Summary
El circuito de alimentación en larvas de Drosophila melanogaster sirve un modelo simple pero potente que permite a los cambios en la tasa de alimentación que se correlacionan con las alteraciones en los circuitos neurales stomatogastric. Este circuito se compone de las neuronas serotoninérgicas centrales que envían proyecciones a los ganchos de la boca así como el intestino anterior.
Abstract
El circuito de alimentación serotonérgica en larvas de Drosophila melanogaster se puede utilizar para investigar los sustratos neuronales de importancia crítica durante el desarrollo del circuito. Uso de la salida funcional del circuito, la alimentación, los cambios en la arquitectura neuronal del sistema stomatogastric puede ser visualizado. El comportamiento de alimentación se puede grabar mediante la observación de la tasa de retracción de los ganchos de la boca, que reciben inervación desde el cerebro. El comportamiento locomotor se utiliza como un control fisiológico de la alimentación, ya que las larvas utilizar sus ganchos de la boca para atravesar a través de un sustrato de agar. Los cambios en el comportamiento de alimentación se pueden correlacionar con la arquitectura axonal de las neuritas que inervan el intestino. El uso de inmunohistoquímica es posible visualizar y cuantificar estos cambios. Un manejo inadecuado de las larvas durante los paradigmas de comportamiento puede alterar los datos, ya que son muy sensibles a las manipulaciones. Imagen adecuada de la arquitectura de axones inervanel intestino es crítico para la cuantificación precisa de número y tamaño de las varices, así como el grado de los nodos de ramificación. El análisis de la mayoría de los circuitos permite sólo para la visualización de la arquitectura de axones o efectos en el comportamiento, sin embargo, este modelo permite correlacionar la salida funcional del circuito con las deficiencias en la arquitectura neuronal.
Introduction
Drosophila es un sistema de modelo muy potente para estudiar el desarrollo de circuitos neuronales debido a un rápido tiempo de generación, coste experimental bajo, y la capacidad para manipular y controlar los factores genéticos y ambientales. La neurogénesis, hallazgo camino neuronal y la sinaptogénesis se conservan entre los humanos y Drosophila, por lo que los mecanismos de la creación, mantenimiento y modificación de los circuitos neuronales se conservan también.
Neurotransmisores clásicos, como la serotonina (5-hidroxitriptamina o 5-HT) pueden servir como factores de crecimiento, antes de adoptar su papel como moléculas de señalización en el circuito neural madura 1-3 Estudios anteriores han demostrado que perturbado niveles de 5-HT durante la embriogénesis alterar la conectividad de las neuronas maduras 4. Otros han demostrado que la aplicación ectópica de 5-HT a las neuronas cultivadas Helisoma reprimir el crecimiento de neuritas, así como la sinaptogénesis 5-7. En Drosophila, de desarrollo los niveles de 5-HT están inversamente relacionada con el número de varicosidades y tamaño, así como el grado de aborization, a lo largo de la longitud de las neuritas que se proyectan hacia el intestino anterior del SNC 8.
La neurotransmisión serotonérgica se ha demostrado que modulan los comportamientos de alimentación en diversas especies, incluyendo Drosophila 8-9. El circuito de alimentación en Drosophila es un circuito relativamente simple que se puede utilizar como un modelo para correlacionar la salida funcional (alimentación) con alteraciones en el desarrollo de las proyecciones axonales desde el cerebro hasta el intestino anterior. Schoofs et al. han demostrado que la alimentación de las larvas de Drosophila está regulado por generadores de patrones centrales que influyen en la musculatura 10. Mientras que la anatomía muscular específico no se comprende completamente, se ha demostrado que el nervio antenal, nervio maxilar, y el nervio accesorio protorácica son responsables de los objetivos musculares implicados en lael comportamiento de alimentación. La mayoría de los datos relacionados con la musculatura y nervios Anatomía de la alimentación de invertebrados se limita a las larvas Calliphora.
La tasa de alimentación de larvas de segundo instar se puede evaluar por la retracción de las Escleritos cefalofaríngeos (ganchos de la boca), y es reproducible y de alto rendimiento. Las placas cefalofaríngeos están inervadas por fibras de las neuronas centrales 5-HT a través del nervio frontal. El proventrículo o intestino anterior, está inervado por fibras serotoninérgicos (Recurrens nervio) que fasciculada en el intestino medio y son responsables de las contracciones del intestino anterior (Figura 1) 11-12. Los cambios en la ramificación axonal, y el número y tamaño de las varices a lo largo de la longitud de las neuritas, se pueden cuantificar utilizando técnicas inmunohistoquímicas. Manipulación de 5-HT neuronal durante el desarrollo, ya sea directamente o indirectamente, puede cambiar la salida funcional de este circuito de alimentación, que puede ser evaluado y se correlacionó con los cambios en la morfologíasGy de la arquitectura de las neuritas.
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Protocol
1. Mantenimiento de las jaulas de población
- Mantener las jaulas de población a 25 ° C en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas. Mientras los grupos de control y experimentales se exponen a las mismas condiciones de iluminación, entonces esta técnica se puede realizar en un entorno de laboratorio estándar.
- Permitir que las hembras pongan huevos durante la noche en placas de agar-jugo de manzana.
- Recoger las larvas recién eclosionadas, manteniendo las placas con los huevos recién depositados a 25 ° C durante 24 horas. Coloque una pequeña cucharada de levadura en el centro del plato para atraer larvas eclosionadas.
- Recoge 1 º estadio las larvas que han migrado a la pasta de levadura en el centro de la placa de jugo de manzana. Use una espátula de metal para transferirlo a una placa de jugo de manzana fresca. Pasta de levadura adicional puede ser añadido para asegurar que haya una alimentación adecuada hasta que se realizan los ensayos. Placas de zumo de uva también se pueden utilizar en lugar de placas de jugo de manzana.
- Obtener la tarde 2-nd temprana 3 º estadio larvae al permitir que el 1 de instares a la edad de 40 a 48 h. Dentro de este rango las tasas de alimentación son constantes 13. La edad puede ser confirmado por examen de los ganchos de la boca, ya que hay distintos cambios en esta estructura con cada muda larval.
- Tarde 2 3 º estadio las larvas-nd principios se recogen para los ensayos de comportamiento suavemente y extensamente usan platos de jugo de manzana con agua y la recolección de las larvas en un filtro de malla. Las larvas se transfieren después a una placa de agar.
- Todos los análisis se realizan en paralelo usando animales control y experimentales.
2. Paradigma de comportamiento - Locomoción
- Coloque un solo 3 º estadio larva en un sustrato de agar al 2% en un 100 mm placa de cultivo de tejidos y permitir que la larva se aclimate durante 30 segundos. Las larvas utilizar sus Escleritos cefalofaríngeos (ganchos de la boca) para impulsar sus cuerpos a través de la superficie del sustrato de agar. Esto se hace en un plato aparte porque it es más difícil de visualizar las contracciones del cuerpo en la solución de levadura como el animal es casi el mismo color que la levadura.
- Observar y registrar cada uno posterior para el movimiento anterior sobre el sustrato durante un periodo de 1 min. n = 20 para cada genotipo. No más de 10 animales deben ser analizadas por placa.
3. Paradigma de comportamiento - Alimentación
- Usando romos Inox # 5 pinzas, transferir cuidadosamente la larva de estadio 3 ª de la placa de agar locomotora al centro de una placa de agar-llenado superpuesta con 5 ml de solución de levadura 2% de panadero activado. Asegúrese de que la solución es homogénea como la levadura se asentará en el tiempo. Cuando en la solución de levadura, las larvas en gran medida se mantendrá en su lugar y alimentación, facilitando la observación de la conducta. La tasa de las contracciones de gancho de la boca se correlaciona directamente con la cantidad de comida ingerida 14.
- Permita que la larva se aclimate durante 30 segundos.
- Observar y registrar el número decontracciones de gancho en la boca durante un periodo de 1 min. n = 20 para cada genotipo.
4. Las disecciones intestino de la larva
- Prepare una solución de fijación de formaldehído EM-grado 4% en 1x tampón fosfato-salino (PBS) y se pone en un vaso punto 3 pocillos.
- Diseccionar cuidadosamente deambulando tarde 3 º estadio larval agallas en un plato de cristal 3-bien utilizando la solución PBS 1x, asegurándose de que cada vez que el proventrículo se deja intacta. Con una pinza, mantenga el extremo posterior, y con la otra, sostenga los ganchos de la boca. Mientras sujeta el extremo posterior inmóvil, tire suavemente de los ganchos de la boca para poder acceder a las tripas. Retire todos los tejidos asociados (glándulas salivales, el cerebro, la grasa corporal, etc), a continuación, transferir cada tripa al plato 3 pocillos que contiene la solución de formaldehído. Vagando 3 º estadio larva se utilizan porque en esta etapa del desarrollo, la larva deja de alimentarse en la preparación para pupariation y proventrículo se borra de la levadura. <Li> Incubar las tripas a 4 ° C durante la noche en una caja de cultivo de tejidos opaca.
- Antes de retirar la solución de fijación de formaldehído de los pozos, retire el ciegos gástricos y clip del intestino medio ~ 150 m 2 del proventrículo de manera que las proyecciones se pueden ver claramente y sin impedimento.
- Retire solución de formaldehído de los pocillos y reemplazar con 1x PBT (1x PBS, 0,1% de albúmina de suero bovino libre de proteasa, X-100 0,1% de Triton) solución tampón. Lávese bien las tripas 6x durante 10 min en 1x PBT. Coloque las muestras de tejido sobre un agitador rotatorio mientras se hace lavados.
- Se incuba a 4 ° C durante 1 hora en 10 -6 M 5-HT para mejorar la señalización de la serotonina. Lávese bien las tripas 6x durante 10 min en 1x PBT. Estudios anteriores han demostrado que esta concentración de exógena 5-HT no afecta a la arquitectura neuronal o la densidad de várices en los análisis inmunohistoquímicos y simplemente mejora la relación señal a ruido 15-16.
- Incubar a 4 y# 176; C durante la noche en el anticuerpo primario anti-serotonina (monoclonal de ratón o policlonal de conejo). Lávese bien las tripas 6x durante 10 min en 1x PBT. Coloque las muestras de tejido sobre un agitador rotatorio mientras se hace lavados.
- Incubar a 4 º C durante 90 min en anticuerpo secundario (Alexa Fluor 568 cabra anti-ratón o anti-IgG de conejo; 1:400 dilución). Lávese bien las tripas 6x durante 10 min en 1x PBT. Coloque las muestras de tejido sobre un agitador rotatorio mientras se hace lavados.
- Incubar en carbonato de sodio 4 mM durante 10 minutos sobre un agitador rotatorio, a continuación, montar en 4% de carbonato de sodio mM gallate/20 n-propilo, y vista en virtud de la fluorescencia. El carbonato de sodio se utiliza para convertir las muestras en la memoria intermedia y el pH utilizado en los medios de comunicación medio de montaje.
- Captura imágenes de muestras de tejidos immunostained con un aumento de 400X para el análisis.
5. Análisis de circuitos neuronales
- Fibras neuritas se cuantificaron (número y tamaño de las varicesy el grado de ramificación) usando Neuroleucida y Neuroexplorer. Sin embargo, esto también puede realizarse de forma manual o mediante simple Neurite trazador (una aplicación gratuita que se puede descargar en línea).
- Trazar las proyecciones de fibras individuales desde el cerebro hasta el proventrículo y cuantificar el número de várices, las ramas y el número de las várices grandes por unidad de longitud. Las fibras axonales que se proyectan desde el cerebro se encuentran agrupados en el nervio Recurrens y no son accesibles para el análisis hasta que alcanzan el proventrículo donde se separan y fasciculada.
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Representative Results
El circuito de alimentación serotoninérgicos en la larva de Drosophila puede servir como un modelo muy eficaz para observar la influencia de determinados factores en el desarrollo del sistema nervioso. Por la cuantificación de la tasa de alimentación, es posible vincular la arquitectura axonal del circuito de alimentación con su salida funcional (Figura 1). El ensayo del aparato locomotor se utiliza como un control fisiológico de las retracciones de los ganchos de la boca, ya que las larvas utilizar sus ganchos de la boca para impulsarse a través de la superficie del agar. No debería haber ninguna diferencia en las respuestas del aparato locomotor entre el control y los genotipos mutantes si las mutaciones solo afectan el circuito de alimentación de 8 (Figura 2A). Si las diferencias significativas ocurren, es posible que el comportamiento de las larvas se ha visto comprometida por un manejo inadecuado. Si la parada de larvas durante el ensayo para tratar de excavar a través del sustrato de agar, que puede ser demasiado viejo, y probablemente la transición a vagar estadios.También es posible el sustrato de agar puede ser demasiado duro, por lo que es difícil para los ganchos de la boca de larvas para agarrar el sustrato de agar; esto puede ser abordado por mojar la superficie del agar.
Este ensayo se puede usar para evaluar si las cepas de Drosophila con defectos anatómicos neuronales afectan el desarrollo del circuito de alimentación serotoninérgica. El cuerpo elipsoide mutante abierta (EBO 3) tiene un defecto estructural en el cuerpo elipsoide del complejo central. La comparación con la cepa parental Canton-S de tipo salvaje, CS wu, revela que estos defectos anatómicos en consecuencia el desarrollo del cerebro en la alimentación deprimido mientras que la locomoción no se ve afectado (Figura 2B).
Los defectos anatómicos en EBO 3 mutantes parecen cambiar el desarrollo de la arquitectura de neuritas de la tripa. La Figura 3 muestra los cambios en la arquitectura de la fibra en la EBO 3 larvas comparojo con CS Wu; estas larvas mostrar un aumento en la ramificación, así como un aumento en el número de ambos varicosidades pequeñas y grandes a lo largo de la longitud de las neuritas. Tenga en cuenta los nodos rama (flechas), varicosidades (puntas de flecha), y las várices grandes (asteriscos). Figura 4 representa la cuantificación de estas imágenes.
Cuantificación adecuada de la arquitectura axonal requiere que las imágenes sean muy claras. Figura 5A representa una imagen adecuada para el análisis. Las imágenes de menor calidad harán que sea difícil distinguir entre la fibra y varicosidades (Figura 5B). Al fotografiar la arquitectura de fibra, evitar tomar imágenes que incluyen las proyecciones en la parte anterior del proventrículo, ya que las fibras están estrechamente agrupados y se separaban unos de otros y pueden aparecer como si ellos son ramificados. Más fibras posteriores dentro del intestino medio se más ramificados, ya que una vez que un fasciculada re en dentro de este tejido. La cuantificación de la rama y el número de várices, y el tamaño de las varices, puede ser analizada manualmente o por medio de un programa diseñado para el propósito de estudiar la morfología de las neuritas, tales como Neuroleucida. Mientras el proventrículo no se dañe durante el protocolo de inmunohistoquímica, y la imagen está en foco, los preparativos serán aceptables para la imagen y el análisis. Si la arquitectura de fibra se distingue claramente de fondo, y si las varices individuales pueden ser identificados a lo largo de la longitud de las neuritas, la preparación es adecuada para el análisis. Además, si varicosidades individuales pueden ser identificados a partir el resto de la fibra, este es también otro indicador de una imagen de calidad para el análisis. Todas las fibras se analizan con la excepción de los que fuera de la gama de enfoque (en algunos casos las fibras se curva entre múltiples planos de enfoque).
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Figura 1. El circuito de alimentación de las larvas. Filetear una de 3 º instar de la larva que muestra el cerebro y el intestino tejidos (A). Gut tejidos disecados de larvas 3 rd se immunostained con un anticuerpo contra Drosophila triptófano hidroxilasa neuronal (DTRH, B) o 5-HT ( C). A, B. E, esófago; Mh, ganchos de la boca; Pr, proventrículo, Br, cerebro (observe el patrón de las neuronas 5-HT). Arrowhead designa el nervio frontal, flecha, el nervio Recurrens C.. proventrículo muestra las fibras axonales (puntas de flecha). Barra de escala = 20 micras. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
<br /> Figura 2. Los defectos anatómicos durante los resultados del desarrollo cerebral en el comportamiento de alimentación deprimido. Los animales se analizaron para la locomotora (A) y los comportamientos de alimentación (B). La locomoción se vio afectada. n = 20 para cada ensayo de comportamiento, 2-3 experimentos independientes. **** P <0,0001, prueba t no pareada. Líneas sobre el gráfico representan el error estándar de la media. Haz click aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. Los defectos anatómicos durante el desarrollo de los resultados del sistema nervioso central en la aberración de la arquitectura de fibra de tripa. Gut tejido disecado de larvas 3 º y immunostained con anticuerpos anti-5-HT. Flecha indica nodo rama. Arrowhead denota una pequeña várices. Asterisk deobserva gran várices. Barra de escala = 40 micras. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 4. Los defectos anatómicos durante resultado el desarrollo del cerebro en la arquitectura de fibra intestino aberrante. Análisis de tejido proventrículo de estadio las larvas 3 ª diseccionado y se incubaron con anti-5-HT. Neuritas de ramificación (A), número de varices totales por 0,1 mm de longitud de las neuritas (B) y el número de las várices grandes (> 1μm 2) por 0,1 mm de longitud (C). CS wu, 20 fibras procedentes de 17 tripas de 2 experimentos independientes; ebo 3, 20 fibras de 18 agallas de 3 experimentos independientes. **** P <0,0001, ** p <0,01, * p <0.05, tt desapareadoLíneas est anteriores gráfica representan el error estándar de la media. Haz click aquí para ver la imagen más grande .
Figura 5. La calidad de las imágenes es importante para la cuantificación adecuada de la arquitectura de fibra de tripa. Gut tejidos disecados de CS wu tercera estadio las larvas y immunostained con anticuerpos anti-5-HT. (A). Buena calidad de imagen. (B). Imagen de mala calidad. Barra de escala = 40 micras. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
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Discussion
Desarrollo aberrante del circuito stomatogastric serotoninérgico, que ocurre durante la embriogénesis tardía, afectará a su función maduro. Los cambios en la arquitectura de neuritas que inervan el intestino puede ser correlacionada con la salida funcional del circuito, que es la tasa de alimentación (medido por contracciones de gancho de la boca en una solución de levadura) (Figura 1). El uso del sistema bipartito UAS-Gal4 en Drosophila hace que sea posible se dirigen específicamente hacia arriba o hacia abajo-regulada la expresión de un transcrito dado a un tejido específico; cambios en la expresión de una proteína dada se pueden cuantificar con precisión, dado las herramientas apropiadas. Esta técnica se puede utilizar para elucidar las regiones del cerebro, e incluso los subconjuntos neuronales necesarios para el desarrollo de un circuito neuronal específico.
El ensayo del aparato locomotor se utiliza para confirmar que las larvas no están de otro modo fisiológicamente comprometida, por lo tanto, las larvas con 40 contracciones de la pared corporal o menos Should ser excluidos de los análisis (Figura 2A). Esto puede ocurrir ya sea porque el genotipo causa de anormalidades físicas o porque los animales individuales han resultado heridas durante la manipulación. Además, la temperatura de la habitación en la que se realiza el ensayo tiene que ser controlada, ya que las temperaturas más frías o más calientes pueden afectar a los datos. Se recomienda realizar este ensayo el comportamiento entre 24-26 ° C. En los días cuando la temperatura de la sala de pruebas es más fresco, el agar tiene una tendencia a endurecerse, por lo tanto, se requiere la rehumectación de la placa de agar después de finalizar cada ensayo de la locomotora para asegurar el agar es suficientemente blando. Es importante mantener la placa de agar para la locomoción húmedo (no mojado) con el fin de permitir que las larvas de viajar por toda la superficie y para evitar que la madriguera. Las temperaturas más frías también influyen en el rendimiento de las larvas en el sustrato de agar, como larvas tienden a viajar hacia temperaturas preferenciales (24-26 ° C) 17-18. No más de 10 animales deben ser analizadas por placa, y descartar cualquier plato con pinchazos en el sustrato de agar.
Al realizar el ensayo de alimentación, es importante ser consciente de que la suspensión de levadura se asentará en el tiempo, que remolina de la levadura en la placa asegura la levadura se mantiene homogénea durante todo el ensayo. La visibilidad reducida de los ganchos de la boca puede ocurrir si la solución de levadura se vuelve demasiado concentrada. Larvas sanas colocado en el contrato de los medios de comunicación de la levadura de sus ganchos bucales aproximadamente 150-170 veces por minuto; reducción en la alimentación puede ser tan bajo como 120, y el límite superior del rango es de 210.
Al realizar el protocolo de inmunohistoquímica, es aconsejable inmunoteñir tanto control y muestras de tejidos experimentales en paralelo para garantizar la calidad similar de muestras de tejido. Inmunofluorescencia de la arquitectura de neuritas que inervan el intestino se puede mejorar mediante la incubación de muestras de tejido en anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. El o la incubaciónf anticuerpos a 4 ° C mejora la relación señal-ruido (Figura 5). La calidad de las imágenes es muy importante, ya que esto es crítico para la cuantificación precisa de la arquitectura de la fibra (Figura 3) para revelar cambios en ramificación y el número y tamaño varicosidades (Figura 4). La calidad de las muestras de tejido puede ser destruido si el rotador utilizado durante los períodos de lavado se calienta en cualquier punto por el uso constante. Mientras imágenes de las muestras de tejido que asegúrese de no dejar las muestras bajo la luz del microscopio por mucho tiempo ya que esto reducirá la inmunofluorescencia de las muestras, no sólo la que actualmente está bajo el foco, pero las muestras de los alrededores también. Análisis de la arquitectura de fibra se puede realizar fácilmente con la ayuda de un software, pero todavía se puede realizar también manualmente. Clasificación de las varices pequeñas y grandes se refieren al ámbito de las varices, varicosidades medir más de 1 m 2 se clasifican como las várices grandes.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer Fondo de Investigación del Presidente de Saint Louis University adjudicado a WSN
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse E-800 Microscope | Nikon Instruments | ||
| Neuroleucida | MBF Biosciences | NL-15 | Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have |
| Northern Eclipse | Empix Inc | Imaging software | |
| G-2E/C TRITC EX 528-553 | Nikon Instruments | 96312 | Filter for specific secondary antibody |
| N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded | Nikon Instruments | MRH00400 | Objective used for imaging |
| Simple Neurite Tracer | NIH Image J | http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer |
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