Summary
Эта модель системы начинается с миофибробластного населенных фибрин гель, который может быть использован для изучения эндогенного коллагена (ре) организации в режиме реального времени в неразрушающим способом. Модель системы очень настраиваемый, так как он может быть использован с различными источниками клетка, средние добавки, и можно легко адаптировать к конкретным потребностям.
Abstract
Содержание коллагена и организацией в разработке коллагеновых тканях может быть под влиянием местных штаммов ткани и ткани ограничения. Ткань инженеры стремятся использовать эти принципы для создания тканей с заданными архитектуры коллагена. Полное понимание точного основные процессы ремоделирования коллагена для регулирования конечных архитектуры ткани, однако, отсутствует. В частности, мало известно о (пере) ориентации коллагеновых волокон в ответ на изменения в тканях механической нагрузки. Мы разработали системы в пробирке модель, состоящая из двухосной ограниченными миофибробластов семенами конструкций фибрина, для дальнейшего выяснения коллагена (пере) ориентации в ответ на I) возвращаясь к двухосной одноосные условиях статической нагрузки и II) циклического одноосного загрузка двум осям ограничен конструкций до и после изменения погрузки направление, с использованием загрузочного устройства Flexcell FX4000T. Покадровый конфокальной микроскопии используется для VIsualize коллагена (пере) ориентации в неразрушающим способом.
Сотовые и коллагена организации в конструкции могут быть визуализированы в реальном времени, и внутренняя система отсчета позволяет нам переехать клеток и коллагеновых структур для покадровой анализа. Различные аспекты модели системы можно регулировать, как и исходная сота или использование здоровых и больных клеток. Добавки могут быть использованы для дальнейшего выяснения механизмов основного ремоделирования коллагена, например, путем добавления ММР или блокирование интегринов. Форма и размер этой конструкции можно легко адаптировать к конкретным потребностям, в результате чего сильно перестраиваемой модель системы для изучения клеток и коллагена (ре) организации.
Introduction
Сердечно-сосудистые ткани имеют видное несущие функции. В частности содержания и организации коллагеновых волокон во внеклеточном матриксе способствовать несущие свойства и доминировать общей прочности ткани 1. В тканевой инженерии механических кондиционирования конструкцию используют - как правило, состоящей из (циклический) напряжение схемы - повышение организации ткани и механические свойства 2,3. Полное понимание деформационного коллаген организацией в сложной геометрии ткани для создания ткани с заданными архитектуры коллагена до сих пор не было достигнуто. Это происходит главным образом из-за нашего ограниченного знания ремоделирования коллагена в развивающихся тканях. Существующие модели основном дают информацию об окончательных результатах чистая ремоделирования коллагена с использованием статических деформаций 4-6. Здесь мы предлагаем тонкой настройке модель системы, которая позволяет исследовать коллаген (ре) организации в реальном времени способ, в 3D, под воздействиемстатической или циклической деформации. Ткань конструкты на основе фибрина, то, чтобы все коллагена в конструкции является эндогенным. Сотовые и коллагена организации в конструкциях визуализируется, и внутренней системе отсчета позволяет нам переехать клеток и коллагеновых структур для покадровой анализа. В этом протоколе мы опишем использование модели системы по правам Vena Клетки Saphena (HVSCs), так как эти клетки, как известно для повышения эффективности их внеклеточного матрикса и способность реконструировать матрицы и наших устоявшихся использования в инженерных сердечно-сосудистых тканей 7, основанная о работе де Жонж соавт. 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура человека Vena Клетки Saphena
- Изолят клеток из полой подкожной Magna, приобретенных у доноров в соответствии с указаниями для вторичного использования материалов, в соответствии с протоколом Schnell соавт. 9 и хранить их в жидком азоте. Из части полой подкожной Magna от одного донора нарезанные кусочками 2 х 2 мм в культуре в течение шести-луночного планшета. Используйте 2 штуки на каждую лунку. Обычно достаточное количество клеток может быть получена, чтобы заполнить около 3 флакона 0,25 × 10 6 клеток в жидком азоте. HVSCs характеризуются как миофибробластами, показав выражение виментин, нет выражения десмин и субпопуляции выражения α актин гладких мышц 10. Следующий запуск протокола оттаивать клеток от жидкого азота для увеличения количества клеток.
- Поместите клетки от одного флакона в T75 тканевой культуральной колбе и добавляют среду роста (GM), состоящий из Advanced DMEM, 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл пенициллина /стрептомицина и 5 мл L-глютамаксом. Изменение среды каждые 2-3 дня.
- Клетки растут сливающийся примерно через 14 дней. Магазин 0,5 × 10 6 клеток в одном флаконе в жидкий азот, называемый переход 1.
Примечание: Замораживание клеток не является необходимым при уборке HVSCs, но используется исключительно для хранения.
- Поместите HVSCs из одного флакона в T175 колбу культуры тканей и добавить ГМ. Изменение среды каждые 2-3 дня. Клетки растут сливающийся примерно через 7 дней. Магазин 3 × 10 6 клеток в одном флаконе в жидкий азот, называемый проход 2.
- Поместите клетки из одного флакона в rollerbottle и добавить ГМ. Изменение среды каждые 2-3 дня. Клетки растут сливающийся примерно через 8 дней. Один rollerbottle содержит примерно 20-30 х 10 6 клеток. Культура клетки до прохождения 6. Не следует использовать клетки проход выше, чем канал 9, так как клеточный фенотип может изменяться. 2. Инженерии на основе фибрина Конструкции тканей
- Подготовка силиконовый клей смешиванием эластомеров с отвердителем (10:1). Вырезать 7 х 3 мм прямоугольные сегменты липучке. Клей липучке в 6-луночный планшет культуры, с гибкой мембраны образуют крест, и, чтобы оставить квадрат пространства 3 мм между полосками Velcro.
- Сушат силиконовый клей ночи в сушильном шкафу при температуре 60 ° С для обеспечения затвердевания клея. Стерилизуют путем добавления 70% этанола в лунки и инкубировали в течение 30 мин. Промыть 3x с PBS и удалите все PBS из колодцаLs и липучки. Поместите под действием УФ в течение 30 мин и держать стерильным до использования.
- Подготовка тканевой инженерии среду (TM), состоящий из GM и 130 мг L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата.
- Добавить 1 мг / мл ε-аминокапроновой кислоты (АСА) к ТМ. ACA используется в течение первых 7 дней культивирования, чтобы предотвратить фибрин от унизительного 11. Кроме того, апротинин могут быть использованы.
- Для предотвращения скопления формирования, позволяющие фибриногена до комнатной температуры перед открытием. Без фибриногена будет растворять сгустки более легко. Растворить фибриногена в концентрации 10 мг фактический белка / мл ТМ 7 дополнена ACA. Стерильный фильтр раствора фибриногена, несколько фильтров может быть необходимо. Хранить на льду до использования.
- Растворить тромбина в концентрации 10 МЕ / мл ТМ 7 дополнена ACA. Хранить на льду до использования. </ OL>
- Trypsinize клетки, ресуспендируют в GM и считать.
- Используйте 15 х 10 6 клеток / мл для отбора на основе фибрина ткани конструкций (концентрация на основе методов тканевой инженерии клапанов сердца 7). Один гель состоит из 100 мкл GoF Эл, и, следовательно, 1,5 х 10 6 клеток. Поместите 1,5 × 10 6 клеток в одной центрифужной пробирке, в результате чего столько центрифужные пробирки, как количество гели, которые будут сделаны.
- Центрифуга клетки при 350 мкг в течение 7 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют клеток в 50 мкл тромбина. Добавить 4 мкл синие флуоресцентные микросферы полистирола к этой суспензии. Поместите 50 мкл фибриногена в пробирке. Используйте пипетку, чтобы занять 50 мкл тромбина с клетками. Увеличение объема пипетки до 100 мкл. Внесите 50 мкл раствора тромбина склетки в пробирке с фибриногена смешать тромбина и фибриногена, и возьми 100 мкл смеси.
- Внесите смесь в гель и между липучках. Типичное время гелеобразования для гели фибрина, когда компоненты смешивают, составляет порядка 20 сек.
- Выдержите суспензии в течение 30 мин при 37 ° С в увлажненной 95% воздуха / 5% CO 2 инкубатор, чтобы гелеобразования перед добавлением культуры TM с ACA.
- Заменить TM с ACA каждые 2-3 дня в течение первых 7 дней. Гели достаточно стабильны после одной недели, чтобы быть культурным без ACA. После первой недели заменить TM каждые 2-3 дня. Добавить 6 мл ТМ на лунку. На 12 день клетки выработают достаточное коллагена для визуализации.
- Статические деформации наносится клеток непосредственно, за счет тяги клеток и уплотнение 12. Для индукции коллагена реорганизации, разрезать ткань построить свободную от двух липучек в одном направлении. Это приводит к однонаправленным ограничений (рис. 1А). Выполнить это на 12 день, поскольку конструкция является то достаточно стабильны и коллагена были депонированы.
- Применение циклических деформаций с применением вакуума к нижней части культуральных планшетах с гибкими мембранами, с использованием системы Flexcell FX4000T. Место пластин на опорную плиту, на верхней части загрузки сообщений (которые являются частью гоэлектронной циклического нагружения устройства). Насос подает вакуум на мембране и тем самым тянет мембраны на прямоугольные сообщение лежащий под ним. В связи с крестообразным вложения ткани создает на мембрану (через Velcro) и прямоугольный сообщение применяются циклические деформации одноосного (фиг.1В).
- Вначале использовать статические культуры в течение 5 дней, чтобы достичь начального механическую целостность, перед применением циклических деформаций, начиная с 6-й день. Программа циклического пятно протокола в контроллер для вакуумного насоса. Например использовать ранее установленные протоколом прерывистой деформации циклической, с одноосной направлении 13. Он состоит из прерывистой деформации синусоидальной волны с частотой 1 Гц, напряжение от 0 до 5%-ной деформации, в течение периодов 3 ч, чередовались с 3 ч периоды отдыха. Выполните это циклическая деформация протокола в течение 7 дней, вызывая выровнены коллагена организации.
- Обычно после 12 дней HVSCs дали выровнены коллагена OrganizatioN. После выровнены коллаген организации будет достигнута, изменить одноосном направлении деформации циклическим, чтобы быть перпендикулярным к первоначальному направлению деформации. Проделайте это путем проворачивания прямоугольной сообщений на 90 °.
- Для визуализации активно, в режиме реального времени ремоделирования коллагена, образцы этикетки с зондами, которые не влияют на жизнеспособность клеток или образование коллагена. Использование зондов для флуоресцентной пятно цитоплазме клетки и коллаген.
- Альтернативно генерации второй гармоники с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии может быть использован для визуализации структур с использованием коллагена аутофлюоресценция 14, с возбуждением при 780 нм и обнаружения между 500-550 нм.
- Снимите культуры пластин от установки и инкубатор, для циклически напряженных образцов во время периода отдыха 3 ч и транспортировать их в конфокальной микроскопии лазерного сканирования для визуализации клеток и коллагена.
Примечание: используйте только мягкую сторону липучки и сталкиваются с этой стороной вверх. При склеивании липучки, только покрывают липучки с силиконовым клеем, не распространяет клея во всем хорошо. Так как культура пластины имеют основания силиконовая мембрана, используйте что-то под лунками для армирования гибкие мембраны, для обеспечения легкого склеивания в к пластине.
Примечание: Для растворения фибриногена аккуратно перемешать, чтобы не слишком образования пены.
Примечание: Хранение на льду необходимо для предотвращения раннего гелеобразования тромбина и фибриногена.
Примечание: флуоресцентные микросферы полистирола используются в качестве внутренних опорных маркеров для анализа изображений. При смешивании тромбина и фибриногена, предотвращают образование воздушных пузырьков тщательно пипетки смеси. Пузырьки воздуха приведет отверстий в гель фибрина.
Примечание: Для этого как можно быстрее, чтобы предотвратить образование геля, после чего смесь пипеткой в луночный планшет. Ведение дел с использованием клеток и бисером.
3. Механической нагрузки и Склонение Изменение натяжения и ограничения
4. Визуализация клеток и коллагена
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эта модель позволяет системе для культивирования миофибробластов семенами гели фибрина. 1а представлены ткани культивировали первый в статических двухосных ограничений. Ткань ограничений освобождаются путем разрезания геля фибрина из двух ограничений, чтобы создать одноосные ограничения статических и ткани малолитражки и реконструирует впоследствии (рис. 1А). Для циклических деформаций, ткань культивируют в статическом двухосной ограничений, а также. После 5 дней циклический одноосной деформации могут быть применены (фиг.1В). Для индукции коллагена переориентации одноосном направлении штамм может быть изменено в перпендикулярном направлении (фиг. 1В). Микросферы затравку гелевой смеси, отображать случайный узор, который используется для переноса заранее определенные места на заданный промежуток времени (рис. 2). Фиг.2А и 2С показаны изображения клеток, коллаген и шариков. Эти же изображения сканируются 3 дня (Figurэлектронной 2В) и 2 дней (рис. 2D) позже, соответственно. Клетки и коллагена модели изменились, но шарик шаблоны, используемого для перемещения клетки и коллаген. Культивирование образцов в течение 12 дней приводит к эндогенной продукции коллагена в количестве, достаточном, чтобы быть визуализированы с конфокальной микроскопии (фиг. 3 и 4). С помощью статического или циклического результаты культуры в совершенно разных коллаген организации, где двухосной статического культуре приводит к случайной организации коллаген (фиг. 3А) и одноосной деформации циклической применяется к биаксиально ограничены ткани приводит к выровнены структуры коллагена (4A и B) . Этот коллаген организации могут быть изучены с течением времени, при изменении статических ограничений или изменение циклического направление деформации. При статических ограничений изменен с двухосной одноосным, изменения коллагена ориентацию от случайной ориентацией (рис. 3А) В соответствие ориентации (рис. 3В). Циклические штамм вызывает изменение ориентации на поверхности ткани (фиг.4А и C), но после 3 дней, никаких изменений в основной ткани не наблюдалось (фиг. 4B и D).
Рисунок 1. Конструкции культивировали при двухосном ограничений, используемый для реорганизации коллагена (A) выпуска статических ограничений в одном направлении, или (б) изменение циклического направление деформации. Загрузка сообщений, обозначены пунктирной черной линией. Масштаб полоски указывают на 3 мм.
Рисунок 2. Типичный пример использования шаблонов из бисера переехать заранее определенные места в 3D, в этом случае в статическомкультурных образцов. Клетки отображается красным цветом, коллагена в зеленый и бисером в голубой. А и С показывают изображения клеток, коллаген и бисером. Эти изображения сканируются 3 дней (В) и 2 дней (D) позже, соответственно. Шарик шаблоны, используемого для перемещения клетки и коллаген. Шкала бар указывает 50 мкм.
Рисунок 3. R epresentative образы 12 день статических деформаций с двухосной ограничений (А) и в связи с переориентацией одноосные ограничений в течение 7 дней (B). Шкала бар указывает 50 мкм.
Рисунок 4. Типичные изображения после 12 дней (5 дней статическими, с последующим 7-штамма циклический дней) для циклической деформации на поверхности () И ~ 60 мкм в ткани (B). После изменения циклического направление деформации (после 12 дней), на поверхности клетки и коллаген переориентировать (С), но никаких изменений не видно на основной ткани (D) после 3 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанная модель системы клеточного населенных конструкции фибрин имеет большой потенциал для исследования клетки и коллаген (ре) организации (де Жонж соавт. 15), например, быть использованы для целей тканевой инженерии. При использовании фибрин в качестве начальной ячейки носитель, после деградации фибрин, ткань создается с клетками и эндогенных матрицы лишь. Таким образом, клетки стимулируются реагировать напряжению, статические или циклический характер, применяя сократительной силы 16,17, чувствительный граница жесткости 12 или отображение избежание деформации.
Значение: Фибрин конструкции были использованы, прежде чем изучать коллаген (ре) организации 18, но не с возможностью применения циклического напряжения и / или изучении конструкций в покадровой образом, оба из которых возможно в этом представленному способу. Липучки, которые обеспечивают ограничений в этой модельной системы были использованы до 19,но сочетание этого метода с культуральные планшеты с гибкой мембраны позволяет применять циклические деформации в течение длительных периодов времени. Культивирование в этих плит позволяет легко добавлять и удаления средних и визуализации конструкций в то время как все еще привязаны и стерильно. Это дает возможность изучать соответствующие процессы ремоделирования времени истек или даже в режиме реального времени.
Изменения и будущих приложений: будущие применения системы может быть найдено в манипулировании процесс 3D реконструкции, например, добавлением металлопротеиназ или агенты, которые препятствуют интегрину сборки или сигнализации. Рядом с применением добавок, компонентов модели системы могут быть легко изменены при исследовании клеток и коллагена (ре) организации. Различные источники клетки, здоровых и больных клеток, зрелости коллагенового матрикса (например, путем изменения времени культивирования), а также форма и размеры конструкции могут быть приспособлены к конкретным потребностям. Система хорошо сuited для других клеточных источников, а в настоящее время используется HVSCs. Мы уже использовали эту систему к культуре эндотелиальных клеток, образующих колонии (ECFCs; PlosOne, принята к публикации), где мы видим, что ECFCs ориентируют свои производства коллагена разному при циклическом нагрузки, чем HVSCs.
Ограничения методике: ограничение текущей модели системы является относительно большой размер тканей, требующих 1,5 × 10 6 клеток на конструкцию при использовании плотности клеток 15 × 10 6 клеток / мл. Это может вызвать проблемы в случае, когда менее доступных источников клетка будет использоваться. Другим ограничением является текущим толщину конструкции (приблизительно 1 мм), что обусловлено (толстый) Velcro вложений. Это ограничивает конфокального сканирования, чтобы только часть всего образца. Это можно достичь глубину не более 200 мкм в ткань, которой достаточно, чтобы визуализировать клеточные реакции в ядре текущего ткани, но делаютES не привести к полной Обзор толщины.
Критические шаги и устранения неполадок: В качестве модели, система основана на формировании тканей между точками липучкой, это также включает в себя важные шаги в протоколе. Правильная резка и склеивание имеет важное значение и особое внимание должно быть уделено тщательному пипетирование геля смесь в липучки для правильного крепления ткани, которая имеет решающее значение для применения циклической деформации. Далее определяющий шаги могут быть найдены в выборе исходной ячейки и средней добавок. Оптимизация будут необходимы при культивировании с разными источниками клетки. В настоящее время конструкций культивируют с ACA в течение 7 дней, чтобы остановить фибрина из деградирует. Другой источник клетка может также привести к различным сроки в отношении как образование коллагена и распада фибрина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование было выполнено в исследовательской программе биомедицинских материалов (ВММ) института. BMM является cofunded от голландского министерства экономики, сельского хозяйства и инноваций. Финансовый взнос Hartstichting Nederlandse выражает искреннюю признательность.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
References
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).
- Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents. Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).
- Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling. Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).
- Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).
- Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy. Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).
- Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions. Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).
- Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).
- Schnell, A. M., et al. Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts. Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).
- Mol, A., et al. Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application. Circulation. , I152-I158 (2006).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).
- John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels. Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).
- Rubbens, M. P., et al. Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue. Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).
- Chen, W. L., et al. Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).
- Merryman, W. D., et al. Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis. Am. J. Physiol. 290, (2006).
- Ingber, D. E. From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009. Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).
- Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).
- van der Schaft, D. W., et al. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267 (2013).
