת לסירוגין זריקות של קטמין הידרוכלוריד (60 מ"ג / קילוגרם IP) ונתרן pentobarbital (5-10 מ"ג / קילוגרם IP) כדי לשמור על הרדמה במהלך הניתוח.
- לגלח את הקרקפת בעזרת להב סכין מנתחים # 22.
- לחטא את הקרקפת המגולחת עם יוד povidone.
- תן זריקות תת עורית של bupivacaine (~ 1 מ"ג / קילוגרם SC משתרע על פני 4 אתרי הזרקה) למקומיים להרדים את הקרקפת. לאפשר 5-10 דקות להרדמה המקומית ייכנס לתוקף.
- מקם סיכה עיניים על העיניים כדי לשמור על לחות במהלך הרדמה.
- אבטח את בעל החיים לתוך סורגי האוזן ומהדק האף של מנגנון stereotaxic.
- (לדוגמא: פס אופקי להשתמש בציוני דרך חזותיות על sterמסגרת eotaxic) לרמת הראש של החיה כ. צעד זה נועד רק לכ רמת הגולגולת.
- עושה חתך לאורך קו האמצע של הקרקפת בעזרת להב סכין מנתחים # 11 רכוב על בעל אזמל. החתך חייב להאריך מ ממש מאחורי האוזניים לחלק האחורי של עצם האף.
- בעזרת מרית לנתיחה, נקה את הגולגולת של כל הרקמות שנותרו עד שני רכסי גולגולת לרוחב ורכס הגולגולת האחורי כבר הגיעו.
- למשוך בחזרה את העור סביב החתך באמצעות מספר hemostats (6x).
- נקה את הגולגולת של כל דם ולאפשר לו להתייבש. אם דימום מתרחש שנותר, לסיים את דימום שיורי עם כלי צריבה קטנים. הבטחה כי הגולגולת נשארת נקייה ויבשה מאפשרת אקריליק השיניים השתמש בשלבים הבאים כדי לאגד את הגולגולת באופן קבוע.
- מארק גבחת ומבדה (איור 2 ד) על ידי ביון הצומת של תפרי הגולגולת. מיקרופון לנתחroscope יש צורך לסמן במדויק את העמדות הללו.
- צרף פריט קטן ומחודד (למשל סיכה או מקדח שיניים) לזרוע stereotaxic ומוריד אותה על מנת לקבוע את הגב / הגחון (DV) לתאם של גבחת ולמבדה.
- התאם את מהדק האף עד DV קואורדינטות עבור גבחת ומבדה נמצאים ב100 מיקרומטר (מ"מ 0.1) של כל אחד אחר.
- מפולס פעם, להקליט הקדמי / אחורי (AP), המדיאלי / רוחב (ML) וDV קואורדינטות של גבחת יחד עם העמדה של מהדק האף. בדוק את הקואורדינטות לדיוק, כמו את היתר של הניתוח תלוי במידת הדיוק של קואורדינטות אלה.
- השתמש בקואורדינטות שנמדדו כדי לחשב את ML ו AP קואורדינטות של ארבע כנפות היחסית "חלון גולגולת" לגבחת (כלומר פתיחת גולגולת; איור 1). חלון הגולגולת הוא מלבן ממוקם בדיוק דרכו מערך Microwire יעבור.
- השתמש בקואורדינטות מחושבת לציוןחלון גולגולת קואורדינטות בגולגולת באמצעות קובץ מצורף stereotaxic מחודד ודיו עט נובע. כדי לקבל סימנים מדויקים, חלים רק כמות קטנה של דיו ועד לקצה של כלי הסימון באמצעות מטוש צמר גפן.
- מקדחה מחלון הגולגולת על ידי הסרת העצם בסדרה של שכבות קטנות.
- התחל על ידי קידוח הפינות המסומנות של החלון שבו הסימנים הוצבו.
- בשלב הבא, לחבר את הפינות ולהתוות את החלון.
- לבסוף, לנקות את האזור בתוך המתווה יורד לעומק של מאטר הדורה. החור חייב להיות רחב יותר (כלומר משופעים) מתחת לשכבות השטחיות של הגולגולת כדי לוודא שהחלון שומר על רוחב מתאים מלמעלה עד למטה.
- השתמש microforceps כדי להסיר בזהירות שבבים כל עצם שנותר, פסולת, או מאטר הדורה בתוך חלון הגולגולת. שלב זה חשוב מאוד, כמו פיסות של חומר אלה יכולים לסכן את היושרה של המערך במהלך הורדה. פינו פעם אחת, צריך לשמור על החלון דואר לח עם מי מלח bacteriostatic לשארית הניתוח.
- הנח סימונים על הגולגולת למשך 5 ברגים בגולגולת וחוט קרקע 1 (איור 1). עמדות אלה ישתנו בהתאם לאזור המוחי הממוקד. Headstage תהיה מאובטחת ביותר, אם בורג אחד ממוקם על כל אחד 5 עצמות הגולגולת. הנח את שני ברגים בגולגולת וחוט קרקע במקומות שלא יפריעו למיקום מערך Microwire ב.
- לקדוח חורים לברגים בגולגולת ובלאבטח את הברגים במקום. ברגים חייבים להיות מושפלים עד שרק 3-4 אשכולות מראים (או, אם להשתמש בברגים אחרים מאלה מומלצים, עמוקים מספיק כדי לעבור את העובי של הגולגולת כדי לקדם את יציבות מערך, אבל לא עמוק מדי כדי לפגוע בקליפת המוח). נקה את האשכולות של הברגים לאחר ההשמה.
- לקדוח חור עבור חוט הקרקע. מנמיכים את החוט לאט (מעל 1-2 דק ') לDV היעד לתאם ולתקן את החוט במקום באמצעות אקריליק שיניים.
- להוסיף אקריליק סביב האשכולותשל הברגים בגולגולת. לפני מתייבש אקריליק, להסיר כל בטון עודף שזורם מחוט הקרקע או הברגים בגולגולת. לאפשר 15 דקות לאקריליק השיניים לייבוש / להקשיח.
- צרף את המערך לזרוע stereotaxic. רמת המערך ולכוון אותו כך שהוא ישר יעבור דרך הגבולות של חלון הגולגולת.
- הנח מלוח בחלון הגולגולת, כך שהוא ברמה עם הגולגולת. מנמיכים את המערך עד שהיא יוצרת גומה בתמיסת מלח. זה לתאם משמש כרמת גולגולת למערך. השתמש בערך זה כדי לחשב את DV הסופי לתאם של המערך.
- מנמיכים את המערך לאט עד שהוא מגיע DV הסופי שלה לתאם. עצור כל 1 מ"מ של הורדה ולחכות כמה דקות על מנת לאפשר לרקמת המוח להתאושש ממנקדת ולפרק את החלק התחתון של פוליאתילן גליקול (PEG) במערך (PEG משמש כדי לשמור את החוטים באופן זמני בקונפורמציה שלהם תוך הפחתה , ומתמוסס באיטיות במלח).
- כאשר המערך הוא 1 מ"מהרחק מהיעד, מוריד אותו באיטיות רבה יותר עד שיגיע ליעד הסופי. הפחתה ב0.1-0.2 מ"מ בכל פעם לפני שהוא מאפשר לרקמות לנוח לתקופה של 5 דק 'נועדה לשמר את הרקמה באתר היעד, כמו גם קשרים סינפטיים הפרוקסימלי. אם הציוד זמין, דיוק ההפחתה של המערך יכול להסתייע באמצעות מניפולטור ממונע.
- ממיסים את PEG שנותר ולהשתמש אקריליק שיניים כדי למלט microwires במקום. הוספת שכבות רבות של בטון כדי להבטיח את החוטים מאובטחים ולאחר מכן לאפשר 15-20 דקות לבטון להתקשות לפני שימשיך. הדבר מבטיח כי החוטים לא נדחקו מהמיקום הסופי שלהם.
- לבנות את שארית headstage של בעלי החיים באמצעות אקריליק שיניים. השתמש באקריליק כדי לשים בארגז ברגי גולגולת, חוט קרקע, ומחבר לmicrowires. לאפשר את כובע אקריליק להתקשות במידה מספקת לפני שתמשיך.
- תפר את החתך בקרקפת באמצעות תפרים נספגים ולנהל 2 מיליליטר of מלוחה bacteriostatic (sc) כדי לשחזר את הלחות מהניתוח.
- הסר את החיה מברי האוזן ולמקם את הנושא באזור נקי. שים לב לבעלי החיים לעתים קרובות במהלך ההחלמה שלאחר הניתוח עד ויסות חום והתנועה התאוששו. בעקבות התאוששות מהרדמה, להזיז את בעל החיים לתוך יחיד דיור לשארית של התאוששות לאחר ניתוח.
- תן חיות ניטור לאחר ניתוח יומי וטיפול בימים שלאחר ההליך. התאוששות מהליך זה היא אופטימלי כאשר שבעה ימים או יותר מותר.
- תן חיות זריקות של Carprofen (5mg/kg) וEnrofloxacin (5-10 מ"ג / קילוגרם) או מקביליהם במהלך התאוששות ללוח הזמנים מומלצים על ידי הווטרינר המטפל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתן למצוא רשימה של ציוד המשמשת את מעבדה זו להקלטת אותות אלקטרו בטבלה 3. בעקבות התאוששות מניתוח, אחת יחידות שנרשמו על ידי חיבור headstage אחדות רווח למחבר המושתל. headstage זה מחוברת באמצעות כבל למחלף, אשר מסוגל סיבוב חופשי ללא הפסקות בהקלטת אלקטרו באמצעות השימוש בטבעות חשמליות. מחלף מאפשר נושאים לנוע בחופשיות בזמן ההקלטה במהלך התנהגות, שהוא אחד מיתרונות העיקרון של הכנה זו. אז אותות מוזנים דרך מגבר (10x רווח) המשמש כדי להגביר את האות באופן דיפרנציאלי על כל אלקטרודה נגד רעש הסביבה על האלקטרודה נבחרה משום שהיא אינה תערוכת אות יחידה. הקלטות ההפרש משמשות כדי להגביר את ההבדל המיידי בין שני המתחים. מכיוון שגם החוטים להקליט רעש הסביבה כ באותה מידה, את התנגדותםקוטביות te יעילות לאפשר חיסור של רעש סביבה מהקלטות עצביות (איור 2). לבסוף, אותות הם להקה לעבור סינון (450 הרץ ל10 kHz; להתגלגל -1.5 dB / אוקטבה בקילוהרץ 1 ו -6 dB / אוקטבה ב11 קילוהרץ) ו700x המוגבר בטרם דיגיטציה באמצעות מחשב עם כרטיס A / D (תדר דגימת 50 קילוהרץ / חוט) ומאוחסן לשם ניתוח במצב לא מקוון.
בתוכנה, גל לעתים קרובות נדגמו באמצעות שיטת זיהוי סף. לפיכך, אותות שעוברים סף מתח נתון הם דיגיטציה ומאוחסנת. ובכל זאת, יש שיעור טבוע של שווא חיובי, שבו חפצים חשמליים לעבור את הסף, הסינון והגברת ההפרש, ונדגמים. הגל אינו עצבי אלה נגרעו לאחר מעשה באמצעות תוכנה למיון ספייק המאפשר פריקות נדגמו להיות מסודרות המבוססות על הפרמטרים שלהם (מתחים משרעת, שיא ועמק לדוגמא, וכו '.) ולאחר מכן מאפשר לחיסולה של אל"רעש" ectrical והבחירה של האות העצבית (איור 3). גל כלולים לניתוח אם 1) Waveforms הווה עם דפוסים הקנוני של פעילות עצבית, כולל פוטנציאל פעולה מוגדר וברור ואחרי hyperpolarization (איור 3; פנל מימין); 2) את המשרעת של גל תערוכות עצביות המשוערת לפחות אות 02:01 : יחס רעש (כלומר הוא באופן ברור להפרדה מהלהקה הרעש של הערוץ; המשרעת של להקת רעש = כ .. 50 μV); 3) פרמטרים יישארו יציבים לאורך כל הפגישה ו4) מרווח interspike (ISI) ההיסטוגרמה מראה שאין פריקות התרחשו בתקופה של נוירון הטבעי עקשן (כלומר ~ 2 אלפיות השני; איור 3 עזב פנל).
אז יכולות להיות בקורלציה פריקות עצביות עם אירועים התנהגותיים (למשל מנוף להגיב) שנרשמו כחותמות זמן באמצעות השימוש בקלט פלט דיגיטלי כרטיס (I / O). זמן אלהחותמות יכולות לשמש ליצירת היסטוגרמות זמן פרי אירוע (PETHs; איור 4 א), המשמשים להצגת פריקות עצביות המתרחשות בטווח זמן מוגדר סביב אירוע התנהגותיות מסוים. המעבדה שלנו בדרך כלל בחנה ירי עצבי בסדר הגודל של שעות (טוניק 10), דקות (איטי Phasic 11), ושניות / אלפיות שנייה (Rapid-Phasic 12). ירי טוניק משמש בדרך כלל לבדיקת האירועים הגלובליים ביותר בפגישה. לדוגמא, לעתים קרובות אנו משתמשים בזה כדי להשוות את שיעורי ירי של נוירונים כאשר בעלי חיים הם סמים ניהול עצמיים, כלומר predrug לעומת שיעורי ירי בסמים. ניתוחי phasic איטיים משמשים לעתים קרובות כדי לבחון את הירי במהלך אירועים איטיים משתנים כמו הריקבון התרופתי של תרופה על פני דקות. לבסוף, ניתוחי phasic מהירים משמשים לאירועים מיידיים יותר כמו תגובה אופרנטית או תחילתה של קיו ניסיוני.
איור 4 מראה היסטוגרמה של ירי טוניקעם ספירה של פריקות ב30 פחים שני על פני כל הקלטה בקוק מנהל עצמי. תא הדוגמא המוצג הוא רגיש לשינויים ברמות גוף של קוקאין והופך עכבות (איור 4 א) כרמת גופו של בעל החיים של עליות קוקאין (איור 4), אבל חוזר לקצב הירי המקורי שלה כרמה של קוקאין נופל לאחר עצמי מקרי ממשל הסתיימו. בהתאם לאזור היעד, הנוירונים עשויים להיות רגישים להשפעות תרופתיים, או כל מספר של אירועים התנהגותיים כוללים רמזים הקשורים לתגמול 6, קלט חושי 13, או גישת מוטיבציה 3.
בתנאים הנכונים, זה אפשרי להקליט את אותו נוירון לפגישות רבות. בסטריאטום, הנוירונים מופצים בצורה הומוגנית (80% מחוטי התשואה רק יחידה אחת ותאים אינם שכבתיים או מקובצים בחוזקה) ולייצר אותות קטנים יחסית שאובה ריקבון במהירותמרחק r. בתנאים אלה, במעבדה שלנו כבר מסוגל להקליט את אותו נוירון בסטריאטום במשך שבועות רבים. חשוב מכך, לא ניתן לאמת את כל הנוירונים על פני פגישות ולא כל הנוירונים נשמרים לאורך זמן. קביעת יכולתו של אדם לקבל סוגים אלה של הקלטות אורך דורשת בדיקה מדוקדקת של מערכת אלקטרו. לדוגמא, ניתן להעריך את מרחק ההקלטה של microwires באמצעות אלקטרודות במצב נסיעה. כשנחשב לצד התכונות הפיסית של החוטים, אנטומיה האזורית, ופרמטרי צורת הגל של הנוירון על פני פגישות, אפשר לקבוע בביטחון סביר שגל נשמר על פני מפגשי 7,8,13.
איור 1. Representative מיקומים עבור "חלון הגולגולת" (כלומר פתיחת גולגולת), ברגים בגולגולת, וחוט קרקע. א) ראייה הגבי של הגולגולת המראה את המיקום של בורג גולגולת על כל צלחת של הגולגולת (אדום), חלון גולגולת (מרובע), וחור נגדי לחוט האדמה (ירוק). כאשר מתכננים את חלון הגולגולת, צריכה להיות מוגדר על ידי קביעת נקודות הציון B) קדמית ו-C) המדיאלי אחורית וקואורדינטות רוחב לאזור היעד (למשל dorsolateral הסטריאטום). ד) לאחר מכן ניתן להשתמש נקודות ציון אלה כדי לקבוע את המיקום של החלון על פני השטח הגבי של הגולגולת. שים לב שחלון הגולגולת תואם את המטרות המדיאלי ו לרוחב זוהו בB ו-C וגם משתרע על פני הטווח שצוין במישור anteroposterior בין B ו-C. נקודות ציון אלה יהיו ספציפיים לכל אזור יעד בודד. loca נציגtions של microwires במערך 2 x 8 מוצג באמצעות נקודות קטנות בתוך חלון הגולגולת מוצג בD. Dorsoventral הסופי לתאם של החוטים יהיה תלוי בעומק שאליו הם הורידו. דמויות שונה מפקסינוס & 14 וטסון. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. המחשה של התהליך של הגברה ההפרש. הפנל העליון מייצג אות עצבית לפני דיפרנציאלי הגברה (אות + רעש). הגברה ההפרש הבא, חשמל אותות זרים הנמצאים על כל הערוצים (הרעש; פנל באמצע) יכולים להיות מופחתים באופן יעיל מwi ההקלטהמיל באמצעות השימוש באלקטרודה ההפרש שצוינה על מנת לשפר את הבידוד של צורת הגל העצבית (אות; פנל תחתון).
איור 3. צורת גל עצבי דוגמא (מימין) נרשמה מחוט אחד של מערך Microwire. היסטוגרמה (משמאל) מציגה את מספר פוטנציאלי פעולה באלפיות השניים שקדמו לכל אחד שנצפה פריקה עצבית בפגישה. כל סל מייצג תקופה אלפית שנייה 1. היסטוגרמה מוכיחה כי אין פוטנציאל פעולה התרחש בתקופה של נוירון הטבעי עקשן (2 אלפיות השנייה).
דמות4. דוגמא של נוירון כי הוא מעוכב tonically במהלך קוקאין מנהל עצמי.) קצב הירי (Spikes/30 שניות) של תא עצב על פני מושב קוקאין מנהל עצמי ארוכת גישה ב30 פחים שני. ב ') מתאים רמת תרופה מחושבת על פני אותה הפגישה. בשילוב, עלייה ברמת תרופה מתואמת עם דיכאון בירי עצבי. בהתאם לכך, כאשר הפגישה מסתיימת ב ~ 425 דקות, ירי עצבי מתאושש כמו רמות גוף של קוקאין סתיו.
איור 5. פרוסות היסטולוגית משני בעלי חיים עם שתלי Microwire. א) סעיף Nissl מוכתם באמצעות אדום ניטראלי בשילוב עם כתם נגדי של ברזל אשלגן חושף טיפים lesioned Microwire (כחולה).Microwire ניתן לייחס מקליפת המוח עד קצות החוט (הכחול) על ידי ביצוע השירים חוט ברקמה. מסלולים ניתן לאתרו בפרוסה אחת או סדרה של פרוסות סמוכות. ב ') סעיף המוכתם לחומר P, אשר חושף את pallidum הגחון, יחד עם כתם נגדי של ברזל אשלגן. באמצעות שימוש בטכניקות immunohistological, יכולים להיות מקומיים מיקרו חוטים בודדים בתוך אזורים מסוימים במוח, או אפילו בתוך תת אזורים הספציפיים של גרעין מסוים. איור מראה קצה Microwire (כחול) המקומיים בתוך pallidum הגחון באמצעות כתם החומר P.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הקלטות תאיים מייצגות טכניקה ניסויית רבת עוצמה שניתן לשלב כמעט כל הכנה ניסיונית במדעי המוח. חוטים שכבר מושתלים במערכים מאורגנים יכולים להיות במעקב כפירים שלהם עוברים דרך המוח ולאזור היעד שלהם (איור 5 א). כאשר נגע קטן, שלאחר ניסוי נוצר בקצה Microwire noninsulated ליצור הפקדת ברזל קטנה מחוט הנירוסטה, אפשר דווקא לסמן את המיקום של קצה Microwire מבודד (שבו היחידה אחת נרשמה) באמצעות פתרון 5% של ברזל אשלגן ו10% HCl (5A דמויות ו5B; נקודות כחולות). לכן, אפשר בקלות להשתמש בשורה של פרוסות מוח שלאחר מכן ליצור מחדש את עמדתו של כל המערך בתוך המוח. לבסוף, הטכניקות שהוזכרו לעיל ניתן לשלב בקלות עם אימונוהיסטוכימיה על מנת להגדיל את הספציפיות המרחבי של הקלטות, כדיכדי לאמת את מיקומי יעד, ואפילו כדי ללמוד הבדלי subregional בתוך גרעין מטרה אחת 3 (איור 5).
כדי להשיג את הספציפיות המרחבית הרצויות, מערכי Microwire צריכים להיות מתוכננים ומושתל בזהירות. בראש ובראשונה, את הריווח של השורות ועמודות בתוך המערך חייב להיות מתוכנן באופן ספציפי לאזור של עניין. מערכים כי הם ארוכים מדי או רחבים ליעד הרצוי יכולים להקטין דיוק או לייצר מספר רב של חוטים שנופלים על הגבול בין שני גרעינים סמוכים. במקביל, microwires מרווחים מדי בשיתוף פעולה הדוק יכול לאסור תיחום נפרד של כל אלקטרודה. שנית, מערכי Microwire חייבים להיות מטופל בזהירות על מנת לשמור על שלמותו של המערך. מערכי אלקטרודה בודדים מיוצרים באמצעות חוטים שעלולים להיפגע בקלות או נדחקו מהתצורה שלהם, כאשר יצרו קשר עם דקים, דמוי שיער. האיכויות של חוטים אלה הן אידיאליים לצמצום הנזק to רקמות בדרך גישה ליעד של אחד וגם לאפשר את החוטים כדי להעביר בתיאום עם תנועות קטנות של המוח. לכן, זה בדרך כלל מומלץ לאחסן מערכים במקום בטוח ולהימנע מהסרת מערכים ממקרים המגן שלהם עד ממש לפני ההשתלה. כמו כן, יש לנקוט בזהירות בעת חיטוי מערכי Microwire. במקרים מסוימים, מעוקר של אלקטרודות עשוי להיות מקובל. עם זאת, חיטוי אתילן אוקסיד או UV עשוי להיות עדיף כדי להגן על מערכים שבירים. לבסוף, מתכת האלקטרודה והבידוד, וקוטרו של כל אחד, יש לשקול בזהירות. לדוגמא, רק אלקטרודות המכילות ברזל (כגון נירוסטה) תהיה מסוגלים לייצר תגובות כחול פרוסים לתיחום אישי של כל Microwire במערך.
בהזדמנות, microwires במערך יהיה לסטות מהתצורה שלהם בהפחתה בשל חסימות מעיניהם (למשל שברים בגולגולת בחלון הגולגולת) או חה עניndling. במקרים אלה, Microwire כאלה יכולים לעתים קרובות עדיין להיות במעקב לקצו (על אף שהוא צפוי להיות מחוץ לאזור היעד). צריך למשל מצבים שבם כל Microwire ממוספר במערך לא ניתן לאמת, חשוב לתקינותו של הניסוי שחיה זו תמחק מבסיס הנתונים. פירוש לא נכון של העמדה של Microwire אדם יכול לאפשר אותות העצביים שלה כדי לסבך או פרשנות מושחתת של הנתונים.
במהלך השתלה, הדיוק של חלון הגולגולת ויישור מערך הוא קריטי גם כדי למקד את הדיוק. חלונות גולגולת חייבים להיעשות רחב מספיק כדי לאפשר את המערך להעביר בלי כיפוף או חוטים מזיקים. מצד השני, החלון משמש גם כדי להנחות את המערך למיקום היעד באופן מדויק ולכן יש קדח בדייקנות בכל ממד. כאשר מוכן להשתלה, צריך גם להיות בטוח שהמערך הוא אנך עם חלון הגולגולת בכל הממדים. כלומר,הטיה קלה של המערך בכל ממד יכולה לגרום למערך או באופן חלקי או באופן מלא להחמיץ את גרעין היעד. לבסוף, יש לנקוט זהירות מיוחדת בעת ההורדה במ"מ 1-3 הראשון. זה במהלך ראשוני הפחתה שחתיכות של פסולת שנעלמו מעיניהם בתוך חלון הגולגולת יכולות להתפשר על היושרה של המערך ולהרגיז את הנתיב של microwires. אם הנתיב של microwires חסום בזמן שהם הורידו באיטיות, ניתן לראות עיקול microwires או קשת תחת הגדלה קלה לפני המערך ייגרם כל נזק (למשל באמצעות זכוכית מגדלת). בשלב זה, יכול להיות חזר microwires ופסולת ניתן לפנות מהחלון לפני שתמשיכי עם ההשתלה.
ואחרון חביב, השתלה מוצלחת של מערכי Microwire דורשת תשומת לב מיוחדת לשמירה על חדר ניתוח אספטיים ומתן טיפול שלאחר ניתוח מעמיק. בשילוב עם אמצעי הזהירות שהוזכר לעיל, ניתן להשיג הקלטות מקיימאאזורים של עניין לכלפי מעלה של חודש אחד, יש לנו לאמת את ההקלטות עד 40 ימים לאחר ניתוח 6. ואולי הכי חשוב, את תוחלת החיים של הקלטות אלה מספק ההזדמנות ללמוד מעגלים תפקודיים בדידים בתוך הסביבה המורכבת של חשמל, כימי, והשפעות הורמונליות ולענות על שאלות חיוניות על תפקידם של מעגלים אלה בלמידה ובמוטיבציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לשימוש בסמים מעניק DA 006,886 (MOW) והתובע 032,270 (DJB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. List of Surgical Materials. | |||
| Gauze | Fisher (MooreBrand) | 19-898-144 | |
| Cotton Swabs | Fisher (Puritan) | S304659 | |
| Nembutal (Pentobarbital) | Sigma Aldrich | P3761 | |
| Atropine Methyl Nitrate | Sigma Aldrich | A0382 | |
| Baytril (Enrofloxacin) | Butler Shein (Bayer) | 1040007 | |
| Ketamine Hydrochloride | Butler Shein | SKU# 023061 | |
| Betadine (Povidone-Iodine) | Fisher (Perdue) | 19-066452 | |
| Stereotax | Kopf | Model 900 | |
| Cauterizing Tool | Stoelting | 59017 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ445 | |
| Dental Drill | Buffalo | 37800 | |
| Bacteriostatic Saline | Bulter Schein | 8973 | |
| Jewlers Screws | Stoelting | 51457 | |
| Microwire Array | Microprobes | Custom (Flexible) | |
| Ground Wire | Omnetics | Custom Plug | |
| Dental Acrylic | Fisher (BAS) | 50-854-402 | |
| Absorbable Sutures | Fisher (Ethicon) | NC0258473 | |
| Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant) | Fisher (Henry Schein) | 008897 | |
| Table 2. List of Surgical Instruments. | |||
| 2x Microforceps | George Tiemann Co. | #160-57 | Multi-use (e.g. clearing debris in skull window) |
| 2x Forceps | George Tiemann Co. | #160-93 | Multi-use (e.g. tying sutures) |
| 6x Hemostats | George Tiemann Co. | #105-1125 | Clamp and open incision |
| 1x Small scissors | George Tiemann Co. | #105-411 | Cut sutures after tying |
| 1x Tissue forceps | George Tiemann Co. | #105-222 | Holding tissue while suturing |
| 1x Needle holder | George Tiemann Co. | #105-1259 | Holding suture needle |
| 1x Scalpel holder (with #11 blade) | George Tiemann Co. | #105-80 (w/ #105-71 blade) | Making skull incision |
| 1x #22 Scalpel blade | George Tiemann Co. | #160-381 | Shaving scalp |
| 1x Surgical Spatula | George Tiemann Co. | #160-718 | Scraping skull to clear tissue on skull |
| Machine/Jewelers Screws | Various | N/A | 0/80 x 1/8” |
| Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals. | |||
| Microwire Array & Connector | Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) | N/A (Part No. based on array characteristics) | Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc. |
| Unity-Gain Harness/Headstage | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1200 | Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals. |
| Commutator (and Optional Fluid Swivel) | Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) | SL18C | Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp |
| Pre-amplifier | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1198 | Differentially amplifies neural signals against a reference electrode. |
| Filter and Amplifier | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1199 | Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal. |
| Acquisition Computer | EnGen (Phoenix, AZ) | N/A (Custom Build) | Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition. |
| A/D Card | Data Translation (Marlboro, MA) | DT-3010 | Digitizes neural signals for computer sampling. |
| Digital I/O Card | Measurement Computing (Norton, MA) | PCI CTR-05 | Acquires behavioral inputs and outputs |
References
- Carter, M., Shieh, J. C. Electrophysiology In: Guide to research techniques in neuroscience. , Academic Press. (2009).
- Aston-Jones, G., Siggins, G. R. Electrophysiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. Kupfer, D., Bloom, F. E. , Raven Press. (1995).
- Root, D. H., et al. Differential roles of ventral pallidum subregions during cocaine self-administration behaviors. J. Comp. Neurol. 521 (3), 558-588 (2013).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. (3-4), 106-103 (2012).
- Ma, S., et al. Amphetamine's dose-dependent effects on dorsolateral striatum sensorimotor neuron firing. Behav. Brain Res. , (2013).
- Ghitza, U. E., et al. Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine. J. Neurosci. 23 (19), 7239-7245 (2003).
- Tang, C., et al. Changes in activity of the striatum during formation of a motor habit. Eur. J. Neurosci. 25 (4), 1212-1227 (2007).
- Tang, C., et al. Dose and rate-dependent effects of cocaine on striatal firing related to licking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 324 (2), 701-713 (2008).
- Fabbricatore, A. T., et al. Electrophysiological evidence of mediolateral functional dichotomy in the rat accumbens during cocaine self-administration: tonic firing patterns. Eur. J. Neurosci. 30 (12), 2387-2400 (2009).
- Root, D. H., et al. Slow phasic and tonic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 66 (2), 106-127 (2012).
- Root, D. H., et al. Rapid-phasic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 64 (9), 704-713 (2010).
- Tang, C. C., et al. Decreased firing of striatal neurons related to licking during acquisition and overtraining of a licking task. J. Neurosci. 29 (44), 12952-12961 Forthcoming.
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (1997).
