Summary
シングルユニット電気生理学的記録で使用するためにマイクロワイヤの組織化された配列を移植することは技術的な課題の数を示します。必要に応じてこの技術及び設備を実施するための方法が記載されている。また、高い空間選択性の異なる神経サブリージョンから録音するために組織さMICROWIREアレイの有益な使用が議論されている。
Abstract
覚醒のin vivo電気生理学的記録では 、挙動の動物は、単一細胞レベルでの神経シグナリングを理解するための強力な方法を提供する。技術は実験者が進行中の行動で記録活動電位を相関させるために、時間的および地域固有の発火パターンを調べることができます。また、単体の記録は、神経機能の包括的な説明を生成するための他の技術の過多と組み合わせることができる。本稿では、マイクロワイヤ移植のための麻酔と準備について説明します。その後、我々は正確にターゲット構造にマイクロワイヤ配列を挿入する必要が機器や手術ステップを列挙。最後に、簡単に、アレイ内の個々の電極から記録するために使用される装置を記載している。した固定マイクロワイヤアレイは、慢性移植のためによく適しており、ほぼすべての行動preparatiの神経データの縦方向の録音を可能にしている上。我々は、マイクロワイヤーの位置、並びに記録された結果の解剖学的特異性を高めるために、免疫組織化学的技術を用いて、マイクロワイヤー注入を結合する方法を三角測量する電極トラックをトレース議論する。
Introduction
電気生理学的記録は、科学者が生物細胞の電気的特性を調べることができます。電気インパルスは、シグナル伝達機構として働く中枢神経系では、これらの記録は、神経機能1-2を理解するために特に重要である。動物に挙動における単体の記録時には、脳内に挿入された微小電極は、経時的に活動電位のニューロンの発生における変化を記録することができる。
多くの技術は、一つは、脳の活動を記録することを可能にしながら、単一ユニット電気生理学は、単一ニューロンレベルでの解像度を可能にする最も正確な方法の一つである。空間的な高度の特異性が望まれる場合、マイクロワイヤは、別個のサブ核またはbrain3内の細胞のアンサンブルを標的化するために使用することができる。記録はマイクロ秒レベルで正確であるように単一ユニットの録音は、高時間分解能の恩恵を受ける。そして、in vivoでの Aウェイク記録は求心性と遠心性投射、全身化学·ホルモンの影響、および生理学的パラメーターの自然環境で、完全な回路の相互作用を可能にします。神経信号は、感覚入力、運動行動、認知処理、神経化学/薬理学、又はいくつかの組み合わせに由来する。したがって、感覚、運動、認知、および化学的影響の分離は、前述の影響のそれぞれの評価を可能にすることができる効果的な偶発事象およびコントロールとよく練られた実験を必要とする。すべてのすべてで、行動する動物での記録は、実験者が機能回路内に複数の情報源の統合を観察し、回路機能のより包括的なモデルを導出することができます。
単体の記録は、任意の実験者が注意すべき多くの欠点に悩まされている。まず第一に、記録は行うことが困難な場合があります。確かに、目の特性Eヘッドステージアンプとこれらの録音の空間的および時間的な特異性を可能に注入されたマイクロワイヤは、また余分な電気信号（ すなわち 、電気的な「ノイズ」）の影響を受け記録が受けやすくなります。したがって、電気生理学的システムの問題をトラブルシューティングする機能は、電気生理学的原理と装置のよく発達した技術的な理解を必要とする。これは、特定の状況下では、細胞外記録で記録された電気信号は、複数の神経信号の和を表すことができることに留意することも重要である。また、標的領域内の人口活性に対する単一ユニット活動の一般化は、しばしば（しかし、カルダン4を参照）、標的領域内の細胞の不均一性の程度によって制限することができる。例えば、電極は、他の細胞の代わりに高振幅出力ニューロンを記録に向かって付勢され得る。シングルユニット記録の解釈可能が高くなる含むが、これらに限定されていない他の技術との録音を組み合わせることにより、（順行または逆行性）電気的、化学的（ 例えばイオン導入やデザイナー受容体）またはoptogenetic刺激4、一時的な神経不活化、感覚検査5、切断手順、または免疫組織化学3。
（プロトコルは他の種における使用に適合させることができるが）我々は、ラットで編成マイクロワイヤ配列を移植するために必要な材料と手順を列挙し、次のプロトコルでは。我々の研究室で使用される固定配列の手順とスタイルは、縦のレコーディングのために信頼性が実証されていると1ヶ月以上の時間6-8に同じニューロンの録音を維持することができる。これは実験的な刺激、神経応答のプラスチックの変更、または学習やモチベーションのメカニズムに相性の応答を調べるため、この手順に最適です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
の準備をして、次の手順を行いながら（9実験動物の管理と使用に関する指針に記載されているように）細心の注意は、無菌状態を維持するために注意する必要があります。次のプロトコルは、実験動物の管理と使用に関する指針に適合していると制度動物実験委員会、ラトガース大学によって承認されている。それは、その後の手続きが完了するまでに3-6時間を必要とするであろうと推定されている。
マイクロワイヤアレイを注入する。
- 場所麻酔下の動物50 mg / kgのペントバルビタールナトリウム（腹腔内）を用い、アトロピンメチル硝酸塩10 mg / kgでの投与（IP、グリコピロレートが置換されてもよい）及び0.25mgのペニシリン（300,000 U / mlの筋肉）呼吸機能を維持し、感染を予防するであった。
注：それは費用対効果があるとする人への暴露を制限するので、この移植手術の3-6時間の長さは、ペントバルビタールナトリウムが使用されている麻酔（ガス麻酔薬の長期使用で発生する可能性のあるように）、まだ長期的な麻酔を提供しながら。他の麻酔薬の置換が許容される。 - 麻酔が進む前に、テールピンチテストを用いて実施されたことを確認します。
- 必要に応じて、手術全体で麻酔を維持するために、塩酸ケタミン（60 mg / kgのIP）をペントバルビタールナトリウム（5-10 mg / kgのIP）の注射を交互に与える。
- ＃22手術用メスの刃を使用して頭皮を剃る。
- ポビドンヨードで剃毛頭皮を消毒。
- ローカルでブピバカイン（〜1ミリグラム/ 4の注射部位kg以上のSCスプレッド）の皮下注射を与え、頭皮を麻酔。有効にするには、局所麻酔薬のための5〜10分を許可します。
- 麻酔中に水分を維持するために、目の上の眼用潤滑剤を配置します。
- 耳のバーや定位固定装置のノーズクランプに動物を固定します。
- STER上の視覚的なランドマークを使用します（ 例：水平バーおよそ動物の頭を水平にeotaxicフレーム）。この手順は、 ほぼ同じ高頭蓋骨に意味される。
- メスホルダーに装着＃11手術用メスの刃を使用して頭皮の正中線に沿って切開する。切開は鼻の骨の後方部分にだけ耳の後ろから拡張する必要があります。
- 両側頭骨の尾根と後頭骨の尾根に到達されるまで、解剖スパチュラを使用して、残りのすべての組織の頭蓋骨をオフにします。
- 止血鉗子（6X）の番号を使用して切開の周りの皮膚を引き戻す。
- 任意の血液の頭蓋骨をきれいにし、それを乾燥させます。残りの出血が発生した場合、小さな焼灼ツールで残留出血を終了します。頭蓋骨は、清潔で乾燥したままであることを保証することは、その後の工程で使用した歯科アクリルが永久に頭蓋骨に結合することを可能にする。
- 頭蓋骨の縫合糸の交点を補間することにより、マークブレグマとラムダ（ 図2D）。解剖MICroscope正確にこれらの位置をマークする必要がある。
- 定位腕に小さな尖ったアイテム（ 例えばピンまたは歯科用ドリルビット）を添付し、背側/腹側（DV）を決定するためにそれを下げるブレグマとラムダの座標。
- DVはブレグマとラムダの座標までのノーズクランプを調整し、互いの100ミクロン（0.1ミリメートル）の範囲内にある。
- 一度平準化、（ML）、内側/外側前方/後方（AP）を、記録し、DVが鼻クランプの位置と一緒に前頂の座標。手術の残りは、これらの座標の精度に依存するため、精度の座標を再確認。
- MLとAPはブレグマ"頭蓋骨窓「相対（; 図1 すなわち開頭）の四隅の座標を計算するために測定された座標を使用しています。頭蓋骨のウィンドウには、マイクロワイヤ配列が通過する正確に位置決め長方形です。
- マークする計算された座標を使用頭蓋骨のウィンドウには、尖った定位アタッチメントと万年筆のインクを使用して頭蓋骨上の座標。正確なマークを取得するために、綿棒を用いて、マーキング工具の先端にインクが少量しか適用する。
- 小さな一連の層に骨を除去することにより、頭蓋骨の窓の外をドリル。
- マークが置かれているウィンドウのマークされたコーナーを掘削することから始めます。
- 次に、コーナーを接続して、ウィンドウの概要を説明します。
- 最後に、明確な硬膜の深さまでのアウトライン内の領域が不足しています。穴は、ウィンドウ上から下への適切な幅を維持することを確実にするために頭蓋骨の表層下の（ すなわち面取り）幅でなければなりません。
- 慎重に頭蓋骨のウィンドウ内に残っている骨片、破片、または硬膜を除去するためのマイクロピンセットを使用しています。材料のこれらのビットが低下中にアレイの整合性を損なう可能性があり、このステップでは、非常に重要です。クリアすると、1は、THを維持する必要があります手術の残りのための静菌生理食塩水で湿ったEウィンドウ。
- 5頭蓋骨のネジと1アース線用の頭蓋骨の上に置いてマーキングします（ 図1）。これらの位置は、標的脳の領域に依存して変化する。 1ネジが5頭蓋骨のそれぞれの上に配置されている場合ヘッドステージは最も安全になります。 MICROWIREアレイの配置を妨げない場所に頭蓋骨のネジとアース線の両方を配置します。
- 頭蓋骨ねじ用の穴をドリルダウンし、所定の位置にネジを固定します。ネジ（皮質を損傷するほど、アレイの安定性が、あまりにも深くないを促進するための頭蓋骨の厚さを通過するのに十分な、推奨、深いもの以外のネジを使用している場合、または）は3-4のスレッドが表示されるまで下げなければならない。配置後のねじのねじ山を清掃してください。
- アース線用の穴を開けます。ターゲットDV座標と歯科アクリルを使用して所定の位置にワイヤーを固定するために（1〜2分かけて）ゆっくりとワイヤーを下げます。
- スレッドを中心にアクリルを追加頭蓋骨のネジ。アクリルが乾燥する前に、先にアース線や頭蓋骨のネジから流れて余分なセメントを除去します。 /硬化を乾燥させる歯科アクリルのために15分を許可します。
- 定位腕に配列を添付してください。配列を水平にし、それを真正面から頭蓋骨のウィンドウの境界を通過するようにそれを向けます。
- それは頭蓋骨と同じ高さになるように頭蓋骨ウィンドウに生理食塩水を入れます。それは生理食塩水にディンプルを作成するまで、アレイを下げます。この座標は、アレイ用の頭蓋骨レベルとして使用されている。最終的なDVは、配列の座標を計算するために、この値を使用します。
- それは最終的なDVが座標に到達するまで徐々に配列を下げます。下降の各1ミリメートルを停止し、脳組織がディンプリングから回復するために、アレイ上にポリエチレングリコール（PEG）の底部を溶解することを可能にするために、数分間待つ（PEGが下降中に一時的にそれらの立体構造でワイヤを保持するために使用されているなど）、生理食塩水にゆっくりと溶解する。
- 配列は1ミリメートルであるとき最終的な目標に到達するまでターゲットから離れ、もっとゆっくり下ろします。組織を5分間休まを許可する前に、一度に0.1〜0.2ミリメートルで低下は、標的部位、ならびに近位シナプス結合の組織を維持することを意図している。機器が利用可能な場合、アレイの低下を精度電動マニピュレータを用いて支援することができる。
- 残りのPEGを溶解し、所定の位置にマイクロワイヤを固めるための歯科アクリルを使用しています。電線が安全であることを確認してから先に進む前に硬化させるセメント15〜20分を可能にするために、セメントの複数の層を追加します。これは、ワイヤがその最終的な配置からもまれないことを保証します。
- 歯科アクリルを使用して、動物のヘッドステージの残りの部分を構築する。頭蓋骨のネジ、アース線、およびマイクロワイヤ用のコネクタを包むためにアクリルを使用しています。アクリル帽子は先に進む前に、十分に硬化することができます。
- O吸収性縫合糸を使用して頭皮の切開を縫合し、2ミリリットルの管理手術から水分補給を復元するために、Fの静菌水（SC）。
- 耳·バーから動物を削除し、清潔な場所で、被写体を配置。体温調節と運動が回復するまで、手術後の回復中に頻繁に動物を観察します。麻酔から回復後、手術後の回復の残りのための単一筐体に動物を移動します。
- 動物の手順に従って日間で毎日、術後のモニタリングとケアを与える。 7日以上が許可された場合、この手順からの回復は最適である。
- 担当獣医が推奨するスケジュールに従って、リカバリ中の動物のカルプロフェン（5mg/kgの）およびエンロフロキサシン（5-10 mg / kg）を、あるいはそれと同等の注射を与える。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
電気生理学的信号を記録するために、この研究室で使用される機器の一覧を表3に見出すことができる。手術からの回復に続いて、単一ユニットが移植されたコネクタにユニティゲインヘッドステージを差し込むことによって記録されている。このヘッドステージは、電気スリップリングの使用を介して電気生理学的記録の中断なしに自由回転が可能である整流子にケーブルを介して接続されている。整流子は、この準備の原則利点の一つである行動、中に記録しながら、被験者が自由に移動することができます。信号は、それが単位信号を示さないので、示差的に選択された電極上に周囲雑音に対する各電極上の信号を増幅するために使用される前置増幅器（10×増幅率）を介して供給される。差分記録は、2つの電圧の瞬間的な差を増幅するために使用される。両方のワイヤは、ほぼ等しく、そのopposiを、周囲の騒音を記録しているためTEの極性を効果的に神経記録から周囲の雑音を減算します（ 図2）を有効にします。最後に、信号は、バンドパスフィルタ（10 kHzまで450 Hzの、11 kHzで1 kHzと-6デシベル/オクターブで-1.5デシベル/オクターブのロールオフ）されると、A / Dカードを持つコンピュータを使用してデジタル化される前に、700Xを増幅した（50 kHzのサンプリング周波数/線）とオフライン分析のために保存。
ソフトウェアでは、波形は、多くの場合、閾値検出方法を用いてサンプリングされる。従って、所定の電圧閾値を通過する信号は、デジタル化され、記憶される。それでも、電気的アーチファクトが閾値、フィルタリングおよび差動増幅を通過し、サンプリングされた偽陽性の固有の速度がある。これらの非神経波形（。 などなど 、振幅、ピークと谷の電圧）をサンプリング放電がそのパラメータに基づいてソートすることができますスパイクソーティングソフトウェアを使用して事後減算され、その後、ELの排除を可能にしているectrical「ノイズ」と、神経信号の選択（ 図3）。波形1 if分析のために含まれています）、明確に定義された活動電位などの神経活動の標準的なパターンで存在し、過分極後の波形（ 図3;右パネル）、少なくとも2時01分、信号の推定神経波形展示2）振幅：信号対雑音比（ すなわち、明らかに、チャネルのノイズ·バンドから分離可能であり、ノイズの帯域の振幅は=約.. 50μV）、ヒストグラムはない放電が発生していないことを示しています3）パラメータ、セッション全体を通して安定したまま、4）スパイク間間隔（ISI）ニューロンの自然耐火期間中（ すなわち 〜2ミリ、 図3は、左パネル）。
神経の放電は、デジタル入出力（I / O）カードの使用を介してタイムスタンプとして記録される行動事象（ 例えばレバー応答）と相関させることができる。これらの時間、特定の行動イ ベントの周りに指定された時間範囲で起こるニューロンの放電を表示するために使用され、スタンプが周囲イベント時間ヒストグラム（ 図4A PETHS）を作成するために使用することができる。当研究室では、通常、時間（トニック10）、分（スロー相性11）、および秒/ミリ秒のオーダー（急速相性12）に、神経発火を検討しています。トニック焼成は、通常のセッションの中で最も世界的なイベントを調べるために使用されている。動物が自己の投与薬剤、 すなわちプレドラッグに対するオン薬発火頻度である場合など、私たちはしばしば、ニューロンの発火率を比較するために、これを使用しています。遅相の分析は、多くの場合、分かけて薬物の薬理学的崩壊のような遅い変化させるイベント中に発射を調べるために使用される。最後に、急速な相性分析はオペラント反応または実験キューの発症のような、より瞬間的なイベントに使用されています。
図4に、トニック発火のヒストグラムを示していますコカイン自己投与時の全記録セッション全体で30秒ビン放電の回数と。図示例のセルは、コカインの身体レベルの変化に敏感であり、コカインが増加する（ 図4B）の動物の身体レベルとして（ 図4A）に阻害となるが、コカインのレベルは、自己の後に低下すると、元の発火率に戻る管理偶発終了している。対象領域に応じて、ニューロンは薬理作用、または報酬関連手がかり6、感覚入力13、またはやる気のアプローチ3を含む行動のいずれかのイベント数に敏感である。
正しい条件下では、多数のセッションのために同じニューロンを記録することができる。線条体では、神経細胞を均一に分散（電線の80％が単一のユニットを生成すると、細胞が層状のかしっかりとグループ化されていない）と、そのすぐに崩壊オベ比較的小さな信号を生成しているR距離。これらの条件の下で、私たちの研究室では、複数の週間線条体と同じニューロンを記録することができました。重要なのは、すべてのニューロンがセッション間で確認することができ、すべてのニューロンは時間をかけて維持されていない。縦録音のこれらのタイプを取得するために自分の能力を決定することは、電気生理学的システムを慎重にテストする必要があります。例えば、駆動可能な電極を使用することにより、マイクロワイヤの記録距離を推定することができる。配線の物理的特性、地域の解剖学、およびセッション間のニューロンの波形パラメータと一緒に考えると、1波形セッション7,8,13間で維持されていることを合理的な自信を持って決定することができます。
図1。Representat「頭蓋骨窓」（ すなわち開頭）、頭蓋骨のネジ、およびアース線のIVE配置。 A）頭蓋骨（赤）、頭蓋窓（四角）、およびアース線（緑）のために対側孔の各プレート上の頭蓋骨のスクリューの配置を示す頭蓋骨の背側図である。頭蓋窓を計画するとき、座標が後方内側および標的領域のための横方向の座標（ 例えば、背側線条体））B）前部およびCを決定することによって定義されるべきである。D）これらの座標は、ウィンドウの配置を決定するために使用することができる頭蓋骨の背側表面に。頭蓋骨のウィンドウはBとCで特定さ内側と外側のターゲットに対応しており、また、BとCの間で前後面内で指定された範囲にわたっていることに注意してください。これらの座標は、個々の標的領域に特異的であろう。代表LOCA2×8のアレイ内のマイクロワイヤのtionsをDに示されている頭蓋骨のウィンドウ内に小さなドットを使用して表示されます。最終的な背腹ワイヤーの座標は、それらが下げられるまでの深さに依存します。 Paxinos＆Watsonの14から変更数値は。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。差動増幅のプロセスの図 。一番上のパネルは、増幅（信号+雑音）を微分する前に神経信号を表す。差動増幅に続いて、すべてのチャネル（ノイズ、中央パネル）に見出される異質の電気信号を効果的にw iを記録から差し引くことができる神経波形（;下のパネル信号）のアイソレーションを向上させるために、指定された差動電極の使用を介してRES。
図3。MICROWIRE配列の1線から記録された例の神経波形（右）。ヒストグラム（左）は、各セッションの神経放電を観察前のミリ秒単位の活動電位の数が表示されます。各ビンは、1ミリ秒の期間を表す。ヒストグラムは活動電位は、ニューロンの自然応期（2ミリ秒）に発生していないことを示している。
図4。 持続的にコカイン自己投与中に禁止される 。 ニューロンの例A）30秒ビンの長期アクセスコカイン自己投与セッション全体のニューロンの発火率（Spikes/30秒）。B）は、対応する同じセッション全体で計算された薬物濃度。組み合わせて、薬物濃度の増加は神経発火の窪みと相関している。セッションは〜425分で終了したときにそれに応じて、神経発火はコカインの秋のボディのレベルとして回復します。
図5。MICROWIREインプラントと2匹の動物からの組織学的スライス。 A）病変MICROWIREチップ（青）を明らかにフェロシアン化カリウムの対比染色と組み合わせたニュートラルレッドを使用してニッスル染色切片。マイクロワイヤは、組織内の配線トラックに従うことによって、ワイヤ先端（青）まで皮質からたどることができる。トラックは単一のスライスまたは隣接する一連のスライスにトレースすることがあります。B）フェロシアン化カリウムカウンター染色で結合された腹側淡蒼球を明らかにサブスタンスPについて染色セクションを、、。免疫組織学的技術を用いて、個々のマイクロワイヤは、特定の脳領域内、またはさらに特定の核の特定のサブ領域内に局在化することができる。図は、サブスタンスP染色を用いて、腹側淡蒼球内に局在MICROWIREチップ（青）を示している。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
細胞外記録は、神経科学のほぼすべての実験準備に組み込むことができる強力な実験手法を表す。そのシャフトは、脳を通ってそれらの標的領域（ 図5A）に入るように組織化された配列に移植されているワイヤは追跡することができる。小さな、実験後の病変は、ステンレス鋼線から小さな鉄の堆積物を作成するために絶縁なしマイクロワイヤ先端に作成されると、1は正確に溶液を用いて、（1単位が記録された）絶縁されていないマイクロワイヤ先端の位置をマークすることができます5％フェロシアン化カリウム及び10％のHCl（;青い点図5Aおよび5B）である。このように、1は容易に脳内の配列全体の位置を再作成し、その後の脳スライスのシリーズを使用することができます。最後に、上述の技術は、容易にするために、録音の空間的特異性を高めるために、免疫組織化学と組み合わせることができるターゲットの配置を確認するには、さらには、単一の標的核3（ 図5B）内小地域の違いを研究するために。
所望の空間的な特異性を達成するために、マイクロワイヤーアレイは、慎重に設計され、移植される必要がある。まず第一に、アレイ内の行と列の間隔は、関心のある領域のために特別に設計されなければならない。所望の標的に対して長すぎるか、広い配列は精度が低下する、または2の隣接する原子核間の境界線上に落ちる多数の配線を生成することができます。同時に、一緒にあまりにも狭い間隔のマイクロワイヤは、各電極の個別の境界を禁止することができます。第二に、マイクロワイヤーアレイは、アレイの完全性を維持するために、注意して取り扱わなければならない。単一の電極アレイが接触したときに容易に損傷又はそれらの構成からもまことができる薄い、毛様線を用いて製造される。これらのワイヤの資質は、被害tを削減するために理想的ですOも1のターゲットへのアプローチのパス上の組織とは、ワイヤが脳の小さな動きに呼応してシフトすることができます。このように、安全な場所に配列を格納し、それらの保護ケースからわずか移植前までのアレイを削除しないようするために一般的にお勧めします。 MICROWIREアレイを殺菌する際にも、注意が必要です。いくつかの場合において、電極のオートクレーブ処理は許容できる。しかしながら、エチレンオキシドまたはUV除菌、脆弱アレイを保護することが好ましい場合がある。最後に、電極金属と絶縁体と、それぞれの直径は、慎重に考慮すべきである。例えば、鉄（ 例えば 、ステンレス鋼）が含まれている唯一の電極は、配列内の各マイクロワイヤの個々の区分のためプルシアンブルーの反応を生成することができるようになります。
機会に、配列内のマイクロワイヤは、気づかれない障害物に低下の間に彼らの構成から逸脱します（ 例えば頭蓋骨頭蓋骨のウィンドウ内の断片）、または貧しいヘクタールndling。 （可能性が高い目標領域の外側であろうが）これらの例において、このようなマイクロワイヤーは、多くの場合、まだその先端に追跡することができる。アレイ内の任意の番号マイクロワイヤが確認できない場合、インスタンスが生じたときは、それは、この動物は、データセットから削除された実験の整合性にとって重要である。個々のマイクロワイヤの位置を誤って解釈が複雑またはデータの破損して解釈するために、その神経信号を有効にすることができます。
注入中に、頭蓋骨のウィンドウと配列アライメントの精度も正確さをターゲットにすることが重要である。頭蓋骨窓は十分な広さの配列は、ワイヤーを曲げたり損傷させずに通過させるようになされなければならない。一方、窓はまた、正確に目標位置に配列を誘導するために使用され、したがって、すべての次元で精密に穿孔されなければならない。際に移植するための準備ができて、1は、アレイのすべての次元で頭蓋骨窓に垂直であることは確かである必要があります。すなわち、任意の次元の配列のわずかな傾斜は、アレイが部分的または完全に標的核を欠場する可能性があります。最初の1〜3ミリメートルを下げるとき最後に、特別な注意が必要です。それは、頭蓋骨のウィンドウ内で見過ごされてきた残骸の破片は、配列の完全性を損なうとマイクロワイヤのパスを動揺することができますことを下げる初期の間にある。マイクロワイヤの通路に障害物があると彼らは徐々に低下している間、1はマイクロワイヤの曲がりを見ることができるか、配列は任意の損傷を受ける前に、わずかに拡大して弓（ 例えば虫眼鏡を使用）。この時点で、マイクロワイヤを後退させることができ、破片は、移植を続行する前に、ウィンドウからクリアすることができます。
少なくとも最後のではなく、マイクロワイヤアレイの成功注入は、無菌手術室を維持し、徹底した術後ケアを提供することに特別な注意が必要です。上記の予防措置と組み合わせることで、実行可能な記録はから入手できます1月の上向きにのための関心領域、我々は、手術6次の40日までの記録を確認しました。おそらく、最も重要なのは、これらの録音の寿命は電気的、化学的、およびホルモンの影響の複雑な環境の中に離散的な機能回路を研究し、学習と動機におけるこれらの回路の役割についての重要な質問に答える機会を提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することなく、競合する金融利害関係はありません。
Acknowledgments
この研究は、薬物乱用の国民の協会によってサポートされていましたDA 006886（MOW）とDA 032270（DJB）が付与されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. List of Surgical Materials. | |||
| Gauze | Fisher (MooreBrand) | 19-898-144 | |
| Cotton Swabs | Fisher (Puritan) | S304659 | |
| Nembutal (Pentobarbital) | Sigma Aldrich | P3761 | |
| Atropine Methyl Nitrate | Sigma Aldrich | A0382 | |
| Baytril (Enrofloxacin) | Butler Shein (Bayer) | 1040007 | |
| Ketamine Hydrochloride | Butler Shein | SKU# 023061 | |
| Betadine (Povidone-Iodine) | Fisher (Perdue) | 19-066452 | |
| Stereotax | Kopf | Model 900 | |
| Cauterizing Tool | Stoelting | 59017 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ445 | |
| Dental Drill | Buffalo | 37800 | |
| Bacteriostatic Saline | Bulter Schein | 8973 | |
| Jewlers Screws | Stoelting | 51457 | |
| Microwire Array | Microprobes | Custom (Flexible) | |
| Ground Wire | Omnetics | Custom Plug | |
| Dental Acrylic | Fisher (BAS) | 50-854-402 | |
| Absorbable Sutures | Fisher (Ethicon) | NC0258473 | |
| Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant) | Fisher (Henry Schein) | 008897 | |
| Table 2. List of Surgical Instruments. | |||
| 2x Microforceps | George Tiemann Co. | #160-57 | Multi-use (e.g. clearing debris in skull window) |
| 2x Forceps | George Tiemann Co. | #160-93 | Multi-use (e.g. tying sutures) |
| 6x Hemostats | George Tiemann Co. | #105-1125 | Clamp and open incision |
| 1x Small scissors | George Tiemann Co. | #105-411 | Cut sutures after tying |
| 1x Tissue forceps | George Tiemann Co. | #105-222 | Holding tissue while suturing |
| 1x Needle holder | George Tiemann Co. | #105-1259 | Holding suture needle |
| 1x Scalpel holder (with #11 blade) | George Tiemann Co. | #105-80 (w/ #105-71 blade) | Making skull incision |
| 1x #22 Scalpel blade | George Tiemann Co. | #160-381 | Shaving scalp |
| 1x Surgical Spatula | George Tiemann Co. | #160-718 | Scraping skull to clear tissue on skull |
| Machine/Jewelers Screws | Various | N/A | 0/80 x 1/8” |
| Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals. | |||
| Microwire Array & Connector | Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) | N/A (Part No. based on array characteristics) | Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc. |
| Unity-Gain Harness/Headstage | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1200 | Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals. |
| Commutator (and Optional Fluid Swivel) | Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) | SL18C | Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp |
| Pre-amplifier | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1198 | Differentially amplifies neural signals against a reference electrode. |
| Filter and Amplifier | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1199 | Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal. |
| Acquisition Computer | EnGen (Phoenix, AZ) | N/A (Custom Build) | Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition. |
| A/D Card | Data Translation (Marlboro, MA) | DT-3010 | Digitizes neural signals for computer sampling. |
| Digital I/O Card | Measurement Computing (Norton, MA) | PCI CTR-05 | Acquires behavioral inputs and outputs |
References
- Carter, M., Shieh, J. C. Electrophysiology In: Guide to research techniques in neuroscience. , Academic Press. (2009).
- Aston-Jones, G., Siggins, G. R. Electrophysiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. Kupfer, D., Bloom, F. E. , Raven Press. (1995).
- Root, D. H., et al. Differential roles of ventral pallidum subregions during cocaine self-administration behaviors. J. Comp. Neurol. 521 (3), 558-588 (2013).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. (3-4), 106-103 (2012).
- Ma, S., et al. Amphetamine's dose-dependent effects on dorsolateral striatum sensorimotor neuron firing. Behav. Brain Res. , (2013).
- Ghitza, U. E., et al. Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine. J. Neurosci. 23 (19), 7239-7245 (2003).
- Tang, C., et al. Changes in activity of the striatum during formation of a motor habit. Eur. J. Neurosci. 25 (4), 1212-1227 (2007).
- Tang, C., et al. Dose and rate-dependent effects of cocaine on striatal firing related to licking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 324 (2), 701-713 (2008).
- Fabbricatore, A. T., et al. Electrophysiological evidence of mediolateral functional dichotomy in the rat accumbens during cocaine self-administration: tonic firing patterns. Eur. J. Neurosci. 30 (12), 2387-2400 (2009).
- Root, D. H., et al. Slow phasic and tonic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 66 (2), 106-127 (2012).
- Root, D. H., et al. Rapid-phasic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 64 (9), 704-713 (2010).
- Tang, C. C., et al. Decreased firing of striatal neurons related to licking during acquisition and overtraining of a licking task. J. Neurosci. 29 (44), 12952-12961 Forthcoming.
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (1997).
