Summary
אנו מציגים הידרוג'ל חדש polyacrylamide, נקרא הידרוקסי-PAAm, המאפשר ישיר מחייב של חלבוני ECM עם עלות או מומחיות מינימאלית. שילוב של הידרוקסי-PAAm הידרוג עם הדפסת microcontact מאפשרת שליטה עצמאית של רמזים רבים של microenvironment התא הטבעי ללימוד mechanostransduction הסלולרי.
Abstract
עכשיו זה גם נקבע כי רב תפקודים תאיים מוסדרים על ידי יחסי גומלין של תאים עם רמזי physicochemical ומכאניים של סביבתם מטריצת חוץ תאית (ECM). תאים האיקריוטים לחוש כל הזמן microenvironment המקומי שלהם באמצעות mechanosensors משטח כדי transduce שינויים פיזיים של ECM לאותות ביוכימיים, ולשלב את האותות האלה להשגת שינויים ספציפיים בביטוי גנים. מעניין, פרמטרים physicochemical ומכאניים של בני הזוג יכול ECM אחד עם השני כדי להסדיר את גורל תא. לכן, מפתח להבנת mechanotransduction הוא לנתק את תרומתו היחסית של רמזי ECM על תפקודים תאיים.
כאן אנו מציגים פרוטוקול ניסוי מפורט במהירות ובקלות ליצור הידרוג רלוונטי מבחינה ביולוגית לכוונון העצמאי של רמזי mechanotransduction במבחנה. אנו הידרוג polyacrylamide שינוי כימי (PAAm) להתגבר באופן מהותי שאינו adhesive נכסים על ידי שילוב מונומרים acrylamide-פונקציונליות הידרוקסיל במהלך פילמור. השגנו הידרוג'ל רומן PAAm, נקרא הידרוקסי-PAAm, המאפשר קיבוע מכל הסוג רצוי של חלבוני ECM. שילוב של הידרוקסי-PAAm הידרוג עם הדפסת microcontact מאפשרת לשלוט באופן עצמאי את המורפולוגיה של תאים בודדים, נוקשות המטריצה, הטבע והצפיפות של חלבוני ECM. אנו מספקים שיטה פשוטה ומהירה שניתן להגדיר בכל מעבדת ביולוגיה ללמוד בתהליכי mechanotransduction תא מבחנה. אנו מאשרים הרומן הזה פלטפורמה דו ממדים על ידי ביצוע ניסויים על תאי האנדותל המדגימים צימוד מכאני בין נוקשות ECM והגרעין.
Introduction
היבטים של microenvironment הסלולרי המקומי רבים (למשל, קשיחות, גודל נקבובית, טבע של חלבונים, או צפיפות תאים ליגנד) לספק קואורדינטות מוגדרות של רמזי רגולציה השולטים בתהליכים תאיים כגון תנועתיות, התפשטות תאים, התמיינות, וביטוי גנים. שינויים של מאפייני physicochemical של הסביבה תאית יכולים להיתפס על ידי תאים ולגרום להשלכות פיסיולוגיות שונות, כולל עיוות של קיטוב סלולארי, הגירה, ובידול. עדיין לא ברור, עם זאת, כיצד תאים לתרגם שינויי ECM לאותות ביוכימיים סלולריים. לכן חשיבות רבה למהנדס בשליטה בmicroenvironments מבחנה שיכולה לשכפל את יחסי הגומלין בין תאים וmicroenvironment ללימוד מסלולי mechanotransduction. כדי לטפל בבעיה זו, יש לנו לאחרונה הציג שיטה חדשה 1, הנקראת הידרוג-PAAm הידרוקסי, כדי ליצור שתי אגורה בקלותמטריצות nsional רכות המאפשרות לשלוט באופן עצמאי רמזי mechanotransduction חשובים: מטריצת קשיחות, גיאומטריה תא וכליאה, הטבע של החלבון וצפיפות תאים ליגנד.
ECM מכוון את התהליכים תאיים באמצעות הדרגתיים בmorphogens (chemotaxis), חלבוני דבק (haptotaxis), וקשיחות (durotaxis). במהלך העשורים האחרונים, מתקדם בפלטפורמות מבחנה פותחו כדי לבודד רמזים תאיים הללו על מנת להקניט את הדרך בה התאים מסוגלים לתרגם תכונות ביוכימיות וbiophysical לתהליכים פיסיולוגיים 2-5. אלומת אלקטרונים 6, photolithography 7, קיבוע פוטו 8, או טכניקות סיוע פלזמה 9 פותחו כדי לכוון את הצמיחה של תאי חיים על מצעי micropatterned. למרות שהטכניקות אלה הניבו תוצאות חשובות, רובם אינו מאפשרים אפליה בין ההשפעה הפרטנית של רמזים שונים על התנהגות תאוהם דורשים מתקנים טכניים שכמה מעבדות יכולות להרשות לעצמו. בין הטכניקות הללו, הדפסת microcontact (μCP), התפתחה כשיטת חזקה ונגישה ליצירת מיקרו איי תא מודבק 10. לאחרונה, מאמצים נרחבים 11-14 נעשה כדי לפתח μCP על הידרוג'ל עם קשיחויות מתכונן כדי לשחזר את מגוון הרחב של קשיחויות שנצפו ברקמות חיות. בין יצירות אלה, polyacrylamide (PAAm) הפך פופולרי 15 והוא כבר אחד המטריצות המבוסס על פולימר הנפוץ ביותר עבור מבחני ביומכניקה התא.
משטחי PAAm הם פונקציונליות בדרך כלל עם מקשר הצולב heterobifunctional החלבונים sulfosuccinimidyl-6 N [4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) וECM צמודים למשטח על ידי הפעלת UV של nitrophenyl sulfo-SANPAH קבוצות אזיד 16. טכניקה נוספת מורכבת בהידרזין צימוד לחלבונים שעברו חמצון קשהעם periodate 17. Hynd ועמיתים לעבודה הציגו טכניקה עבור דפוסי משטחי הידרוג'ל biomimetic עם חלבון ופפטידים הדורשת photopolymerization בנוכחות של מונומר acroyl-streptavidin 18. לאחרונה, Tseng et al. דיווחו שיטה חדשה micropatterning 19 מבוססים על חשיפה לקרינת UV עמוקה של PAAm דרך מסכת קוורץ אופטית הדורשת לדגירת ג'לי הרשות הפלסטינית מופעל עם 1-אתיל-3 [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) ופתרונות N-hydroxysuccinimide (NHS) מים לפני להוסיף את החלבון. למרות היכולת של טכניקות אלה כדי ליצור micropatterns חלבונים הומוגנית ושחזור, רובם סובלים מגבלות עיקריות: תהליכי סינתזה ארוכה (למשל, דיאליזה, lyophilization, וכו '), תרכובות כימיות יקרות (למשל, חומצה היאלורונית, sulfo-SANPAH) UV עמוק או הקרנה. בנוסף, טכניקות אלה אינן מאפשרות אפנון עצמאי של קשיחות מצע, micropatternגיאומטריה, טבע חלבון ECM, וצפיפות תאים ליגנד.
לוקח מגבלות אלה בחשבון, שפיתחנו גישה המבוססת על acrylamide רומן ופשוט, המאפשרת קיבוע של מגוון רחב של חלבונים ומולקולות ביולוגיים על הידרוג רך ומאפשרת כוונון עצמאי של רמזי mechanotransduction כדי לפענח את תפקידם על תפקודים תאיים. במקום לטפל הידרוג PAAm עם תרכובות כימיות קשות, אנחנו מציגים מונומר acrylamide מסחרי עם קבוצות הידרוקסיל במהלך פילמור PAAm. פעולה פשוטה זו מתגברת על הרכוש אנטי דבק הפנימי של הידרוג PAAm ללא כל דרישות טכניות אחרות.
הנוכחות של קבוצות הידרוקסיל מובילה לזיקה גבוהה של הידרוג-PAAm הידרוקסי לחלבונים ומולקולות ביולוגיים היוצרים אינטראקציות מימן מליטה. בשילוב עם μCP, הידרוג-PAAm הידרוקסי לאפשר דור מהיר של פלטפורמת התרבות דו ממדים עם שליטה עצמאיתעל קשיחות מטריצה, סוג של חלבוני ECM, צפיפות תאים ליגנד ודביקות מוגבלת, אשר חזתה להיות פלטפורמה רבת עוצמה ללימוד mechanotransduction.
מטרת פרוטוקול זה היא לספק את המידע הדרוש בקלות מה שהופך את הידרוג-PAAm הידרוקסי ללא מומחיות כלשהי במדעי חומר. המטרה הסופית היא לספק אמצעים לחוקרים לשאול שאלות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ברמה התאית ורקמות שעשויות להוביל להבנה טובה יותר של מסלולי mechanotransduction המעורבים במנגנוני pathophysiological.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 הפעלת Surface של Coverslips הזכוכית
- coverslips זכוכית מקום עגול (25 מ"מ קוטר) בצלחת פטרי ולמרוח 0.1 פתרון M NaOH על זה במשך 5 דקות (מנדף הכימי המומלץ).
- הסר את פתרון NaOH ולטבול באופן מלא coverslips עם סטרילי DDH 2 O עבור 20 דקות תוך מתנדנד בעדינות על צלחת נדנדה בברדס תרבות סטרילי.
- מסננים DDH 2 O סטרילי ולחזור על השלב 1.2.
- הסר את coverslips עם פינצטה סטרילי ולמקם אותם בצלחת פטרי חדשה עם מופעל עם הפנים למעלה.
- coverslips יבש תחת זרימה קבועה של גז חנקן טוהר גבוה.
- במנדף תרבות סטרילי, למרוח שכבה דקה של 3 acrylate propyl (trimethoxysilyl) (92%) בצד הופעל של coverslip עבור שעה 1.
- בהרחבה לשטוף coverslips זכוכית עם 3 שוטף של DDH סטרילי 2 O ולטבול אותם בסטרילי DDH 2 O בצלחת פטרי חדש.
- הקש על צלחת פטריעם Parafilm ומניח אותו על צלחת נדנדה תחת תסיסה עדינה עבור 10 דקות.
- הסר את coverslips מDDH 2 O עם פינצטה סטרילי עם טיפים יפים ומניח אותם בצלחת פטרי חדשה עם מופעל עם הפנים למעלה.
- לאחסן ב RT במקום יבש עם נייר אלומיניום כדי למנוע אבק יידבק לcoverslips.
2 הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג
- הכן משקל של 65 מ"ג של acrylamide N-Hydroxyethyl (HEA) בצינור 1.5 Eppendorf מ"ל. חשוב להכין פתרון HEA טרי.
- הוסף 1 מ"ל של 50 חיץ HEPES מ"מ לHEA ולערבב באמצעות vortexer עד פירוק HEA המלא.
- הוספת 400 μl של 40% w / w בHEPES פתרון acrylamide והנפח הנדרש של 2% w / w בפתרון bis-acrylamide HEPES (ראה טבלה 1) כדי להגיע לנוקשות הידרוג'ל הרצויות. התאם עם 50 HEPES מ"מ לנפח סופי של 5 מ"ל.
- מערבבים את הפתרון באמצעות vortexer ודגה זהבתא ואקום עבור 20 דקות כדי להפחית את ריכוז חמצן בתוך התמיסה, אשר מונעת פילמור הידרוקסי-PAAm.
- מתחת למכסת מנוע סטרילי, לסנן פתרון degased עם מסנן גודל נקבובית 0.2 מיקרומטר כדי לעקר אותה.
- הפעל coverslips העגול זכוכית (קוטר 22 מ"מ) בשואב UV / אוזון במהלך 7 דקות.
- הכן 10% persulfate אמוניום פתרון (APS) 100 μl, שהוא 10 APS מ"ג ב100 μl DDH 2 O. חשוב להכין פתרון APS טרי.
- הוסף 2.5 μl של tetramethylenediamine (TEMED) ו25 μl של פתרון APS לפתרון מעוקר הידרוקסי-PAAm (שלב 2.5) ליזום פילמור. מערבבים את הפתרון על ידי 3 pipettings רצוף ללא הקדמה של בועות, בתנאים סטריליים.
- מתחת למכסת מנוע סטרילי, מקום טיפת 25 μl של פתרון הידרוקסי-PAAm על coverslip 25 מ"מ (זמינה מצעד 1.9) ומייד להציב GL 22 מ"מcoverslip התחת (שהוכן על שלב 2.5) על גבי אגל לסחוט את פתרון הידרוקסי-PAAm. מרכז את coverslip זכוכית 22 מ"מ עם פינצטה סטרילי ולהחליק את כל בועות.
- לאפשר הידרוג-PAAm הידרוקסי לפלמר ב RT במשך 15 דקות. היפוך ידני פתרון הידרוקסי-PAAm שנותר בצינור Eppendorf לעקוב השלמת תהליך פילמור.
- באופן מלא לטבול coverslips עם סטרילי DDH 2 O ולהפריד בזהירות את 22 coverslips מ"מ הזכוכית על ידי החדרת הקצה של סכין גילוח בין coverslips מ"מ הזכוכית 22 ושכבת הידרוג'ל הידרוקסי-PAAm.
- לשטוף הידרוג-PAAm הידרוקסי עם PBS סטרילי (3 חילופים של PBS) ולתת לי ג'לי השקוע לחלוטין בPBS סטרילי כדי לשמור על לחות.
- אחסן הידרוג-PAAm הידרוקסי בסטרילי PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 ימים.
.3 Polydimethylsiloxane (PDMS) Microstamp ייצור
הערה: הייצור של אדון סיליקון נדרשת לפני start PDMS ייצור microstamp. microfabrication זה של אדון סיליקון יכול להיעשות על ידי טכניקות ליתוגרפי, אשר דורשת ציוד והכשרה מיוחדים. שיתופי פעולה עם מתקן nanofabrication מעודדים לפברק מאסטר סיליקון. לחלופין, ליצור קשר עם חברה שבודה אדוני סיליקון microstructured מחוייט על פי דרישה. חשוב לציין כי הייצור של אדון סיליקון רק צריך להיעשות פעם אחת. ואכן, ניתן להשתמש בו אדוני סיליקון microstructured ללא הגבלת זמן לייצר חותמות אלסטומרי.
- מיקס PDMS וסוכן הריפוי ב10: 1 יחס בכוס פלסטיק ומערבבים היטב בעזרת פיפטה עבור 10 דקות.
- דגה תערובת PDMS תחת ואקום כדי להסיר בועות אוויר שנוצרו במהלך השלב 3.1.
- הנח את אדון סיליקון microstructured בצלחת פטרי והטלת שכבה עבה 10 מ"מ של תערובת PDMS degassed על זה בלי ליצור בועות.
- לאפשר לרפא PDMS לשעה 2 ב 60 מעלות צלזיוס בתנור.
- בסביבה נטולת אבק, microstamps 1 סנטימטר 2 מתקלפת שכבת PDMS ובלו עם אזמל.
- בעזרת מלקחיים, PDMS המקום microstamps דפוס בצלחת פטרי.
.4 הידרוג הידרוקסי-PAAm Micropatterning
- microstamps PDMS המקום באתנול / מים פתרון (50/50) וsonicate במשך 15 דקות.
- ייבש את הבולים עם זרם של זרימת חנקן ולמקם אותם דפוס בשואב UV / אוזון (λ <ננומטר 200) במשך 7 דקות.
- מתחת למכסת מנוע סטרילי, מקום טיפה 150-μl של פתרון רצוי חלבון (לדוגמא, 100 מיקרוגרם / laminin מיליליטר PBS או 25 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין PBS) על גבי משטח microstructured של בול 2 PDMS 1 סנטימטר.
- אופציונאלי: שנה את הריכוז של תמיסת החלבון לווסת את צפיפות תאים ליגנד.
- מורחים את פתרון החלבון על פני השטח החותמת על ידי הזזתו עם קצה סטרילי של פיפטה כלפי כל אחת מפינותהחותמת.
- השאר את פתרון החלבון לספוג בחותמת PDMS ל60 דקות מתחת למכסת מנוע סטרילית. כבה את הנרות, כדי למנוע נזק חלבון.
- תחת מכסה המנוע סטרילית, להעביר coverslips הידרוקסי-PAAm המצופה (ניתן להשיג בצעד 2.13) לתוך צלחת פטרי.
- הסר PBS העודף מפני שטח של מצעי הידרוקסי-PAAm עם זרם חנקן נמוך בתנאים סטריליים. להפסיק את ההליך בהקדם אין ראיות של מים עומדים על פני השטח ג'ל הוא ציין. ג'ל לא צריך להיות יבש לחלוטין בשלב זה.
- יבש בזהירות את פני השטח המובנה של PDMS להחתים עם זרימה קבועה של גז חנקן טוהר גבוה.
- לתפוס את החותמת מצופה חלבון עם מלקחיים רקמות הלבשה ולמקם את פני השטח המובנה במגע עם פני השטח הידרוג'ל המיובשים. החל נקודות לחץ קצרות עם הקצה של פינצטה בחלק העליון של חותמת PDMS כדי להבטיח קשר טוב בין microfeatures בולים ופני שטח הידרוג'ל.
- השאר את חותמת PDMS על המשטח הידרוג'ל דואר עבור שעה 1 ב RT.
- להסיר בעדינות בולי PDMS מהידרוג הידרוקסי-PAAm עם מלקחיים רקמות הלבשה ובצע את השלב 4.1 לנקות את החותמת.
- לשטוף בהרחבה הידרוג-PAAm הידרוקסי יוחתם על ידי 3 חילופים של PBS (pH = 7.4) בתנאים סטריליים עבור 10 דקות לחליפין.
- אופציונאלי: micropatterns נוסף של חלבוני ECM אחרים ניתן להוסיף למשטח הידרוקסי-PAAm ידי ביצוע שלבים 4.5-4.11.
- אזורים מודפסים אינו passivate עם פתרון סטרילי של BSA ב5 מ"ג / מיליליטר PBS במהלך לילה אחד ב 4 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה על צלחת נדנדה.
- לשטוף בהרחבה על ידי 3 חילופים של PBS (pH = 7.4) בתנאים סטריליים עבור 10 דקות לחליפין. בשלב זה, ניתן לאחסן הידרוג-PAAm הידרוקסי חותמת על 4 מעלות צלזיוס עד שבוע.
.5 הפקדת נייד על הידרוקסי-PAAm הידרוג micropatterned
- דגירה coverslips בתקשורת תא ל30-45 דקות לפני הציפוי גאמות.
- שטוף תאים חסיד תרבותיים בבקבוק 2 תרבות 75 סנטימטר עם PBS סטרילי על 37 מעלות צלזיוס ולנתק אותו עם 3 מ"ל של טריפסין-EDTA או Accutase עבור 10 דקות.
- להעביר את הסכום הרצוי של מדיום גידול מתאים מלא מראש חימם עבור הקו הסלולרי שלך לתוך הבקבוק המכיל את התאים מנותקים וצנטריפוגה ההשעיה התא במשך 3 דקות ב650 x גרם.
- הסר את supernatant עם micropipette וresuspend התאים במדיום התרבות שלם ב15-20,000 תאים / מ"ל.
- הוסף 4 מ"ל של פתרון התא לcoverslip micropatterned (המתקבל משלב 5.1) ומקום coverslip מכוסה התא בחממה תרבות ב37 ° C ו 5% לחות ל1-2 שעות.
- לשאוב בעדינות תאים ופנויים להחליף מדיום התרבות. להחזיר את התאים המצורפים לחממה ולתת להם להתפשט באופן מלא (שעות 3-6, תלוי בסוג התא).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 א מציג את שיתוף פילמור של acrylamide (AAM) וbisacrylamide (bis-עאם) עם N-hydroxyethylacrylamide מונומרים (HEA) המכילים הידרוקסיל עיקרי שהוקם על ידי פילמור הרדיקלי האקראי רשת הידרופילי של polyacrylamide עם קבוצות הידרוקסיל משובצות (הידרוקסי-PAAm) . בפרוטוקול זה, מ"ג משקל 65 של חימום חייב להיות מדולל בנפח של 1 מ"ל של HEPES. בידיעה שהצפיפות של חימום היא בערך שווה לאחד, אנו מניחים כי נקבל עבודה נפח של 1,065 μl (HEA + HEPES). כפי שהוצג בטבלה 1, סך הכל התוספת של 1,065 μl ל400 μl של עאם ו50 μl של bisAAm מובילה להיקף של 1,515 μl. לכן יש צורך בנפח של 3,485 μl של HEPES כדי להתאים את הפתרון לנפח סופי של 5 מ"ל. כפי שצוין בשלב 2.6, את פני השטח של coverslip זכוכית 22 מ"מ חייב להיות מופעל במהלך 7 דקות בUV / אוזון על מנת להסיר אותו מבלי לגרוםכל נזק למשטח הידרוג'ל. ואכן, משטח הזכוכית הופך להיות יותר הידרופילי לאחר UV / הטיפול באוזון ולכן ניתן להסיר בקלות על ידי טבילה את המערכת כולה במים. בנוסף, טיפול UV / אוזון מונע זיהום כימי של coverslip 22 מ"מ, שנמצא במגע ישיר עם משטח הידרוג'ל. היתרים בטכניקה זו כדי לקבל משטח שטוח עגול polyacrylamide (22 מ"מ קוטר) חייב coverslip זכוכית (25 מ"מ קוטר).
כפי שהוצג באיור 1 ב, micropatterns של חלבונים ניתן ליצור על פני השטח של הידרוג הידרוקסי-PAAm על ידי הדפסת microcontact. בהליך ניסיוני זו, חשיפות UV / אוזון מאפשרות להפחית באופן זמני את הידרופוביות הפנימית של בולי PDMS על ידי יצירת קבוצות silanol על פני השטח. ואכן, שורת ננומטר 185 מייצרת אוזון מחמצן מולקולרי ואילו קו ננומטר 254 ממיר את האוזון לחמצן אטומי. מינים תגובתי זה תוקף את ba siloxaneckbone של PDMS כדי ליצור שכבה עשירה בחמצן SiOx כמו סיליקה וקבוצות משטח Si-OH. משטח PDMS חמצון ידוע להתאושש הידרופוביות שלה בשעות ספורות לאחר חשיפה לאוויר כתוצאה מההגירה של רשתות נמוכות משקל מולקולרי uncrosslinked פולימריים מהשלב התפזורת אל פני השטח. אסטרטגיה זו עוזרת להפצה של פתרון החלבון על פני השטח של חותמת PDMS.
אחד היתרונות המרכזיים של שיטה זו היא לווסת את קשיחות מטריצה (איור 2 א), הגיאומטריה micropattern (איור 2), צפיפות תאים ליגנד (איור 2 ג), וטבע חלבון (איורים 3 א ו 3 ב) באופן עצמאי. כפי שניתן לראות באיור 2 א, הידרוג-PAAm הידרוקסי להראות תלות ליניארית של moduli אלסטי על ריכוז צולב מקשר מכמה kPa לכמה עשרות kPa, המאפשר שעתוק קנס של הקשיחות של microenvironment הסלולרי. איור 2 איור 2 ג מראה כי התא -ligand צפיפות יכולה להיות מווסתת על ידי שינוי הריכוז של פתרון החלבון המשמש לדגירת בולי PDMS. איור 3 מציג תמונת הקרינה של קווי קולגן חותמת מעבר לקווי laminin ופיברונקטין באמצעות הדפסות microcontact רציפות.
זה מעניין לקוראים לציין כי גדלים וצורות של micropatterns שונים כבר הוחתמו ביעילות, ללא קשר לקשיחות הידרוג'ל. יש לנו לשכפל בהצלחה microfeatures של חלבונים עם קצוות חדים (למשל, משולשים וכוכבים) וישר (לדוגמא, קווים), או (לדוגמא, חוגים) צורות מעוגלות, הוכחה כי אין majoהגבלת r למורכבות הדפוס. לצורך ניסוי תא בודד, שטח פן micropattern היה בין 400 ו2,500 מיקרומטר 2, הערך נמוך יותר המתאים למגבלה של כדאיות תא בודדת. כפי שרבי שיטות מבוססות microprinting אחרות, המגבלה העיקרית של השיטה המוצגת נוגעת ברזולוציה מרחבית שלה. על הידרוג נוקשה (E> 10 kPa), ברזולוציה מרחבית היא סביב מיקרומטר ונקבעה בעיקר לפי הרזולוציה של הבול, ואילו בהידרוג "הרך", המגבלה של רזולוציה הופכת נקבעה בחלקו על ידי עיוות פני השטח, כי עלול להתרחש במהלך העברת חלבון.
הרעילות של הידרוג הידרוקסי-PAAm נחקרה על ידי כימותים את הכדאיות של תאי האנדותל עיקריים מצופה עבור 1, 2, ו -3 ימים בתרבות באופן הומוגני המצופה והידרוג microprinted הרך הידרוקסי-PAAm (איור 4 א). אודות 80% מHUVECs מצופים על הידרוג רך micropatterned הידרוקסי-PAAm נשמריכולת הקיום שלהם במשך שלושה ימים, הממחישה את ההתאמה הביולוגית של הידרוקסי-PAAm הידרוג לתרבית תאים. מעניין, כדאיות דומה התקבלה במעבדה שלנו עם תאי עצב בקליפת המוח עיקריים. בנוסף, תאי האנדותל העיקריים להתרבות יותר על "נוקשה" (500 kPa) בהשוואה ל( 25 kPa) מצעים "רכים" (איור 4), מצביעים על כך ששיטה זו מספקת microenvironment מתאים ללימוד תרבות תאים על פני מגוון רחב של קשיחויות .
לנתק את ההשפעה של מצע נוקשות ואזור המשתרע על mechanotransduction, תאי האנדותל עיקריים (HUVECs) היו מצופים על micropatterns מצופה FN המלבני (אזור הקבוע של 1,200 מיקרומטר 2) שהופקד על הידרוג-PAAm הידרוקסי של שלוש stiffnesses שונה (2.5, 8.5, ו25 kPa). לאחר מכן, HUVECs הוכתמו לסיבי אקטין, vinculin וDNA על ידי ביצוע הליך immunocytochemistry סטנדרטי, כפי שהוא משמש לאמאתאים ליאן מצופים על מצעי זכוכית. על מצעים הרכים, HUVECs תערוכת צפיפות סיבים אקטין נמוך וגרעין מעוגל, ואילו על מצעים נוקשה, סיבים אקטין הם ישרים ועבים יותר והגרעין מעוות (איור 5). שינויים במצע נוקשות באזור הפצה קבוע לווסת מתח והפצה של סיבי אקטין מתח, וכתוצאה מכך שיפוץ של הגרעין. תצפית זו מצביעה על צימוד מכאני בין נוקשות מטריצה, שלד תא, וגרעין.
| יחס עאם / bisAAm סופי | 40% עאם (μl) | משקל של חימום כדי להמס ב 1 מ"ל HEPES (מ"ג) | bis עאם (2%) (Μl) | HEPES (μl) | מודול יאנג (10 3 Pa) |
| 0.2 / 50 0.5 / 50 1/50 2/50 3/50 | 400 400 400 400 400 | 65 65 65 65 65 | 50 125 250 500 750 | 3,485 3,410 3,285 3,035 2,785 | ~ 1.4 ~ 3.6V ~ 8.7 ~ 17.2 ~ 25 |
הכנת טבלת 1 של הידרוקסי-PAAm הידרוג עם קשיחויות שונות. פתרונות עבודה כדי להכין את הידרוג-PAAm הידרוקסי עם קשיחות סופית הנעה 1.4-25 kPa.
איור 1 (א) Acrylamide (עאם, בשחור), N, N'-methylenebisacrylamide (bis-עאם, בכחול) וN-hydroxyethylacrylamide (HEA, באדום) היו מעורבים יחד כדי ליצור הידרוקסי הידרוג PAAm. (ב) ייצוג סכמטי של השלבים השונים של הליך micropatterning על הידרוג הידרוקסי-PAAm. פתרון של חלבון הוא מודגרות ראשון בשעה 1 על פני המבנה של microstamp (צעד מס '1). משטח הידרוג'ל הוא מיובש בעדינות עם זרימת חנקן (צעד מס '2). Microstamp ממוקם אז במגע רשמי עם משטח הידרוקסי-PAAm במהלך שעה 1 (שלב # 3). לאחר שטיפות רצופות, משטח microprinted הוא פסיבציה עם פתרון BSA סטרילי הופקד O / N ב 4 ° C (# שלב 5) כדי לחסום אזורים מודפסים שאינם. לבסוף, משטח הידרוקסי-PAAm microprinted הוא שטף מספר פעמים עם PBS סטרילי והוא מוכן לזריעת תאים (# שלב 6). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
1010 / "width =" 51010fig2highres.jpg 500 "/>
איור 2 (א) האבולוציה של הקשיחות של הידרוג-PAAm הידרוקסי מתואם באופן ליניארי עם הסכום של bis-עאם צולב מקשר (הקו האדום הוא רגרסיה ליניארית עם R 2 = 0995). תמונות הקרינה (B) של מיקרו תכונות laminin המלבני מוטבעות על הידרוג הידרוקסי-PAAm של stiffnesses שונה (E = 2.5, 15, ו40 kPa). ברים בקנה מידה מתאים ל65 מיקרומטר, (ב) () 80 מיקרומטר, ו (ג) 50 מיקרומטר. (C) קווים מקבילים של 15 מיקרומטר צורת רוחב שיפוע LM על הידרוג'ל 25 kPa הידרוקסי-PAAm, כפי שצוינו על ידי האבולוציה של פרופיל עוצמת הקרינה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
n "src =" / קבצים / ftp_upload / 51010 / "width =" 51010fig3highres.jpg 500 "/>
תמונת איור 3 Immunofluorescence () של פיברונקטין (באדום) וLaminin (בירוק) פסים חצו ב90 °. (B) Multilabeling של פיברונקטין (באדום), Laminin (בירוק) וקולגן (בכחול) פסים microprinted לאחר מכן על מצע 25 kPa הידרוג'ל PAAm. ברים בקנה מידה מתאים ל30 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 (א) כימות של כדאיות תא הפגינה הישרדות תא מצוינת ב24, 48, ו72 שעות לאחר שמצופה על הומוגנית מצופים וmicropatterned משטחי הידרוקסי-PAAm. המספר מצויינים בבתחתית כל בר מתאים למספר הכולל של תאים נספרו עבור assay הכדאיות. כימות (B) של התפשטות HUVECs ביום 25 וב500 מצעים kPa מצופים הומוגנית לאחר 1 (ברים לבנים) ו -7 (ברים מרוסקים) ימים של התרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 תמונות פלורסנט של תאי האנדותל עיקריים immunostained תרבית על micropatterns מצופה FN המלבני, אשר הופקדו על הידרוג הידרוקסי-PAAm של 2.5 kPa, 8.5 kPa, ו25 kPa (משמאל לימין). סיבי אקטין מתח (בירוק ) הוכתמו אלקסה פלואוריד phalloidin 488, הידבקויות מוקד (באדום) הוכתמו polyclo עכברנוגדן ראשוני סופי ושכותרתו עם נוגדן אדום ניאון IgG המשני וDNA היה מוכתם בכחול עם DAPI. הברים בקנה מידה מתאים ל17 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רב בתצפיות מבחנה בביולוגיה של התא מודרני בוצעו על coverslips זכוכית הקשיח, לעתים קרובות מצופה בשכבה דקה של חלבוני ECM או פפטידים סינטטיים המכילים את רצף RGD. עם זאת, מצעי תרבות בסיסיים כגון לא לשחזר את כל מורכבות physicochemical של ECM ולכן אינם מספקים מודל מדויק ללימוד תהליכי mechanotransduction סלולריים. כדי להתמודד עם בעיה זו, אנו מציעים אלטרנטיבה פשוטה functionalize הידרוג דו ממדים עם כל כמות ואופי של חלבוני ECM רצויים. שיטה זו מאפשרת שליטה עצמאית של רמזי mechanotransduction חשובים, כגון נוקשות מטריצה, מורפולוגיה תאית וכליאה או צפיפות התאים ליגנד. בנוסף, הידרוג הידרוקסי-PAAm להתגבר אחת המגבלות הגדולות ביותר של שיטות functionalization הנוכחיות, שהיא חוסר היכולת לשתק ולשלוט בפיזור המרחבי של חלבון ECM יותר מפעם אחת. בשל הזיקה הגבוהה של הידרוXY-PAAm הידרוג למולקולות ביולוגיות, אפשר לשלוט על הפריסה המרחבית של חלבוני ECM שונים על אותו המשטח, ללא קשר לקשיחות המטריצה, על ידי השימוש בmicroprintings רציף, שלא דורש שום ציוד נלווה.
אנו מציעים הליך רומן המבוסס על השילוב של קבוצות הידרוקסיל בתוך הידרוג acrylamide להתגבר הנכסים במהות הלא הדביקים שלהם עם דרישות מינימליות בעלות או מומחיות. בהשוואה לטכניקות קיימות לpatterning חלבונים על הידרוג'ל, שיטת הידרוקסי-PAAm תמנע את השימוש בכימיקלים רעילים קשים (למשל, מימה הידרזין), crosslinkers photoreactive היקר (לדוגמא, Sulfo-Sanpah) והתלות בכוח מנורת UV ומיצוב ל functionalize הידרוג רך. הידרוג הידרוקסי-PAAm להישאר יציב ופעיל במשך כמה שבועות, יכול להיות מיוצר בייצור המוני, microprinted בקלות והזיקה הגבוהה שלהם למולקולות ביולוגיות מאפשרת לחקור תופעות סינרגיסטי שלחלבוני ECM מצומדות על תפקודים תאיים. בנוסף, ניתן להשתמש בהידרוג'ל הידרוקסי-PAAm לחקור את כמות כוחות ההתכווצות המופעל על ידי תאים בmicroenvironment הסובבת אותם מבחינה כמותית. ואכן, יש לנו הראינו בעבר 1,20 שיכולים להיות מוטבעים חרוזי ניאון בקלות בהידרוג הידרוקסי-PAAm, על מנת להשתמש במיקרוסקופ כוח מתיחת תא (TFM) כדי למדוד את שדה העקירה ולהעריך את שדה כוח המשיכה וכתוצאה מכך מופעל על ידי תאים האיקריוטים מצופה על micropatterns דו ממדים.
כפי שרבי שיטות מבוססות microprinting אחרות, המגבלה העיקרית של הידרוג-PAAm הידרוקסי נוגעת לרזולוציה מרחבית של microfeatures חלבון. על הידרוג נוקשה (E> 10 kPa), ברזולוציה מרחבית היא סביב מיקרומטר ונקבעה בעיקר לפי הרזולוציה של הבול, בהתאם לטכניקה ליתוגרפיה נהגה לפברק עובש סיליקון. על הידרוג רך יותר, ברזולוציה מרחבית הופכת נקבעה בחלקו על ידי העיוות משטח דואר במהלך העברת החלבון, אשר הופכת את המגבלה העיקרית להגיע ברזולוציה מרחבית מיקרומטר. הגישה המוצגת כאן היא מוגבלת כרגע למצעים דו ממדים. עם זאת שיטה זו היא הניתנת להרחבה ומחקרים נוספים נמצאים כעת בעיצומו במעבדה שלנו להארכה בשיטה זו למבנים תלת ממדיים.
אנו מקווים כי הידרוג הידרוקסי-PAAm עשוי לעזור לפענח מנגנונים מרכזיים של תהליכים תאיים ורקמות מורכבים האינטימיים הקשורים למאפייני physicochemical של microenvironment התא 21,22, כוללים התפתחות עוברית, תגובות דלקתיות, ריפוי פצעים, תולדת neurite, רקמה בוגרת הומאוסטזיס, ופתוגנזה של מחלות כמו סיסטיק וסרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0.2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin (rabbit) | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
References
- Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
- Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking. Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).
- Atmanli, A., Domian, I. J. Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing. J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).
- Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays. Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).
- Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes. Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).
- Rundqvist, J., et al. High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation. J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).
- Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications. Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).
- Holden, M. A., Cremer, P. S. Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces. J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).
- Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture. Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching. Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).
- Tseng, Q., et al. New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS ONE. 7, e51499 (2012).
- Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli. Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Hemphill, M. A., et al. A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury. PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).
- Tseng, Q., et al. new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells. Nat. Commun. 3, 671 (2012).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus. Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).
- Trappman, B., Chen, C. S. How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective. Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).
