Summary
Biz minimum maliyetle veya uzmanlık ECM proteinlerinin doğrudan bağlanma sağlar hidroksi-PAAm adında yeni bir poliakrilamid hidrojel, sunuyoruz. Microcontact baskı hücresel mechanostransduction eğitim için doğal hücre mikroçevresinin birçok ipuçlarının bağımsız kontrolünü kolaylaştırır ile hidroksi-PAAm kombinasyonu hidrojellerinin.
Abstract
Şimdi de, hücresel işlevleri, hücre dışı matris (ECM), çevre fizikokimyasal ve mekanik hissi veren hücre etkileşimleri düzenlenir olduğu saptanmıştır. Ökaryotik hücreler sürekli biyokimyasal sinyallerin içine ECM fiziksel değişiklikler transdüksivonu için yüzey mechanosensors yoluyla kendi yerel mikroortam duygusu ve gen ifadesi belirli değişiklikleri gerçekleştirmek için bu sinyalleri entegre. İlginç bir şekilde, birbirleriyle ECM kutu çift fizikokimyasal ve mekanik belirleyici değerleri saptanmış, hücre kaderine düzenler. Bu nedenle, mekanotransdüksiyonu anlamak için bir anahtar hücresel fonksiyonları ECM ipuçlarının göreceli katkısını decouple etmektir.
Burada hızlı ve kolay bir in vitro mekanotransdüksiyon ipuçlarının bağımsız ayarlama için biyolojik ilgili hidrojeller oluşturmak için detaylı bir deneysel protokol mevcut. Biz kimyasal olarak modifiye poliakrilamid hidrojeller (PAAm) kendi özünde olmayan ADHES aşmak içinPolimerizasyon sırasında Hidroksil-fonksiyonu akrilamid monomerleri içeren göre özellikleri ive. Bu ECM proteinleri arzu edilen herhangi bir doğada hareketsizleştirilmesine olanak hidroksi-PAAm olarak adlandırılan yeni bir PAAm hidrojel, elde edilmiştir. Microcontact baskı bağımsız olarak, tek-hücre morfolojisi, matris sertlik, doğası ve ECM proteinlerinin yoğunluğunu kontrol etmek için kullanılmasına olanak hidroksi-PAAM kombinasyonu hidrojellerinin. Bu in vitro hücre mekanotransdüksiyon işlemlerinde incelemek için her biyoloji laboratuarda ayarlanabilir basit ve hızlı bir yöntem sağlar. Biz ECM sertlik ve çekirdeği arasındaki mekanik bir bağlantıya göstermek endotel hücreleri üzerinde deneyler yaparak bu romanına iki boyutlu bir platform doğrulamak.
Introduction
Yerel mikro-hücresel birçok yönü (örneğin, sertlik, gözenek boyutu, protein yapısı, ya da hücre-ligand yoğunluğu) böyle bir motilite, hücre proliferasyonu, farklılaşması ve gen sentezlemesi gibi hücresel işlemleri kontrol eden düzenleyici ipuçlarının çalışmalarının oluşturulması sağlar. Hücre dışı ortama fizikokimyasal özelliklerine modifikasyonları, hücreler tarafından algılanan ve hücresel polarizasyon, göç ve farklılaşma dahil olmak üzere farklı deformasyonu fizyolojik sonuçlar, sebep olabilir. Bu hücreleri hücresel biyokimyasal sinyallerin içine ECM değişiklikleri tercüme Ancak, ne kadar belirsizliğini koruyor. Bu nedenle, büyük öneme mekanotransdüksiyon yollarını incelemek için hücreler ile bunların mikro çevreleri arasındaki etkileşimleri üretebileceği in vitro mikro çevrelerinde kontrol Mühendisi etmektir. Bu sorunu çözmek için, biz son zamanlarda kolayca iki kuruş oluşturmak için, hidroksi-PAAm hidrojeller denilen yeni bir yöntem 1, girmiştikburadakilerin yumuşak bağımsız önemli mekanotransdüksiyon ipuçlarını kontrol etmek izin matrisler: matris sertlik, hücre geometrisi ve lohusalık, protein ve hücre-ligand yoğunluğunun doğası.
ECM morphogens -degradeler aracılığıyla hücresel süreçleri (kemotaksisini), yapışkan proteinleri (haptotaxis) ve sertlik (durotaxis) yönlendirir. Son birkaç yıldır, in vitro platformlarda ileri hücreler fizyolojik süreçlere 2-5 içine biyokimyasal ve biyofizik özellikleri çeviremez nasıl didiklemek için bu hücre dışı ipuçlarını izole etmek için geliştirilmiştir. Elektron ışın 6, 7 fotolitografi, fotokimyasal hareketsizlik 8, ya da plazma destekli teknikleri 9 micropatterned substratlar üzerinde yaşayan hücrelerin büyümesini yönlendirmek için geliştirilmiştir. Bu teknikler önemli sonuçlar vermiştir rağmen, çoğu hücre davranışı farklı ipuçlarının bireysel etkisi arasındaki ayrımcılığa izin vermezve onlar birkaç laboratuvarları gelemez teknik olanaklar gerektirir. Bu teknikler arasında, microcontact baskı (μCP), hücre-yapışkan mikro-adalar 10 oluşturmak için sağlam ve erişilebilir bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Daha yakın zamanda, bu alanda harcanan çabaların 11-14 canlı dokularda gözlenen katılıklarının geniş yeniden üretilmesi için ayarlanabilir bükülmezliklerde hidrojel μCP geliştirilmesi için girişimlerde bulunulmuştur. Bu yapıtlar arasında, poliakrilamid (PAAm) 15 popüler hale zaten hücre biyomekanik analizleri için en yaygın olarak kullanılan polimer esaslı matrisler biridir.
PAAm yüzeylerinin, N-sülfosükinimidil-6-[4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sülfo-SANPAH) ve ECM proteinlerinin sülfo-SANPAH nitrofenil UV aktivasyonu ile yüzeye bağlı olan heterobifonksiyonel çapraz bağlayıcı ile işlevselleştirilen azid gruplarının 16. Bir başka teknik, ciddi bir şekilde okside edilmiş proteinlere bağlanma hidrazin oluşurperiodat ile 17. Hynd ve arkadaşları bir acroyl-streptavidin monomer 18 varlığında fotopolimerizasyonu gerektirir protein ve peptitler ile biomimetic hidrojel yüzeyleri desenlendirme için bir tekniği tanıttı. Daha yakın zamanda, Tseng ve ark. 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür ile aktif hale Pensilvanya jeller inkübe gerektiren bir optik kuvars maske aracılığıyla PAAM derin, UV'ye maruz dayalı yeni bir yöntem micropatterning 19 (EDC) bildirmişlerdir ve N-hidroksisukinimid (NHS) su solüsyonları, önceki protein ekleyin. Uzun sentez yöntemleri (örneğin, diyaliz, liyofilizasyon, vb), pahalı kimyasal bileşikleri (örneğin, hiyaluronik asit, sülfo-SANPAH) ya da derin UV: homojen ve yeniden üretilebilir bir proteinler micropatterns oluşturmak için bu tekniklerin yeteneği rağmen, çoğu büyük sınırlamaları acı ışınlama. Buna ek olarak, bu teknikler, alt-tabaka sertliği mikrodesenlerle bağımsız modülasyonuna izin vermezGeometri, ECM protein yapısı ve hücre-ligand yoğunluğu.
Dikkate bu sınırlamaları alırsak, biz yumuşak hidrojel proteinlerin ve biyomoleküllerin çeşitli immobilizasyon sağlar ve hücresel fonksiyonlarda rollerini deşifre etmek için mekanotransdüksiyon ipuçlarının bağımsız ayar veren bir roman ve basit akrilamid-temelli bir yaklaşım geliştirdik. Bunun yerine sert kimyasal bileşikler ile tedavi edilmesi için PAAm hidrojeller, biz PAAm polimerizasyon sırasında hidroksil grupları ile ticari bir akrilamid getirmektedir. Bu basit işlem herhangi diğer teknik gereksinimleri olmadan PAAm hidrojellerin içsel anti-yapışkan özelliği üstesinden gelir.
Hidroksil gruplarının varlığı hidrojen bağı etkileşimlerini oluşturan proteinler ve biyomoleküllerin hidroksi-PAAm hidrojellerin yüksek afinite yol açar. ΜCP ile birlikte, hidroksi-PAAm hidrojeller bağımsız kontrolü olan iki boyutlu bir kültür platformunun hızlı bir üretimini mümkün kılmakmekanotransdüksiyonu eğitimi için güçlü bir platform olması öngörülen matriks katılık, ECM proteinleri türü, hücre-ligand yoğunluğu ve sınırlı yapışabilmede, üzerinde.
Bu protokolün amacı, kolaylıkla malzeme bilimleri herhangi uzmanlığı olmadan hidroksi-PAAm hidrojeller yapmak için gerekli bilgileri sağlamaktır. Araştırmacılar patofizyolojik mekanizmaları içinde yer mekanotransdüksiyon yollarının daha iyi anlaşılmasına yol açabilir hücresel ve doku düzeyinde fizyolojik ilgili soru sormak için nihai hedefi bir araç sağlamaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cam lameller Yüzey etkinleştirme
- Bir Petri kabı ve smear (önerilen kimyasal davlumbaz) 5 dakika için üzerine 0,1 M NaOH çözeltisi koyun cam dairesel lamelleri (25 mm çap).
- NaOH çözüm çıkarın ve yavaşça steril bir kültürü kaputu bir sallanan plaka üzerinde sallanan ise tam 20 dakika boyunca steril GKD 2 O ile lamelleri batırmayın.
- Steril GKD 2 O boşaltın ve adımı 1.2 tekrarlayın.
- Steril bir cımbız ile lamelleri çıkarın ve aktif yüzü yukarıya yeni bir Petri tabağına yerleştirin.
- Yüksek saflıkta bir azot gazı akışı altında sabit bir kuru lamelleri.
- Bir steril kültür kaput, 1 saat boyunca lamel aktive tarafında 3-(trimetoksisilil) propil akrilat (% 92) ince bir tabaka sürün.
- Yaygın steril GKD 2 O 3 yıkar cam lamelleri yıkayın ve yeni bir Petri kabındaki steril GKD 2 O bunları bırakın.
- Petri kabı dokununParafilm ile ve 10 dakika için hafif ajitasyon altında olan bir kavrama plakası üzerine yerleştirin.
- Ince ipuçları ile steril bir cımbız ile GKD 2 O gelen lamelleri çıkarın ve aktif yüzü yukarıya yeni bir Petri tabağına yerleştirin.
- Lamelleri yapışmasını toz önlemek için alüminyum folyo ile kuru bir yerde oda sıcaklığında saklayın.
Hidroksi-PAAm hidrojellerin 2. Hazırlık
- , 1.5 ml'lik Eppendorf tüpü içinde N-hidroksietil akrilamid (HEA) 65 mg ağırlığında hazırlayın. Bu taze HEA solüsyonu hazırlamak için önemlidir.
- HEA kadar 50 mM HEPES tamponunun 1 ml ilave edilir ve tam çözünme gerçekleşene kadar HEA bir vorteks cihazı kullanılarak karıştırın.
- İstenen hidrojel sertliği ulaşmak w / HEPES akrilamid çözeltisi ve / hepes-bis-akrilamid çözeltisi içinde ağırlık (Tablo 1 e bakınız) ağırlık oranı% 2 olan gerekli hacimde% 40 ağırlık 400 ul ilave edin. 5 ml'lik bir nihai hacme, 50 mM HEPES ile ayarlayın.
- Bir vorteks ve Degas kullanarak çözüm karıştırınhidroksi-PAAm polimerizasyonunu önleyen solüsyonu içindeki oksijen konsantrasyonunu azaltmak için 20 dakika boyunca vakum odasındaki.
- , Steril bir başlık altında, sterilize etmek için bir 0.2 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre ile degased çözelti filtre.
- 7 dakika boyunca UV / ozon temizleyici dairesel cam lamelleri (22 mm çap) etkinleştirin.
- % 10 amonyum persülfat (APS) çözüm 100 ul hazırlayın, bu 100 ul GKD 2 O. 10 mg APS Bu taze APS-eriyiğinin hazırlanması önemlidir.
- Polimerizasyonun başlatılması için tetrametilendiamin 2.5 ul (TEMED) ile sterilize hidroksi-PAAm çözeltisi (adım 2.5) APS çözeltisi 25 ul ekle. , Steril koşullar altında, kabarcıkların giriş olmadan 3 ardışık pipettings çözeltiyi karıştırın.
- , Steril bir başlık altında, 22 mm yer gl hemen (adım 1.9 temin edilebilir) ve 25 mm örtücü kısım üzerine hidroksi-PAAm çözeltisi 25 ul damla yerleştirmekdamlasının üstüne eşek lamel (adım 2.5 ile elde edilmiş) çözeltisi hidroksi-PAAm sıkmak. Steril bir cımbız ile 22 mm cam lamel merkezi ve kabarcıkları yumuşatır.
- Hidroksi-PAAm hidrojeller, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında polimerize olmaya bırakın. Polimerizasyon işleminin tamamlanmasını takip Eppendorf tüpü içinde el ile geriye kalan hidroksi-PAAm çözeltisi ters çevirin.
- Tam steril GKD 2 O lamelleri sokmak ve dikkatli bir şekilde 22 mm 'lik cam lamelleri ve hidroksi-PAAm hidrojel tabakası arasında bir traş makinesi bıçak kenarına tanıtarak 22 mm ebadındaki bir cam lamelleri ayırın.
- Steril PBS ile hidroksi-PAAm hidrojeller yıkayın (PBS 3 borsalar) ve tam hidrasyon korumak için steril PBS dalmış jeller edelim.
- 3 güne kadar, 4 ° C'de steril PBS hidroksi-PAAm hidrojeller saklayın.
3. Polidimetilsiloksan (PDMS) Microstamp imalatı
NOT: Bir silikon usta imalat sta önce gerekliPDMS microstamp imalat rt. Bir silikon ustanın Bu mikroimalat özel ekipman ve eğitim gerektirir taşbaskı teknikleri ile yapılabilir. Bir Nanofabrikasyona tesisi ile işbirliği silikon ana imal teşvik edilmektedir. Alternatif olarak, talep üzerine ısmarlama mikrostrüktürlü silikon ustaları fabricates bir şirkete başvurun. Bu silikon master fabrikasyon tek ihtiyacı bir kez yapılması dikkat etmek önemlidir. Gerçekten de, mikrostrüktürlü silikon ustaları elastomerik pulları elde etmek için süresiz kullanılabilir.
- Karışım PDMS ve bir 10 sertleştirme ajanı: plastik bir şişeye 1 oranında 10 dakika boyunca, bir pipet kullanılarak iyice karıştırın.
- Aşama 3.1 sırasında oluşmuş hava kabarcıklarını çıkarmak için vakum altında PDMS karışım gaz çıkışına.
- Bir Petri kabındaki mikrostrüktürlü silikon ustası yerleştirin ve kabarcıklar oluşturan olmadan bunun üzerine gazdan arındırılmış PDMS karışımı bir 10 mm kalınlığında bir tabaka döküm.
- Bir 60 ° C 'de 2 saat boyunca PDMS tedavi sağlarfırın.
- Bir neşter ile tozsuz bir ortamda, soyulan PDMS katman ve tüketim 1 cm 2 microstamps.
- Forseps kullanarak, yer PDMS bir Petri kabındaki desen-up microstamps.
4. micropatterning Hidroksi-PAAm hidrojeller
- 15 dakika boyunca, bir etanol / su içinde yer PDMS microstamps (50/50) çözeltisi ve sonikasyon.
- Nitrojen akışı akımı ile pul kurutun ve onları, 7 dakika boyunca UV / ozon süpürge (λ <200 nm) model-up yerleştirin.
- , Steril bir başlık altında, bir 1 cm'lik 2 PDMS damga mikroyapılı yüzeyi üzerine arzu edilen bir protein çözeltisi (örneğin, 100 ug / ml PBS içinde laminin veya 25 ug / ml PBS içinde fibronektin) bir 150-ul damla yerleştirin.
- İsteğe bağlı: hücre yoğunluğu ligand modüle protein çözeltisinin konsantrasyonu değiştirin.
- Her bir köşesine doğru bir pipetle steril bir ucu ile taşıyarak damga yüzeyi boyunca protein çözeltisi yayılırdamga.
- , Steril bir başlık altında 60 dakika boyunca PDMS damga adsorbe etmek için protein çözeltisi bırakın. Protein zarar görmesini önlemek için lambalarını kapatın.
- , Steril bir başlık altında, bir Petri kutusu içine (adım 2.13 den temin edilebilir), hidroksi-PAAm kaplı lamelleri aktarın.
- Steril koşullar altında düşük bir azot akımı ile hidroksi-PAAm alt tabakaların yüzeyine aşırı PBS çıkarın. Kısa jel yüzeyde duran su olduğuna dair bir kanıt olarak görülmektedir işlemi durdurun. Jel, bu aşamada iyice kurutulmuştur olmamalıdır.
- Kuru dikkatle PDMS yapılandırılmış yüzey, yüksek saflıkta bir azot gazı akımı ile sürekli bir damga.
- Pansuman doku forseps ile, protein kaplı damgası tutun ve kurutuldu hidrojel yüzeyi ile temas edecek şekilde yapılandırılmış yüzey yerleştirin. Pul microfeatures ve hidrojel yüzeyi arasında iyi bir temas sağlamak için PDMS damga üstündeki cımbız ucu ile kısa bir basınç noktaları uygulanır.
- Th PDMS damga bırakınoda sıcaklığında 1 saat e hidrojel yüzeyi.
- Yavaşça soyunma doku forseps ile hidroksi-PAAm hidrojellerin PDMS pulları kaldırmak ve damga temizlemek için adım 4.1 izleyin.
- Değişimi başına 10 dakika boyunca PBS içerisinde, steril koşullar 3 değişimi (pH = 7.4) ile yoğun bir şekilde hidroksi-damgalı PAAm hidrojeller yıkayın.
- İsteğe Bağlı Diğer ECM proteinlerinin ek Micropatterns adımlarını 4,5-4,11 izleyerek hidroksi-PAAm yüzeye eklenebilir.
- Sallanan plaka üzerinde hafif ajitasyon altında 4 ° C de bir gece boyunca PBS içinde 5 mg / ml BSA içinde steril bir çözelti ile Pasif yapma basılı olmayan bölgeleri.
- Değişimi başına 10 dakika boyunca PBS içerisinde, steril koşullar 3 değişimi (pH = 7.4) ile iyice yıkayın. Bu aşamada, damgalı hidroksi-PAAm hidrojeller bir haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
Micropatterned hidroksi-PAAm Hidrojeller 5. Hücre Birikimi
- Önce kaplama c 30-45 dakika boyunca hücre ortamındaki hücre lamelleri inkübearşın.
- 37 ° C'de steril PBS ile 75 cm 2 kültürü şişesi içinde kültürlenmiş yapışmayan hücreler yıkanır ve 10 dakika boyunca tripsin-EDTA 3 ml ya da Accutase ile çıkarınız.
- G müstakil hücreleri ihtiva eden şişe içine cep hattı için önceden ısıtılmış tam büyüme ortamı uygun istenen miktarda aktarın ve x, 650 ° C'de 3 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj.
- Mikropipet ile süpernatantı ve 15-20,000 hücre / ml komple kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri.
- 1-2 saat için nem (Kademe 5.1 de elde edilmiş), bir lamel micropatterned hücre çözeltisi 4 ml ilave edilir ve hücre yer kaplı bir lamel kültürü inkübatöründe 37 ° C'de ve% 5.
- Aspire hafifçe bekâr hücreleri ve kültür ortamı değiştirin. Inkübatör bağlı hücreleri dönün ve onları (hücre tipine bağlı olarak, 3-6 saat) tam olarak yayılmasına izin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A ile akrilamidin kopolimerleştirme (akrilamid) ve bisakrilamid (bis-akrilamid), N-sunulur hydroxyethylacrylamide gömülü hidroksil grupları ile rastgele radikal polimerizasyonu ile poliakrilamid, su-teşekkül eden bir primer hidroksil ihtiva eden (HEA) monomerler, (hidroksi-PAAm) . Bu protokol, HEA bir ağırlık 65 mg HEPES 1 ml'lik bir hacim içinde seyreltilmelidir. HEA yoğunluğu birine kabaca eşit olduğunu bilerek, biz 1.065 ul (HEA + HEPES) bir çalışma hacmi elde varsayalım. Tablo 1 'de görüldüğü gibi, AAm 400 ul ve bisAAm 50 ul 1.065 ul toplam eklenmesi 1515 ul'lik bir hacme yol açar. Bu nedenle HEPES 3485 ul'lik bir hacmi, 5 ml lik bir son hacme çözeltinin ayarlamak için gereklidir. Adım 2.6 'de belirtildiği gibi, 22 mm' lik cam lamel yüzeyi neden olmadan ortadan kaldırılması için UV / Ozon 7 dakika boyunca aktive edilmiş olmalıdırhidrojel yüzeye herhangi bir hasar. Gerçekten de, söz konusu cam yüzeyleri, UV / ozon tedavi sonrası daha hidrofilik hale gelir ve bu nedenle suda çok kolay tüm sistemi daldırılmasıyla çıkarılabilir. Buna ek olarak, UV / ozon tedavisi hidrojel yüzeyi ile doğrudan temas halinde olan 22 mm'lik bir örtücü cam, kimyasal kirlenmesini önler. Bu teknik, bir izin cam lamel bağlanmış bir düz ve yuvarlak bir poliakrilamid yüzey (22 mm çapında) (çapı 25 mm) elde edilmiştir.
Şekil 1B 'de görüldüğü gibi, protein Micropatterns mikrokontak baskı, hidroksi-PAAm hidrojellerin yüzeyi üzerinde oluşturulabilir. Bu deneysel prosedürde, UV / Ozon riskler yüzeyinde silanol gruplarını oluşturarak geçici PDMS pulları içsel hidrofobikliğini azaltmak için izin verir. 254 nm hattı atomik oksijen ozon dönüştürür Nitekim, 185 nm çizgi moleküler oksijen ozon üretir. Bu reaktif türevler, siloksan ba saldırırPDMS ckbone oksijen açısından zengin bir SiOx silika benzeri tabaka ve Si-OH, yüzey grupları oluşturur. Oksitlenmiş PDMS yüzeyi, yüzeye, toplu faz düşük molekül ağırlıklı çapraz bağlanmamış polimer zincirlerinin göç havaya maruz bırakıldıktan sonraki birkaç saat içinde kendi hidrofob geri bilinmektedir. Bu strateji, PDMS damga yüzeyi üzerinde protein çözeltinin yayılmasını sağlar.
Bu yöntemin en önemli avantajlarından biri, bağımsız bir şekilde matriks sertliği (Şekil 2A), mikrodesenlerle geometrisini (Şekil 2B), hücre-ligand yoğunluğu (Şekil 2C), ve protein yapısı (Şekil 3A ve 3B) modüle etmektir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, hidroksi-PAAm hidrojeller hücresel mikro-sertliği ince tekrar yaratılmasına izin verecek birkaç düzine kPa kPa'dan az çapraz bağlayıcı konsantrasyonuna elastik modülünün doğrusal bir bağımlılık göstermektedir. Şekil 2B Şekil 2C, hücre olduğunu göstermektedir -ligand yoğunluğu PDMS pulları inkübe için kullanılan protein çözeltisinin konsantrasyonu değiştirilerek modüle edilebilir. 3 ardışık mikrokontak baskılar kullanılarak, laminin ve fibronektin hatları üzerine basılmış kollajen hatları bir floresan görüntü sunar Şekil.
Okuyucular çeşitli boyutlarda ve micropatterns şekilleri, verimli olursa olsun hidrojel sertlik damgalanmış olan dikkat etmesi ilginçtir. Biz hiçbir majo olduğunu gösteren, başarılı keskin kenarlar (örneğin, üçgenler ve yıldızlı) ve düz (örneğin, çizgiler), ya da eğri (örneğin, daireler) şekiller ile proteinlerin microfeatures çoğaltılamazdesen karmaşıklığı r sınırlama. Tek hücre deneyde, micropattern yüzey alanı 400 ve 2500 mikron 2, tek bir hücre canlılığının sınıra karşılık gelen düşük bir değer arasında değişir. Diğer birçok microprinting tabanlı yöntemler olarak, sunulan yöntemin ana sınırlama onun uzaysal çözünürlüğü ile ilgilidir. "Yumuşak" hidrojeller üzerine, çözünürlük sınırı kısmen sırasında oluşabilecek yüzey deformasyon tarafından belirlenir hale oysa, sert hidrojeller (E> 10 kPa) üzerine, uzaysal çözünürlüğü mikrometre civarındadır ve özellikle damga kararı ile belirlenir Protein transferi.
Hidroksi-PAAm hidrojellerin toksisite homojen bir şekilde kaplı üzerinde kültür içerisinde 1, 2, ve 3 gün boyunca birincil kaplama, endotel hücrelerinin canlılığı ve mikro basılı yumuşak hidroksi-PAAm hidrojeller (Şekil 4A) nicelleştirilmesiyle incelenmiştir. HUVEC'lerin yaklaşık% 80 muhafaza micropatterned yumuşak hidroksi-PAAm hidrojel kaplamahidroksi-PAAm bir biyouyumluluk gösteren üç gün boyunca kendi canlılığı, hücre kültürü için hidrojellerinin. İlginç bir şekilde, benzer bir canlılığı kortikal nöron hücreleri ile laboratuar ortamında elde edildi. Buna ek olarak, primer endotel hücreleri, bu yöntem katılıklarının geniş bir dizi hücre çoğalmasını incelemek için uygun bir mikro-ortam sağladığını belirtmektedir, "yumuşak" (25 kPa) ile alt-tabakalar (Şekil 4B) ile karşılaştırıldığında (500 kPa) "sert" üzerinde çoğalır .
Mechanotransduction Alt tabaka sertliğinin etkisi ve yayılma alanı ayrılması için primer endotel hücreleri (HUVECler) dikdörtgen FN-kaplanmış micropatterns ekildi üç çeşitli sertlikte (2.5, 8.5 hidroksi-PAAm hidrojeller üzerinde biriken (1.200 mikron 2 sabit bölge) ve 25 kPa). Memenin için kullanılan Sonra, HUVECler, standart immünositokimya prosedürüyle aktin filamentler, vinkülin ve DNA için boyandıcam alt-tabakalar üzerine kaplanmıştır Lian hücreleri. Sert yüzeylerde, aktin lifleri daha düz ve daha kalın ve çekirdek deforme (Şekil 5) ise yumuşak yüzeylerde, HUVECler, düşük aktin lif yoğunluğu ve yuvarlak bir çekirdek sergiler. Sabit yayılma alanı yüzey sertliği değişiklikler çekirdeğin yeniden sonuçlanan aktin stres liflerinin gerginlik ve dağıtımı, modüle. Bu gözlem matris sertlik, hücre iskeleti ve çekirdeği arasındaki mekanik bir bağlantıya işaret etmektedir.
| Nihai AAm / bisAAm oranı | Akrilamid% 40 (ul) | HEA ağırlığı 1 mi HEPES (mg) çözmek için | bis akrilamid (% 2) (Ul) | HEPES (ul) | Young modülü (10 3 Pa) |
| 0.2 / 50 0.5 / 50 1/50 2/50 3/50 | 400 400 400 400 400 | 65 65 65 65 65 | 50 125 250 500 750 | 3.485 3.410 3.285 3.035 2.785 | ~ 1.4 ~ 3.6 ~ 8.7 ~ 17.2 ~ 25 |
Hidroksi-PAAm Tablo 1. Hazırlık çeşitli bükülmezliklerde hidrojellerinin. Çalışma çözümler 1,4 ila 25 kPa aralığındaki nihai sertliğe sahip hidroksi-PAAm hidrojelleri hazırlamak.
Şekil 1. (A) akrilamid (AAm, siyah), N, N'-metilenbisakrilamid (mavi bis-akrilamid) ve N-hydroxyethylacrylamide (HEA, kırmızı) hidroksi oluşturmak için bir arada karıştırılmıştır PAAm hidrojeller. (B) hidroksi-PAAm hidrojel micropatterning prosedürün farklı adımları şematik gösterimi. Protein çözeltisi ilk önce bir microstamp (aşama # 1) yapısı yüzünde, 1 saat boyunca inkübe edilir. Hidrojel yüzeyi üzerine nazikçe bir azot akışı (aşama # 2) ile kurutulur. Microstamp sonra 1 saat (3. aşama) sırasında hidroksi-PAAm yüzeyi ile resmi temas edecek şekilde yerleştirilir. Birbirini takip eden yıkamadan sonra, mikro basılı yüzey 4 ° C (Adım 5) basılı olmayan bölgeleri bloke etmek O / N kaplı steril bir BSA çözeltisi ile pasive edildiğini göstermektedir. Son olarak, mikro basılı hidroksi-PAAm yüzey steril PBS ile birkaç kez yıkanır ve hücre tohumlama (adım # 6). Için hazır olduğunu , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
1010 / 51010fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 2. (A) hidroksi-PAAm hidrojellerin sertliğinin evrimi doğrusal bis-akrilamid çapraz bağlayıcı (kırmızı çizgi R 2 = 0995 olan bir lineer regresyon) miktarı ile orantılıdır. (B) Floresans görüntülerin çeşitli sertlikte (B = 2.5, 15, ve 40 kPa)-hidroksi-PAAm hidrojeller damgalı dikdörtgen, laminin mikro özellikleri. Ölçek çubukları, (A) 65 um, (B), 80 um, ve (C) karşılık gelen 50 um. (C), 15 mm genişlik, 25 kPa biçimde hidroksi-PAAm hidrojel bir LM degrade paralel çizgiler, evrimi ile gösterildiği gibi floresan yoğunluk profilinin. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
n "src =" / files / ftp_upload / 51010 / 51010fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
90 ° geçti çizgili (yeşil) Şekil 3. (A) İmmünofloresan Fibronektinin görüntü (kırmızı) ve laminin. (B) (kırmızı), fibronektin, laminin (yeşil) ve çizgili (mavi) kollajen Multilabeling mikro basılı daha sonra, bir 25 kPa hidrojel PAAm alt-tabaka üzerinde. Ölçek çubukları 30 um gelmektedir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. (A), hücre canlılığının miktar 24, 48 en iyi şekilde hücre yaşamım gösterdi ve üzerine kaplanmış ve 72 saat sonra, homojen bir şekilde kaplı ve hidroksi-PAAm yüzeyleri Micropatterned. Numara ile gösterilenHer çubuğun alt. kalım deneyi için sayılan toplam hücre sayısına karşılık gelen 1 (beyaz çubuklar) ve 25 sonra 500 kPa homojen kaplanmış alt-tabakalar üzerinde HUVECler proliferasyon (B) miktarının belirlenmesi ve 7 (karma bar) kültürün gün. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yeşil Floresan Şekil 5. 2.5 kPa, 8.5 kPa hidroksi-PAAm hidrojeller üzerine biriktirilmiştir dikdörtgen FN kaplı micropatterns, kültüre immüno-primer endotel hücreleri görsel ve 25 (soldan sağa) kPa. Aktin stres fiberler ( ) Alexa Fluor 488 falloidinle, fokal yapışmalarda (kırmızı) fare polyclo ile boyandı ile boyandınal birincil antikor ve bir kırmızı floresan IgG sekonder antikor ile DNA ile etiketlenmiş DAPI ile mavi ile boyanmıştır. Ölçek çubukları 17 mikron karşılık gelmektedir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modern hücre biyolojisi, in vitro gözlemler çoğu, çoğunlukla ECM proteinleri veya RGD sekansı ihtiva eden sentetik peptitler, ince bir tabaka ile kaplanmış katı bir cam lameller üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu temel kültür alt-tabakalar hücresel süreçler üzerinde çalışılması için mekanotransdüksiyon doğru bir model sağlamaz ve böylece ECM'nin bütün fizikokimyasal ve karmaşıklığını büyük ölçüde özetleyebildiğini yoktur. Bu sorunu çözmek için, biz istenilen miktarda ve ECM proteinleri doğa ile iki boyutlu hidrojeller fonksiyonelleştirilmesi basit bir alternatif önermek. Bu yöntem, matris sertlik, hücresel morfoloji ve lohusalık ya da hücre-ligand yoğunluğu gibi önemli mekanotransdüksiyon ipuçlarının, bağımsız kontrolünü sağlar. Buna ek olarak, hidroksi-PAAm hidrojeller hareketsiz hale getirmek için, birden fazla ECM proteininde uzamsal dağılımını kontrol etmek için yetersizliğidir mevcut işlevselleştirme yöntemlerin en büyük sınırlandırmalardan biri üstesinden gelir. Nedeniyle hidro yüksek afinitexy-PAAm biyomoleküllerin, bir herhangi bir ilave ekipman gerektirmeyen sıralı microprintings kullanarak aynı yüzey üzerinde çeşitli ECM proteinlerinin uzaysal dağılımının, bağımsız olarak matris sertliğini kontrol edebilir hidrojellerinin.
Biz maliyet veya uzmanlık minimal gereksinimleri ile kendi içsel olmayan yapıştırıcı özelliklerini aşmak için akrilamid hidrojellere içinde hidroksil gruplarının dahil dayalı yeni bir yöntem öneriyoruz. Hidrojeller proteinleri desenlendirme için mevcut teknikler ile karşılaştırıldığında, hidroksi-PAAm yöntem kuvvetli toksik kimyasal maddeler (örneğin, hidrazin hidrat), pahalı ve fotoreaktif çapraz bağlayıcılar (örneğin, sülfo-SANPAH) ve UV lamba gücünün ve konumlandırma bağımlılık kullanılmasını önler yumuşak hidrojeller işlevselleştirmek. Hidroksi-PAAm hidrojeller, birkaç hafta stabil kalır ve aktif kütle elde edilebilir, kolayca mikro basılı ve biyomoleküller için yüksek afinite sinerjistik etkilerini araştırmak sağlarhücresel fonksiyonları üzerine konjuge ECM proteinleri. Buna ek olarak, hidroksi-PAAm hidrojeller nicel olarak mikro-çevresindeki bir hücre tarafından uygulanan sıkışma kuvvetleri miktarını araştırmak için kullanılabilir. Gerçekten de, floresan boncuk kolayca değiştirme alanının ölçülmesi için hücre çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) kullanmak için, hidroksi-PAAm hidrojeller gömülebilir ve ökaryotik hücre tarafından uygulanan çekme edilen alan üzerine kaplanmıştır tahmin, daha önce 1,20 göstermiştir iki boyutlu Micropatterns.
Diğer birçok microprinting dayalı yöntemler, hidroksi-PAAm hidrojellerin başlıca sınırlaması proteini microfeatures uzaysal çözünürlüğü ile ilgilidir. Sert hidrojeller (E> 10 kPa) üzerine, uzaysal çözünürlüğü bir mikrometre civarındadır ve özellikle silikon kalıp imal etmek için kullanılan litografi tekniğine bağlı olarak damga kararı ile belirlenir. Yumuşak hidrojel, uzaysal çözünürlüğü kısmen th tarafından belirlenir halemikrometre mekansal çözüme ulaşmak için başlıca sınırlama olur protein transferi sırasında e yüzey deformasyonu. Burada sunulan yaklaşım, şu anda iki boyutlu alt-tabakalar ile sınırlıdır. Ancak bu yöntem son derece ölçeklenebilir ve daha fazla çalışma, üç boyutlu yapılar için bu yöntemi genişletmek için laboratuarımızda halen devam etmektedir.
Bu hidroksi-PAAm hidrojeller iyice embriyonik gelişme, iltihaplı tepkiler, yara iyileşmesi, nevrit dışa büyümesinin, yetişkin doku da dahil olmak üzere mikro-hücre 21,22 arasında fizyo-kimyasal özellikleri ile ilişkili kompleks hücresel ve doku süreçlerin kilit mekanizmaları deşifre yardımcı olabilir umut homeostazis ve fibrozis ve kanser gibi hastalıkların patogenezi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0.2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin (rabbit) | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
References
- Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
- Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking. Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).
- Atmanli, A., Domian, I. J. Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing. J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).
- Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays. Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).
- Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes. Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).
- Rundqvist, J., et al. High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation. J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).
- Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications. Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).
- Holden, M. A., Cremer, P. S. Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces. J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).
- Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture. Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching. Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).
- Tseng, Q., et al. New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS ONE. 7, e51499 (2012).
- Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli. Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Hemphill, M. A., et al. A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury. PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).
- Tseng, Q., et al. new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells. Nat. Commun. 3, 671 (2012).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus. Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).
- Trappman, B., Chen, C. S. How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective. Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).
