Summary
供电电路在果蝇幼虫提供了一个简单但功能强大的模型，它允许改变喂养率与在stomatogastric神经回路的改变相关。这个电路是由该发送突起的钩口以及前肠中央血清素能神经元。
Abstract
的血清素激活的供电电路在果蝇幼虫可用于该电路的开发过程中，调查至关重要的神经基质。使用该电路的功能输出，馈送，改变stomatogastric系统的神经细胞的体系结构可以被可视化。摄食行为可以通过观察口的钩子，它从大脑接收支配收缩的速率进行记录。自发行为作为一种生理控制觅食，因为幼虫用自己的嘴钩来遍历整个琼脂基质。改变摄食行为可以与突起的轴突架构相关联支配的内脏。采用免疫组织化学也能够可视化和定量这些变化。幼虫在行为范式操作不当可能会改变数据，因为他们是操纵非常敏感。适当的成像轴突架构的支配肠道是膨体的数量和尺寸的精确定量以及分支节点的程度是至关重要的。大多数电路的分析只允许对神经突的体系结构或行为效果的视觉效果，但是，这种模型允许一个相关联的电路与在神经元体系结构的损伤的功能性的输出。
Introduction
果蝇是研究神经回路的发展，由于快速的生成时间，较低的实验成本，操纵和控制遗传和环境因素的能力是非常强大的模型系统。神经再生，神经元路径的发现和突触是人类和果蝇中保守，因此在创建，维护和修改神经回路机制是保守为好。
经典的神经递质，例如血清素（5 -羟色胺，或5-HT）可以作为生长因子通过它们的作用如同在成熟的神经电路1-3的信号分子前 以往的研究表明，扰动的5-HT水平胚胎发育过程中改变成熟神经元4的连通性。其他人已经表明5 -羟色胺对培养的神经元Helisoma异位应用抑制神经突生长以及突触5-7。 在 D中rosophila，发育的5-HT水平负相关静脉曲张数量和大小，以及aborization的程度，沿着突起从中枢神经系统8投射到前肠的长度。
血清素能神经传递已经显示调节摄食行为在不同的物种，包括果蝇 8-9。馈电电路在果蝇是可以作为一个模型关联功能的输出（馈送）与在轴突突起从大脑前肠的发展改变一个相对简单的电路。 Schoofs 等 。已经表明， 果蝇幼虫取食是由中枢模式发生器，影响肌肉组织10规范。而特定的肌肉解剖尚未完全了解，但已经表明，触角神经，上颌神经和前胸腺副神经负责参与肌肉目标摄食行为。涉及的无脊椎动物的摄食肌肉和神经解剖大多数数据是有限的丽蝇幼虫。
第二龄期幼虫的进料速率可以通过cephalopharyngeal骨片（口钩）的回缩进行评估，并且是可重复的和高吞吐量。该cephalopharyngeal板由中枢5-HT能神经元纤维通过额叶神经支配。腺胃，或前肠，是由血清素纤维（recurrens神经），该束状中肠，并负责前肠的收缩（ 图1）11-12支配。变化的轴突分枝和静脉曲张沿神经突长度的数量和大小，可以用免疫组织化学技术进行定量。在开发过程中操纵神经元的5-HT，无论是直接或间接地，可改变该供电电路的功能输出，其可以进行评估，并以变化的morpholo相关GY的突起结构。
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Protocol
1。人口笼的保养
- 保持人口笼在25°C在12小时明暗周期。只要在对照组和实验组暴露在相同的照明条件，那么这种技术可以在一个标准的实验室设置进行。
- 让女性在一夜之间产卵苹果汁琼脂平皿上。
- 通过保持板与新蛋存放在25℃，24小时收集初孵幼虫。放置一小团酵母中的板的中心，以吸引孵出幼虫。
- 收集已迁移到酵母膏苹果汁板中心第一龄幼虫。使用金属铲将其传送到一个新鲜的苹果汁板。可以添加额外的酵母膏，以确保有足够的食物，直到检测执行。葡萄汁板也可代替苹果汁板的使用。
- 得晚2 次早3 龄升通过允许第一龄期年龄为40-48小时arvae。在此范围内的进料速度是恒定的13。年龄可以通过检查口钩被确认为有每个幼虫蜕皮明显的变化，这种结构。
- 晚2 次早3 龄幼虫轻轻和充分洗涤苹果汁板与水和收集幼虫上的网状过滤器收集的行为分析。幼虫，然后转移到琼脂平板上。
- 所有的分析都在使用平行对照组和实验动物进行。
2。行为范式 - 步态
- 将单份3 龄幼虫在2％琼脂基质在100mm组织培养皿中，并允许幼虫适应环境，持续30秒。幼虫用自己的cephalopharyngeal骨片（口钩）横跨琼脂基材表面推动自己的身体。这是在一个单独的板做，因为我t是更难以可视化体的收缩在酵母溶液作为动物几乎是相同的颜色作为酵母。
- 观察并记录各后部到前部的移动在衬底上，为期1分钟。 N = 20，每基因型。不超过10个动物应每板来测定。
3。行为范式 - 送料
- 使用钝Inox公司＃5镊子，小心地从自发琼脂平板上转移3 龄幼虫，以琼脂填充板叠置用5毫升的2％活性面包酵母溶液的中心。确保解决方案是同质的酵母会沉淀一段时间。当在酵母溶液，幼虫会在很大程度上留在原地和饲料，便于观察的行为。的嘴钩收缩率直接相关，食物摄入14的数量。
- 让幼虫来适应环境，持续30秒。
- 观察并记录数量嘴钩收缩为一个周期为1分钟。 N = 20，每基因型。
4。幼虫肠道夹层动脉瘤
- 使在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并置于有3孔点玻璃4％EM-级甲醛溶液固定。
- 仔细剖析在外漂泊晚3 龄幼虫胆量使用1X PBS溶液3孔玻璃盘，确保每个腺胃保持不变的时间。用一个镊子，保持的后端，并与其他的，保持口腔钩子。按住后端不动，轻轻拉动嘴钩来访问胆量。删除任何相关组织（唾液腺，脑，脂肪体等 ），那么每个肠道转移到3井菜含有甲醛的修复。流浪3 龄幼虫的使用，因为在这个发展阶段，幼虫停止在准备pupariation觅食，腺胃被清除酵母。 <LI>胆量孵育4℃过夜在一个不透明的组织培养箱。
- 在从井中取出甲醛固定液，取出胃盲囊，并从腺胃夹肠〜150微米2，这样的预测可以清楚无阻碍观看。
- 从孔中除去甲醛的修复和替换用1×PBT（1×PBS，0.1％无蛋白酶牛血清白蛋白，0.1％的Triton X-100）的缓冲溶液。在1x PBT彻底洗净胆6次10分钟。将组织样本上的机械旋转一边做洗。
- 在10 -6 M的 5 -羟色胺，以提高血清素信号孵育在4℃下1小时。在1x PBT彻底洗净胆6次10分钟。以前的研究已经表明，外源性5-HT的浓度这不会影响在免疫分析中的神经元体系结构或静脉曲张密度和简单地提高了信号的信噪比15-16。
- 孵育4＆＃176;过夜的抗血清素一抗（单克隆小鼠或多克隆兔提出提出）。在1x PBT彻底洗净胆6次10分钟。将组织样本上的机械旋转一边做洗。
- 孵育在二次抗体4℃下进行90分钟（的Alexa Fluor 568羊抗鼠或抗兔IgG; 1:400稀释）。在1x PBT彻底洗净胆6次10分钟。将组织样本上的机械旋转一边做洗。
- 孵育在4 10mM碳酸盐用于在机械转子10分钟钠，然后安装在4％的正丙基gallate/20毫碳酸钠，和视图下的荧光。碳酸钠是用于将样品转化为在封固介质中使用的缓冲液和pH值。
- 捕捉免疫染色的组织样本图像在放大400倍进行分析。
5。神经电路的分析
- 轴突纤维进行定量（数量和静脉曲张的大小和支化的使用Neuroleucida和Neuroexplorer度）。然而，这也可以手动完成，或使用简单的轴突示踪（可以网上下载了一个免费的应用程序）。
- 跟踪从大脑的各个纤维投射到腺胃和量化静脉曲张号码，枝和每单位长度大的静脉曲张的数目。轴突纤维从大脑中突出的捆绑到recurrens神经，不作分析访问，直到他们达到他们分开，其中腺胃和丛生。
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Representative Results
血清素供电电路中的果蝇幼虫可以作为一个非常有效的模型，观察特定因素对神经系统发育的影响。通过定量进料速率，因此能够与它的功能性输出（图1）连接的馈电电路的轴突的结构。的运动功能测定法是用来作为一种生理控制的口钩的后退动作中，由于幼虫用他们的嘴钩穿过琼脂表面推动自己。应在控制和突变基因型之间的自发反应没有区别，如果突变只影响供电电路8（图2A）。如果显著差异确实存在，则可能是幼虫行为进行了处理不当损害。如果在试验过程中，幼虫停止尝试挖洞通过琼脂基质，它们可能太旧，并有可能转换到徘徊龄。另外，也可以在琼脂基底可能太硬，因此，很难对幼虫口钩抓住琼脂衬底，这可以通过润湿琼脂表面处理。
该测定可用于评估果蝇品系与神经解剖缺陷是否影响血清素馈电电路的发展。该突变体椭开放（EBO 3）具有结构缺陷的中央复杂的椭球体。与野生型亲广-S品系， 吴健雄的比较，揭示了这些解剖缺陷在大脑发育导致抑郁喂养，而运动不受影响（图2B）。
在EBO解剖缺陷3的突变体出现改变肠道的神经突的体系结构的发展， 图3示出了在EBO 3幼虫COMPA的变化，纤维结构红色与吴健雄 ，这些幼虫显示增加分枝，以及增加了沿突起长度小型和大型静脉曲张的数量。注意的分支节点（箭头），膨体（箭头），和大膨体（星号）。 图4表示这些图像的定量分析。
适当的定量轴突结构要求的图像非常清晰。 图5A表示适合分析图像。质量较差的图像将使其难以纤维和膨体（图5B）之间的区别。当拍摄的纤维结构，避免采取包括突起在腺胃的前，由于纤维被紧密地捆扎并从彼此分离，并且可能出现，尽管它们是支化的图像。中肠中更后路纤维较多的支，因为他们束状一旦他们一这个组织内重新在。定量分支和静脉曲张号码和静脉曲张的大小，也可以手动或通过设计用于研究神经突的形态，如Neuroleucida的目的的程序进行分析。只要腺胃没有免疫组化协议过程中损坏，并且图像处于焦点时，准备将是可以接受的成像和分析。如果纤维结构是清楚的从背景区别的，如果个体膨体可以沿着突起长度来识别，该制剂适合于分析。此外，如果个别膨体可以从光纤的其余部分被识别，这也是用于分析的图像质量的另一个指标。所有的纤维，除了那些分析了失焦的范围（在某些情况下，纤维会集中多个平面之间曲线）。
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图1。幼虫供电电路。圆角一个的3 龄幼虫，显示脑和肠组织中（A），从第3龄幼虫的肠解剖组织进行免疫染色与针对果蝇神经色氨酸羟化酶抗体（DTRH，B）或5-HT（ C）A，B。 E，食道，氢，口钩，镨，腺胃，溴，脑（附注5-HT能神经元的形态）。箭头表示额叶神经;箭头，在recurrens神经角 。腺胃表示轴突纤维（箭头）。比例尺= 20微米。 点击这里查看大图 。
<BR /> 图2。在大脑发育的结果郁闷摄食行为的解剖缺陷。这些动物被测定的运动（A）和摄食行为（B）。运动并没有受到影响。 N = 20，每行为分析，从2-3个独立实验。 **** P <0.0001，非配对t检验。线图上方描绘的平均值的标准误差。 点击这里查看大图 。
图3。中枢神经系统的结果在像差在肠道纤维结构。肠组织从第3龄幼虫解剖并用抗-5-HT 的发育过程中解剖缺陷 。箭头表示分支节点。箭头表示小静脉曲张。德星号指出大静脉曲张。比例尺= 40微米。 点击这里查看大图 。
图4。在大脑发育导致异常的肠道纤维结构从3 龄幼虫proventricular组织解剖及与抗5 -羟色胺的分析解剖缺陷 。轴突分支（A），数字每0.1毫米突起长度（B）和大膨体数总静脉曲张（> 1微米2）每0.1毫米的长度（C）。 吴健雄 ，从17胆量来自2个独立实验20纤维; EBO 3，从18胆量来自3次独立实验20纤维。 **** P <0.0001，** P <0.01，P <0.05，非配对TT估行上图描绘的平均值的标准误差。 点击这里查看大图 。
图5。图像质量是重要的肠道纤维结构的适当的定量分析。从CS 武 3龄幼虫解剖，并用抗-5-HT的肠组织中（A），良好的品质形象。（B），低品质的图像。比例尺= 40微米。 点击这里查看大图 。
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Discussion
血清素stomatogastric电路，它在胚胎发育晚期出现的异常发育，将影响其成熟的功能。变化突起架构支配肠道可与电路的功能输出，这是进料速率（通过嘴钩收缩在酵母溶液测定）（图1）相关联。在果蝇中使用UAS-Gal4的二分体系使得可以特异性靶向上调或下调表达一个给定的转录物至特定组织的;改变一个给定的蛋白质的表达，可以精确地定量给予适当的工具。这种技术可以用来阐明的大脑区域，甚至必要对特定的神经电路的神经元发育的子集。
的运动功能测定法是用来确认该幼虫不能否则生理损害，因此，幼虫与40体壁收缩或更少抄ULD被排除在分析中（图2A）。这可能会发生是因为基因型导致身体异常，或由于个别动物都在处理过程中受伤。此外，需要在该测定法中进行房间的温度进行控制，由于冷却器或较高的温度可能会影响数据。建议在24-26°C之间进行这种行为分析关于天当检测室的温度为冷却器，琼脂有一种倾向，变硬，因此，将需要在琼脂平板上的再湿润后，每个机车测定法完成，以确保在琼脂是足够软。是为了在琼脂平板上对运动湿润（未湿润），以允许幼虫在表面上行进，并阻止它们挖洞是重要的。更低的温度也会影响幼虫的性能琼脂基片上，幼虫往往对优惠的温度（24-26℃）17-18旅行。 ÑØ10多个动物应该每盘被检测，并丢弃所有板中的琼脂基质穿刺。
当进行饲喂试验，它是知道的酵母悬浮液会沉淀一段时间是很重要的，上盘酵母旋流保证了酵母在整个试验保持均匀。口钩能见度下降，如果能在酵母溶液变得过于集中发生。健康的幼虫放置在酵母培养基合约每分钟的口钩约150-170倍;摄食量减少可能低至120和量程上限是210。
当进行免疫组化协议，这是明智的免疫染色控制和平行实验的组织样本，以确保组织样本类似的质量。神经突架构支配肠道的免疫可以通过培养组织样品中的第一抗体过夜，在4℃下得到加强孵化Øf抗体在4℃下改善了信号噪声比（图5）。的图像的质量是非常重要的，因为这是用于纤维结构的精确定量（图3），揭示改变分支和静脉曲张数量和大小（图4）是至关重要的。组织样品的质量可以如果在洗涤周期中使用的旋转器加热在从常数使用任何点被破坏。而成像的组织样本可千万不要离开显微镜下样品的光太久，因为这会降低的样品，不仅一个目前正在重点，但周围的样品以及的免疫。该纤维结构的分析，可以用软件的帮助下轻松完成，但仍然也可以手动完成。小型和大型静脉曲张分级指的是静脉曲张的区域，膨体测量大于1 平方微米归类为大静脉曲张。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
作者要感谢总统的研究基金来自圣路易斯大学授予的WSN
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse E-800 Microscope | Nikon Instruments | ||
| Neuroleucida | MBF Biosciences | NL-15 | Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have |
| Northern Eclipse | Empix Inc | Imaging software | |
| G-2E/C TRITC EX 528-553 | Nikon Instruments | 96312 | Filter for specific secondary antibody |
| N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded | Nikon Instruments | MRH00400 | Objective used for imaging |
| Simple Neurite Tracer | NIH Image J | http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer |
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