Summary
O circuito de alimentação em larvas de Drosophila melanogaster serve um modelo simples, mas poderosa que permite mudanças na taxa de alimentação a ser correlacionada com alterações no circuito neural stomatogastric. Este circuito é composto por neurónios serotonérgicos centrais que enviam projecções para os ganchos na boca, bem como o tubo digestivo anterior.
Abstract
O circuito de alimentação serotonérgica em larvas de Drosophila melanogaster pode ser usado para investigar substratos neuronais de importância crítica durante o desenvolvimento do circuito. Usando a saída funcional do circuito de alimentação, alterações na arquitectura neuronal do sistema estomatogástrico pode ser visualizado. Comportamento alimentar pode ser registada por meio da observação da taxa de retracção dos ganchos na boca, que recebem a inervação do cérebro. Comportamento locomotor é usado como um controlo fisiológico da alimentação, uma vez que as suas larvas usar ganchos na boca para percorrer através de um substrato de agar. Alterações no comportamento alimentar pode ser correlacionada com a arquitectura axonal das neurites que inervam o intestino. Usando imunohistoquímica é possível visualizar e quantificar essas mudanças. O manuseio inadequado das larvas durante paradigmas de comportamento pode alterar dados como eles são muito sensíveis a manipulações. Imagem adequada da arquitetura neurite inervaçãoo intestino é crítica para a quantificação exacta do número e tamanho das varizes, bem como o grau de nós de ramificação. Análise da maioria dos circuitos de permitir apenas a visualização da arquitetura neurite ou efeitos comportamentais, no entanto, este modelo permite correlacionar a saída funcional do circuito com as deficiências na arquitetura neuronal.
Introduction
Drosophila é um sistema modelo extremamente poderosa para o estudo do desenvolvimento neural circuito devido ao tempo de geração rápidos e de baixo custo experimental, e a capacidade de manipular e controlar os factores genéticos e ambientais. Neurogênese, descoberta caminho neuronal e sinaptogênese são conservados entre os humanos e Drosophila, portanto os mecanismos de criação, manutenção e modificação de circuitos neurais são conservadas também.
Neurotransmissores clássicos, como a serotonina (5-hidroxitriptamina ou 5-HT) podem servir como fatores de crescimento antes de adotar seus papéis como moléculas de sinalização no circuito neural maduro 1-3 Estudos anteriores demonstraram que os níveis perturbado de 5-HT durante o desenvolvimento embrionário altera a conectividade de neurónios maduros 4. Outros mostraram que a aplicação ectópica de 5-HT dos neurónios Helisoma reprimir o crescimento de neurites em cultura, bem como sinaptogénese 5-7. Em Drosophila, desenvolvimento níveis de 5-HT está inversamente relacionada com o número e tamanho varicosidade, bem como o grau de arborização urbana, ao longo do comprimento de neurites que se projectam para o intestino anterior do SNC 8.
Neurotransmissão serotonérgica foi mostrado para modular comportamentos alimentares em diversas espécies, incluindo Drosophila 8-9. O circuito de alimentação em Drosophila é um circuito relativamente simples que pode ser usado como um modelo para correlacionar a saída funcional (alimentação) com alterações no desenvolvimento das projecções axonais do cérebro para o intestino anterior. Schoofs et al. têm mostrado que a Drosophila alimentação larval é regulada por geradores de padrão central que influenciam a musculatura 10. Embora a anatomia muscular específico não é completamente compreendido, tem sido mostrado que o nervo da antena, nervo maxilar, e nervo acessório protorácico são responsáveis pelas metas musculares envolvidos nocomportamento alimentar. A maioria dos dados que envolvem a musculatura e nervo anatomia de alimentação de invertebrados é limitado a larvas Calliphora.
A taxa de alimentação de larvas de segundo instar pode ser avaliada pela retração dos sclerites cefalofaringeano (ganchos na boca), e é reprodutível e de alto rendimento. As placas cefalofaringeano são inervados por fibras do centro de neurônios de 5-HT através do nervo frontal. O proventrículo, ou intestino anterior, é inervado por fibras serotoninérgicos (recurrens nervo) que fasciculada no intestino médio e são responsáveis por contrações do intestino anterior (Figura 1) 11-12. Alterações na ramificação axonal, e o número e tamanho das varizes ao longo do comprimento da neurite, pode ser quantificada utilizando técnicas de imuno-histoquímica. Manipulando neuronal da 5-HT durante o desenvolvimento, quer directa quer indirectamente, pode alterar a saída funcional do circuito de alimentação, que pode ser avaliada e correlacionadas com as mudanças na morphology da arquitetura neurite.
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Protocol
1. Manutenção de Gaiolas População
- Manter gaiolas população a 25 ° C num ciclo de luz-escuro de 12 h. Enquanto os grupos de controlo e experimentais estão expostas às mesmas condições de iluminação, esta técnica pode ser realizada em ambiente de laboratório padrão.
- Permitir fêmeas põem ovos durante a noite em placas de ágar-suco de maçã.
- Recolha de larva, mantendo as placas com os ovos depositados recentemente, a 25 ° C durante 24 hr. Colocar uma pequena dose de levedura no meio da chapa para atrair as larvas eclodidas.
- Recolhe 1 r larvas que migraram para a pasta de levedura, no centro da placa de sumo de maçã. Use uma espátula de metal para transferi-lo para uma placa de suco de maçã fresca. Pasta de levedura adicional pode ser adicionado para garantir que não é uma alimentação adequada até que os ensaios são realizados. Placas de sumo de uva, também pode ser usado no lugar de placas de sumo de maçã.
- Obter tarde 2 ª e início 3 º instar larvae permitindo 1 º ínstar de idade para 40-48 horas. Dentro desta faixa das taxas de alimentação são constantes 13. A idade pode ser confirmado por meio de exame dos ganchos na boca uma vez que existem alterações distintas na estrutura desta com cada um muda de larvas.
- Tarde 2 larvas 3 ª nd-precoce são coletados para ensaios de comportamento suavemente e extensivamente lavando pratos suco de maçã com água e coleta de larvas em um filtro de malha. As larvas são então transferidos para uma placa de ágar.
- Todas as análises são realizadas em paralelo com o controlo e animais experimentais.
2. Paradigma Comportamental - Locomotion
- Colocar uma única larva de instar 3 rd sobre um substrato de agar a 2% em 100 milímetros de cultura de tecidos de prato e permitir a larva para aclimatar-se durante 30 seg. Larvas usar seus sclerites cefalofaringeano (ganchos boca) para impulsionar seus corpos em toda a superfície do substrato de ágar. Isso é feito em um prato separado, porque eut é mais difícil de visualizar as contracções do corpo na solução de levedura como o animal é quase a mesma cor que a levedura.
- Observar e registrar cada posterior ao movimento anterior sobre o substrato por um período de 1 min. n = 20 para cada genótipo. Não mais do que 10 animais deverão ser analisadas por placa.
3. Comportamento Paradigma - Alimentação
- Usando rombas Inox # 5 pinças, transferir cuidadosamente o estádio de larva 3 rd da placa de agar locomotora para o centro de uma placa de ágar-cheia coberto com 5 ml de solução de 2% de levedura de padeiro activado. Certifique-se de que a solução é homogênea como o fermento vai resolver com o tempo. Quando na solução de levedura, as larvas em grande parte permanecem no local e alimentação, facilitando a observação do comportamento. A taxa de contracções gancho boca correlaciona-se directamente com a quantidade de alimento ingerido 14.
- Permitir larva para se aclimatar para 30 seg.
- Observar e registrar o número decontrações gancho na boca por um período de 1 min. n = 20 para cada genótipo.
4. Dissecções Gut larval
- Faça uma solução fixação em formol EM-grau 4% em tampão fosfato 1x (PBS) e coloque em um copo ponto 3 poços.
- Dissecar cuidadosamente vagando tarde 3 º instar coragem de larvas em um prato de vidro 3-bem com solução PBS 1x, certificando-se de cada vez que o proventrículo é deixada intacta. Com uma pinça, segure a extremidade posterior, e com a outra, segure os ganchos na boca. Enquanto segura o imóvel extremidade posterior, puxe delicadamente sobre os ganchos na boca para ter acesso a coragem. Remova todos os tecidos associados (glândulas salivares, cérebro, corpo de gordura, etc), em seguida, transferir cada intestino para o prato 3 poços contendo a correção formaldeído. Vagando 3 º instar larva são usados porque nesta fase de desenvolvimento, a larva deixa de se alimentar em preparação para pupariation, eo proventrículo é limpo de levedura. <li> Incubar entranhas a 4 ° C durante a noite numa caixa de cultura de tecido opaco.
- Antes de retirar solução fixação em formol a partir de poços, remova o ceco gástrico e prenda o intestino médio ~ 150 ï ¿½ 2 do proventrículo de modo que as projeções podem ser claramente vistos sem impedimento.
- Retirar correcção de formaldeído a partir de poços e substituir com 1x PBT (1x PBS, 0,1% livre de protease de albumina de soro bovino, X-100 0,1% de Triton) solução tampão. Lave coragem 6x por 10 min em 1x PBT. Coloque amostras de tecido em um rotor mecânico ao fazer lavagens.
- Incubar a 4 ° C durante 1 hora em 10 -6 M de 5-HT para melhorar a sinalização da serotonina. Lave coragem 6x por 10 min em 1x PBT. Estudos anteriores demonstraram que esta concentração de exógena 5-HT não afeta a arquitetura neuronal ou densidade varicosity em análises de imuno-histoquímica e simplesmente aumenta o sinal de ruído 15-16.
- Incubar a 4 &# 176; C durante a noite em anticorpo primário anti-serotonina (monoclonal criado em mouse ou policlonal em coelho). Lave coragem 6x por 10 min em 1x PBT. Coloque amostras de tecido em um rotor mecânico ao fazer lavagens.
- Incubar a 4 ° C durante 90 min, em anticorpo secundário (Alexa Fluor 568 anticorpo de cabra anti-ratinho ou anti-IgG de coelho, diluição 1:400). Lave coragem 6x por 10 min em 1x PBT. Coloque amostras de tecido em um rotor mecânico ao fazer lavagens.
- Incubar em carbonato de sódio 4 mM durante 10 min num rotor mecânico, em seguida, montar em 4% de n-propilo gallate/20 mM de carbonato de sódio, e vista sob fluorescência. O carbonato de sódio é utilizada para converter as amostras para o tampão e o pH utilizado nos meios de montagem.
- Capturar imagens de amostras de tecidos com a ampliação de 400X imunocoradas para análise.
5. Análise de Neural dos circuitos
- Fibras de neurites foi quantificado (número e tamanho das varizese grau de ramificação) usando Neuroleucida e Neuroexplorer. No entanto, isso também pode ser feito manualmente ou utilizando o Simple Neurite Tracer (um aplicativo gratuito que pode ser baixado online).
- Trace as projeções de fibra individuais do cérebro para o proventrículo e quantificar número varicosity, ramos e do número de grandes varizes por unidade de comprimento. As fibras axonais projetando a partir do cérebro são empacotados no nervo recurrens e não são acessíveis para análise até atingirem o proventrículo, onde eles se separam e fasciculada.
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Representative Results
O circuito de alimentação serotoninérgica no larva Drosophila pode servir como um modelo extremamente eficaz para observar a influência de fatores específicos no desenvolvimento do sistema nervoso. Quantificando taxa de alimentação, é possível ligar a arquitectura axonal do circuito de alimentação, com a sua saída funcional (Figura 1). O ensaio locomotor é usado como um controlo fisiológico para as retracções dos ganchos na boca, uma vez que as suas larvas usar ganchos na boca para impulsionar-se em toda a superfície do agar. Não deve haver nenhuma diferença nas respostas locomotoras entre o controle e os genótipos mutantes se as mutações afetam apenas o circuito de alimentação de 8 (Figura 2A). Se diferenças significativas ocorrem, é possível o comportamento larval foi comprometida por manuseio inadequado. Se a parada de larvas durante o ensaio para tentar cavar através do substrato ágar, eles podem ser muito velho, e são propensos a transição para vagando estádios.Também é possível o substrato ágar pode ser muito difícil, tornando-se assim difícil para ganchos na boca de larvas para pegar o substrato ágar, o que pode ser abordada por molhar a superfície do ágar.
Este ensaio pode ser utilizado para avaliar se as estirpes de Drosophila com defeitos anatómicos neuronais afectar o desenvolvimento do circuito de alimentação serotoninérgica. O corpo elipsóide mutante aberta (ebo 3) tem um defeito estrutural no corpo elipsóide do complexo central. A comparação com o tipo selvagem parental tensão Canton-S, CS wu, revela que esses defeitos anatômicos durante resultado o desenvolvimento do cérebro na alimentação deprimido enquanto locomoção não é afetada (Figura 2B).
Os defeitos anatômicos em ebo 3 mutantes aparecem para mudar o desenvolvimento da arquitetura neurite do intestino. Figura 3 mostra as mudanças na arquitetura de fibra no ebo 3 larvas compavermelho com CS wu; estas larvas mostram um aumento da ramificação, bem como um aumento no número de pequenas e grandes varicosidades ao longo do comprimento da neurite. Observe os nós de ramificação (setas), varicosidades (setas), e grandes varizes (asteriscos). Figura 4 representa a quantificação dessas imagens.
Quantificação adequada da arquitetura axonal requer que as imagens ser extremamente clara. Figura 5A representa uma imagem apropriada para a análise. Imagens de pior qualidade fará com que seja difícil distinguir entre a fibra e varizes (Figura 5B). Ao fotografar a arquitetura de fibras, evitar tomar imagens que incluem as projeções no anterior do proventrículo, uma vez que as fibras estão bem agrupados e estão separando um do outro e podem aparecer como se eles são ramificados. Mais fibras posteriores dentro do intestino são mais ramificada porque fasciculada, uma vez que um re em dentro deste tecido. Quantificação do ramo e número varicosity, eo tamanho das varizes, podem ser analisados manualmente ou através de um programa criado com o propósito de estudar a morfologia neurite, como Neuroleucida. Enquanto o proventrículo não é danificado durante o protocolo de imuno-histoquímica, ea imagem está em foco, os preparativos serão aceitáveis para imagem e análise. Se a arquitectura da fibra é claramente distinguível do fundo e, se varicosidades individuais podem ser identificados ao longo da extensão de neurites, a preparação é apropriada para análise. Além disso, se varicosidades individuais podem ser identificados a partir do resto da fibra, esta é também um outro indicador de uma imagem de qualidade para análise. Todas as fibras são analisados, com exceção daqueles que fora da faixa de foco (em alguns casos, as fibras vão curva entre vários planos de foco).
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Figura 1. O circuito de alimentação larval. Filé um de 3 º instar larva mostrando cérebro e intestino tecidos (A). Tecidos Gut dissecados de larvas 3 º histoquímica com um anticorpo criado contra Drosophila triptofano hidroxilase neuronal (DTRH, B) ou 5-HT ( C). A, B. E, esôfago; Mh, ganchos na boca; Pr, proventrículo, Br, cérebro (observe o padrão de neurônios de 5-HT). Arrowhead designa o nervo frontal; seta, o nervo recurrens C.. proventrículo mostrando fibras axonais (setas). Escala bar = 20 m. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
<br /> Figura 2. Defeitos anatómicos, durante o desenvolvimento do cérebro resulta no comportamento de alimentação. Deprimido Os animais foram ensaiados para locomotora (A) e comportamentos de alimentação (B). Locomotion não foi afetado. n = 20 para cada ensaio comportamental, 2-3 experiências independentes. **** P <0,0001, teste t não pareado. Linhas acima do gráfico representam erro padrão da média. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. Defeitos anatómicos, durante o desenvolvimento dos resultados do SNC em aberração da arquitectura de fibra do tecido intestinal. Gut dissecados a partir de larvas de 3 º e imunocorados com anti-5-HT. Seta denota nó ramo. Arrowhead denota uma pequena varicosity. Asterisk deobserva grande varicosity. Escala bar = 40 m. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 4. Defeitos anatómicos, durante o desenvolvimento do cérebro em resultado aberrante fibroarquitetura intestino. Análise de tecido proventriculares de larvas de 3 º dissecadas e incubadas com anti-5-HT. Neurite ramificação (A), número total de varizes por cada 0,1 mm de comprimento de neurite (B) e número de grandes varizes (> 1 Hm 2) por 0,1 mm Comprimento (C). CS wu, 20 fibras de 17 coragem de dois experimentos independentes; ebo 3, 20 fibras de 18 coragem de três experimentos independentes. **** P <0,0001, ** p <0,01, * p <0,05, tt desemparelhadoLinhas est acima do gráfico representam erro padrão da média. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 5. Qualidade das imagens é importante para a quantificação adequada da arquitetura de fibra intestino. Tecidos Gut dissecados de CS wu 3 larvas e imunomarcadas com anti-5-HT. (A). Imagem de boa qualidade. (B). Imagem de má qualidade. Escala bar = 40 m. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
Desenvolvimento aberrante do circuito stomatogastric serotoninérgica, que ocorre durante o final de embriogênese, afetará a sua função madura. As alterações na arquitectura de neurites que inervam o intestino pode ser correlacionada com a saída funcional do circuito, que é a taxa de alimentação (medido por contracções gancho boca numa solução de levedura) (Figura 1). O uso do sistema bipartido UAS-Gal4 em Drosophila torna possível visar especificamente para cima ou para baixo regulado a expressão de um dado transcrito de um tecido específico, as alterações na expressão de uma dada proteína pode ser quantificado precisamente tendo em conta os instrumentos apropriados. Esta técnica pode ser utilizado para elucidar as regiões do cérebro, e mesmo subconjuntos neuronais necessárias para o desenvolvimento de um circuito neural específico.
O ensaio locomotor é usado para confirmar que as larvas de outro modo não são fisiologicamente comprometida e, portanto, com 40 larvas de contracções da parede do corpo ou menos should ser excluídos da análise (Figura 2A). Isso pode ocorrer porque o genótipo provoca anormalidades físicas, ou porque os animais individuais foram feridos durante o manuseio. Além disso, a temperatura da sala em que o ensaio é realizado tem de ser controlado, uma vez que temperaturas mais baixas ou altas podem afectar os dados. Recomenda-se realizar este ensaio de comportamento entre 24-26 ° C. Nos dias em que a temperatura da sala de teste é mais frio, o ágar tem uma tendência a endurecer e, portanto, a rehumidificação da placa de ágar será necessária depois de cada ensaio locomotiva é completada a assegurar o agar está suficientemente macio. É importante manter a placa de agar para a locomoção húmido (não molhado), a fim de permitir que as larvas de viajar através da superfície e para impedi-los de enterramento. Temperaturas mais baixas também têm impacto sobre o desempenho das larvas no substrato de ágar, como larvas tendem a viajar em direcção temperaturas preferenciais (24-26 ° C) 17-18. No mais de 10 animais deverão ser analisadas por placa, e descartar qualquer placa com furos no substrato ágar.
Ao realizar o ensaio de alimentação, é importante estar ciente de que a suspensão de levedura vai assentar ao longo do tempo, roda da levedura sobre a chapa garante a levedura permanece homogénea ao longo do ensaio. Visibilidade reduzida dos ganchos na boca pode ocorrer se a solução de levedura torna-se demasiado concentrada. Larvas saudável colocado no contrato mídia levedura seus ganchos na boca cerca de 150-170 vezes por minuto; alimentação reduzida pode ser tão baixa quanto 120, eo limite superior é 210.
Ao realizar o protocolo de imuno-histoquímica, é sábio immunostain controle e amostras de tecidos experimentais em paralelo para garantir a qualidade semelhante de amostras de tecido. Imunofluorescência da arquitectura de neurites inervação do intestino pode ser melhorada através da incubação de amostras de tecido em anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. A incubação of anticorpos a 4 ° C melhora a relação sinal-ruído (Figura 5). A qualidade das imagens é muito importante, uma vez que é crítico para a quantificação precisa da arquitectura de fibra (Figura 3) para revelar alterações na ramificação e do número e tamanho varicosidades (Figura 4). A qualidade das amostras de tecido pode ser destruído se o rotor utilizado durante períodos de lavagem aquece-se em qualquer ponto a partir do uso constante. Enquanto imaginando as amostras de tecido não se esqueça de deixar as amostras sob o microscópio de luz por muito tempo, pois isso irá reduzir a imunofluorescência das amostras, não só a um atualmente em foco, mas as amostras vizinhas também. Análise da arquitetura das fibras pode ser facilmente completado com a ajuda de um software, mas ainda também pode ser realizada manualmente. Classificação das pequenas e grandes varicosidades referem-se a área das varizes, varicosidades medição maior do que 1 um 2 são classificados como grandes varicoses.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Fundo de Investigação do Presidente da Saint Louis University atribuído a RSSF
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse E-800 Microscope | Nikon Instruments | ||
| Neuroleucida | MBF Biosciences | NL-15 | Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have |
| Northern Eclipse | Empix Inc | Imaging software | |
| G-2E/C TRITC EX 528-553 | Nikon Instruments | 96312 | Filter for specific secondary antibody |
| N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded | Nikon Instruments | MRH00400 | Objective used for imaging |
| Simple Neurite Tracer | NIH Image J | http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer |
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