Summary
فقدان المنعكس المقوم قد خدم فترة طويلة كبديل السلوكية القياسية لفقدان الوعي، وتسمى أيضا التنويم المغناطيسي، في الحيوانات المختبرية. ويمكن الكشف عن تغييرات في حساسية مخدر المتطايرة الناجمة عن التدخلات الدوائية مع نظام تقييم عالية الإنتاجية التي تسيطر عليها بعناية، والتي يمكن تكييفها لتسليم أي العلاجية المستنشق.
Abstract
واحد نقطة النهاية المرغوب فيه من التخدير العام هو حالة من اللاوعي، والمعروف أيضا باسم التنويم المغناطيسي. تحديد الدولة المنومة في الحيوانات هو أقل وضوحا مما هو عليه في المرضى من البشر. الام البديلة السلوكية المستخدمة على نطاق واسع لالتنويم المغناطيسي في القوارض هو فقدان المنعكس التقويمي (LORR)، أو النقطة التي الحيوان لم يعد يستجيب لغريزة فطرية بهم لتجنب ضعف الظهرية الاستلقاء. قمنا بتطوير نظام لتقييم LORR في 24 الفئران في وقت واحد بينما يسيطر بعناية ليفند المحتملة، بما في ذلك التقلبات في درجات الحرارة وتدفق الغاز متفاوتة. تسمح هذه الدوائر تقييم موثوق به للحساسية مخدر مقاسا الكمون للعودة من المنعكس المقوم (RORR) بعد التعرض مخدر الثابتة. بدلا من ذلك، وذلك باستخدام زيادات تدريجية (أو النقصان) في تركيز مخدر، أيضا تمكين غرف تحديد حساسية السكان لتحريض (أو ظهور) مقاساEC 50 وهيل المنحدر. أخيرا، وغرف التحكم البيئي وصفها هنا يمكن تكييفها لمجموعة متنوعة من الاستخدامات البديلة، بما في ذلك تسليم استنشاق أنواع أخرى من المخدرات، ودراسات علم السموم، ومتزامنة في الوقت الحقيقي رصد العلامات الحيوية.
Introduction
يتم تعريف التخدير العام من خلال قدرتها على أن يسبب حالة من التنويم المغناطيسي عكسها في مجموعة متنوعة واسعة من الأنواع، ولكن تفسيرا لكيف يمكن لهذه الدرجة متنوعة من العقاقير يمكن ان يبقى كل انتزاع نقطة نهاية المفرد بعيد المنال. وقد افترض عدد من النظريات على مر السنين، بدءا من علاقة ماير اوفرتون بين قوة مخدر والدهون الذوبان، والذي اقترح اضطرابات غشاء العامة كأساس لالتنويم المغناطيسي 1،2. وتشير المزيد من الأدلة الأخيرة التي تؤثر على الأهداف البروتين الإشارات العصبية تساهم في آثار مخدر. وقد أثبتت الفئران لتكون نموذجا لا غنى عنه لاستكشاف هذه النظريات بسبب التماثل بين الفئران والاستجابة مخدر الإنسان. على الرغم من الماوس لا يمكن سؤاله عن الوعي ذاتية لها تحت التخدير العام، وبعض ردود الفعل البدائية تخدم تدابير بديلة مفيدة للالقوارض التنويم المغناطيسي. في الأيام القليلة الأولى بعد الولادة، والفئران تطوير المقوم التركيب انعكاسيةonse يمنعهم من وضعه بشكل سلبي في موقف ضعيف 3. جرعة التخدير التي ماوس يفقد المنعكس المقوم لها يرتبط بشكل جيد مع الجرعات المنومة الإنسان 4.
لقد أصبح تقييم فقدان المنعكس التقويمي (LORR) معيار المختبر تستخدم على نطاق واسع لاختبار حساسية مخدر في الفئران فضلا عن مجموعة متنوعة من الأنواع الأخرى بما في ذلك الفئران، خنزير غينيا، الأرانب، النمس والأغنام والكلب 5-8. جرعة من مخدر يعطى في LORR التي سوف تحدث لأفراد الأنواع غير متسقة للغاية، ولكن يمكن أن تحول بشكل كبير من العوامل البيئية. على سبيل المثال، الفئران بالحرمان من النوم أكثر حساسية لكلا التخدير المتطايرة والوريد 9 و الفئران مع القدرة الهوائية العالية هي أقل حساسية للisoflurane و10. وقد تبين أيضا انخفاض حرارة الجسم إلى خفض جرعة التخدير اللازمة للعديد من التنويم المغناطيسي لفي طائفة واسعة من الأنواع 11-14. من أجللتحديد جرعة مخدر موثوق الذي LORR يحدث في مجموعة من حيوانات التجارب، فمن الأهمية بمكان أن يتم تقييم البيئة التي تسيطر عليها بعناية لتقليل التوتر، والحفاظ على euthermia، وتقديم كميات متساوية من المخدرات لجميع المواد الدراسية. وليس من المستغرب، ومن المعروف أيضا العوامل الوراثية لتغيير حساسية مخدر 15-18. وبالتالي، ينبغي أيضا النظر بعناية في السيطرة على الخلفية الوراثية 19.
وضعنا جهازا يضمن متطابقة تسليم مخدر الغازية إلى كل من الفئران 24 مع الحفاظ على ثابت 37 س C بيئة. تصميم اسطوانية شفافة الغرف التعرض لدينا يسمح لتقييم LORR بسرعة وسهولة التكامل من القياسات الفسيولوجية القياس عن بعد. وقد تبين هذا النظام لقياس بدقة isoflurane و، هالوثان، والحث سيفوفلوران EC 50 والوقت لظهور في البرية من نوع الفئران 20. وقد استخدمنا أيضاهذا النظام لمراقبة التغيرات في حساسية مخدر في الفئران مع الطفرات الجينية والآفات المستهدفة طائي 21-23. نحن هنا وصف اثنين من الطرق التي يمكن تقييم حساسية مخدر بعد التدخل الدوائي باستخدام جهاز لدينا بيئة تسيطر عليها. phenotyping ثابت للدولة من تحريض التخدير المتطايرة والحساسية ظهور يتطلب 8-10 ساعات، وبالتالي أفضل مصممة خصيصا للدراسات التي لا تتغير الظروف التجريبية، مثل التدخلات الدوائية المزمن أو طويل المفعول. ومع ذلك، لعلاج قصير المفعول الذي تتبدد بشكل ملحوظ مع مرور الوقت الآثار نحن أيضا تقديم إجراء بسيط لتقييم التغيرات في المقوم منعكس التالية إبر دقيقة جدا استهدفت stereotactically أو العلاجات المخدرات عن طريق الحقن التي تؤثر بشكل كبير على ظهور مخدر. هذه الاختبارات تمثل مجموعة فرعية صغيرة من التطبيقات المحتملة لهذا النظام بيئة تسيطر عليها، والتي يمكن تكييفها لأي عدد من subjالنظام الأوروبي من مجموعة متنوعة من الأنواع لتلقي أي نوع من العلاج استنشاقه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات الواردة في هذه الوثيقة من قبل لجنة جامعة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام بنسلفانيا.
1. نظرة عامة على جهاز اختبار
- يتكون جهاز الاختبار من 24 واضحة الاكريليك غرف أسطواني 10 سم في الطول و 5 سم في القطر (الحجم الكلي لل200 مل). وهذا الحجم هو المناسب لنموذجي 25 غ الماوس الكبار. غرف لديها منافذ في نهاية كل ومدخل ومخرج الغاز. نهاية منفذ غير قابلة للإزالة حتى أن الحيوانات قد تكون محملة بسهولة في الغرفة. وأغلقت فتحات ميناء الغاز بعناية مع شريط تفلون، بينما تستخدم مقاطع المطاط يا الدائري لختم نهاية القابلة للإزالة من غرف أسطواني.
- هي التي شنت كل من المجلسين على رف أن يجلس داخل حمام مائي. يتم تركيب رف بحيث يتم المغمورة فقط الجزء السفلي من الغرف (تحت مداخل الغاز). للاستقرار، ونهاية الجزء الخلفي من غرفة تقع على الدعم بحيث chamb كاملإيه يجلس أفقيا. وهذا يضمن حتى الاتصال للغرفة بأكملها مع الحمام.
- أنابيب البولي ايثيلين يربط دبابة الأكسجين إلى المرذاذ مخدر، ثم يمر من خلال 10 لتر / دقيقة تدفق متر. أنابيب تنقسم إلى 25 المقاومات الصغيرة قطرها يساوي طول لضمان يتم تسليم تدفق يساوي كل من 24 غرف ومحلل وكيل.
- خطوط فراغ خروج كل من المجلسين في الطرف المقابل للمدخل الغاز. هذا يعزز تدفق أحادي الاتجاه الذي يلغي إعادة التنفس من ثاني أكسيد الكربون الزفير. خطوط فراغ في مشعب تجمع للاتصال على خط الشفط في المنزل. صمام البوب قبالة على طول الخط الرئيسي فراغ يضمن ظروف الضغط الجوي داخل كل غرفة.
- يتم ملء حوض الاستحمام مع ما يكفي من المياه في الاتصال بالكامل أسفل كل غرفة. تعميم المياه من خلال الحمام والحفاظ على ثابت 37 درجة مئوية بواسطة مضخة.
2. تحقق النظام قبل التعرض
- Cهيك أن درجة حرارة الحمام المائي هو 37 درجة مئوية في جميع أنحاء الحمام.
- تدفق الأكسجين بمعدل 5 لتر / دقيقة (200 مل / دقيقة لكل غرفة + وكيل محلل). يغرق كل غرفة تحت الماء والبحث عن الفقاعات أو دخول الماء إلى الغرفة، وكلاهما يدل على وجود تسرب. ختم أي تسرب قبل بدء التجربة.
- لكل غرفة، وربط 500 مل / دقيقة تدفق متر في السطر بعد غرفة للتأكد من أن التدفقات ومتوازنة عبر كل من خطوط الغاز 25. وهذا يضمن أن تدفقات المدخلات 5 لتر / دقيقة سيتم توزيعها بالتساوي بحيث يتلقى كل غرفة 200 مل / دقيقة التدفق. أي غرفة لا تلقي تدفق المتوقع ينبغي أن يكون تدفق وتدفق أنابيب التحقق من العوائق.
- معايرة محلل كيل لضمان القراءة من 0.00٪ isoflurane وعند 100٪ من الأكسجين يتدفق.
3. زرع باقة درجة الحرارة
- أسبوع واحد قبل التعود، تخدير كل فأر مع 2٪ isoflurane و.
- تعقيم منطقة الرقبة الظهرية مع بتدين.
- حقن تحت الجلد مستجيب درجة الحرارة ما بين لوحي الكتف باستخدام العقيمة، الجاهزة إبرة محقن.
- رصد موقع الحقن اليومية للعدوى والهجرة من مستجيب.
4. روض الحيوانات لاختبار الدوائر
- قبل أربعة أيام من أول تقييم، ووضع جميع الفئران في غرف فردية لمدة 2 ساعة مع 100٪ من الأكسجين المتدفقة.
- كرر الخطوة 4.1 يوميا لمدة أربعة أيام قبل التقييم لتجنب آثار الخلط من التوتر بسبب البيئة الجديدة.
5. تنفيذ التدخل الدوائي التي ترغب في اختبار للتأثيرات على التخدير الحساسية
- قد يكون هذا التدخل لحقن التجسيمي في جزء معين من الدماغ 24، حقنة في الوريد أو داخل الصفاق 25، أو تسليم المخدرات إلى منطقة محددة في الدماغ عبر قنية 26.
- لأن هذه الإجراءات نفسها قد تتغير حساسية مخدر بالمقارنة مع حيوان السذاجة، يجب أن تخضع لمجموعة التحكم السليم نفس الإجراء مع حقن السيارة.
- تأكد من أن التدخل الدوائي لديه مدة طويلة بشكل مناسب للعمل إذا كنت تخطط للقيام تدريجي زيادة و / أو خفض تحديد حساسية مخدر كما هو موضح في الخطوة 6 أدناه، وإلا، انتقل إلى الخطوة 7.
6. تقييم التخدير الحساسية باستخدام تحديد شكل خطوات EC 50 لالتعريفي وظهور
- وضع كل حيوان في غرف فردية مع 100٪ من الأكسجين المتدفقة.
- تعيين تركيز isoflurane وإلى 0.4٪ * لمدة 15 دقيقة. خلال 2 دقيقة الأخيرة من هذه الفترة، وتقييم المنعكس المقوم كل حيوان من قبل المتداول بلطف الغرفة حتى يتم وضع الماوس على ظهرها. يعتبر المنعكس المقوم أن تكون سليمة إذا وفقط إذا كان الفأر هو قادرة على استعادة جميعمن الكفوف إلى أرضية الغرفة في غضون 2 دقيقة.
- * لاحظ أن 0.4٪ isoflurane وsubhypnotic هو جرعة في الفئران C57BL/6J. إن وجدت الفئران تفقد المنعكس المقوم بها في الخطوة الأولى، كانت الجرعة الأولي كبيرة جدا وينبغي تخفيض في أيام لاحقة.
- تسجيل حالة المنعكس التقويمي لكل الماوس ومسح كل البيانات الماوس لدرجة الحرارة. ويظهر سجل القالب في الجدول 1.
- زيادة تركيز isoflurane والتي كتبها ~ 0.05٪ لمدة 15 دقيقة ثم كرر الخطوة 7.2. نواصل القيام بهذا حتى فقدوا كل الحيوانات المنعكس المقوم بهم.
- اختياري: كرر نفس الإجراء لخفض جرعات isoflurane وتدريجي حتى استعادوا جميع الحيوانات المنعكس المقوم (انظر الخطوة 6.3).
- لإنهاء التجربة، إيقاف isoflurane وطرد والنظام بأكمله مع 100٪ من الأكسجين لمدة 15 دقيقة. هذا سوف يساعد على منع نقص الأكسجة كما استرداد الفئران قبل إعادتهم إلى أقفاص وطنهم وسوف حماية experimenter من أي تعرض مخدر.
- اختياري: إذا كان عدد الحيوانات أو عدد تركيزات مخدر تقتصر بسبب القيود المفروضة على الموارد أو الوقت، والتقديرات وخاصة المعلمة منحنى مناسبا المنحدر قد يكون هيل بالتقدير تقدير الخطأ، وانخفاض زورا. في مثل هذه الحالات، قد يكون من الضروري تكرار قياس حساسية مخدر موضح في الخطوات 6،1-6،6 على ما يصل إلى يومين تجريبية إضافية للحصول على كامل المعلمة هيل المنحدر الحقيقي وتقديره الخطأ المقابلة.
7. تقييم التغييرات على المدى القصير في التخدير الحساسية مع الوقت لظهور
- وضع كل حيوان في غرف فردية مع 100٪ من الأكسجين المتدفقة.
- تعيين تركيز isoflurane وإلى 1.2٪، وهو ما يعادل تحريض ED 99 لمن النوع البري الفئران C57BL/6J 20. الحفاظ على ل30-60 دقيقة وهذا يتوقف على المدة المتوقعة للعمل من التدخل الحاد.
- تأكيد LORR فييتم وضع جميع الحيوانات من قبل المتداول بلطف كل غرفة الفئران حتى على ظهورهم.
- إيقاف isoflurane وتدفق 100٪ والأكسجين. قياس الوقت حتى يستعيد كل حيوان المنعكس المقوم لها. ويعرف ذلك من خلال إخضاع جميع الكفوف الأربعة على أرضية الغرفة، وأكد من خلال وجود ثلاثة اختبارات متتالية مع المنعكس المقوم سليمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 فائدة الخطوة الحكيمة LORR فحص لتحديد الآثار طويلة الأمد للتدخل الدوائي. حمض Ibotenic (IBA) هو ناهض من الجلوتاميرجي N-ميثيل-D-asparate (NMDA) مستقبلات التي غالبا ما تستخدم باعتبارها excitotoxin أن تسبب الآفات العصبية الدائمة. نحن هنا حقن 10 NL من 1٪ IBA ثنائيا في مجال بطناني أمام البصرية (VLPO) من الفئران C57BL/6J أسبوع واحد قبل الاختبار. غالبية الخلايا العصبية في هذه النواة يحمل انخفاض معدلات إطلاق خلال اليقظة وزيادة نشاطهم على وجه التحديد خلال النوم غير حركة العين السريعة، النوم حركة العين السريعة، ومع التعرض لجرعات منومة من التخدير العام 23،27-29. يجب آفات نجاحا في VLPO تسبب المقاومة التي يسببها isoflurane والتنويم المغناطيسي. في كل مستوى متزايد من isoflurane و، وتآمر جزء من الفئران التي فقدت المنعكس المقوم ضد تركيز المخدر على نطاق وسجل 10. معطياتلكل مجموعة من الفئران كانت (IBA وحقن حقن السيارة) ثم تتناسب مع منحنى الاستجابة للجرعة السيني. لأن هذا الاختبار يبدأ دائما مع جميع الحيوانات تستقيم ودائما تنتهي مع جميع الحيوانات بعد أن فقدت وتقييد المقوم منعكس، أسفل وأعلى الثوابت إلى 0 و 1 على التوالي. المعلمات الحرة المتبقية من المنحنيات هي EC 50، أو تركيز المخدر الذي 50٪ من الفئران قد فقدت المنعكس المقوم بهم، والمنحدر هيل، وهو ما يعكس التباين السكان خلال هذه المرحلة الانتقالية الدولة المنومة. تم استخدام اختبار F للاستعلام ما إذا كان منحنى واحد مع الحث المشتركة EC 50 وهيل المعلمات المنحدر أفضل تناسب كل سيارة والجماعات IBA أم منحنيات الحث منفصلة مع المعلمات مميزة أفضل احتواء البيانات. تنشأ درجات الحرية في هذا الاختبار من نقاط البيانات الخام التي يقوم عليها مناسبا منحنى وتعتمد بالتالي على عدد من تركيزات مخدر اختبارها وعدد المعلمات كونها فاير-EC 50 وهيل المنحدر في هذه الحالة. وقد تم تحليل البيانات ظهور خطوة حكيمة وعلى غرار مطابق لبيانات لتحريض. علما بأن EC 50 لظهور يكاد يكون دائما أقل من تحريض بسبب التباطؤ مخدر المعروف أيضا باسم الجمود العصبية 30. خلافا للنتائج المتوقعة، والحيوانات التي تلقت IBA في VLPO لم تظهر أي فروق ذات دلالة إحصائية في EC 50 أو هيل أو منحدر لتحريض ظهور مقارنة مع الضوابط حقن السيارة (F = 2،80 1.73 و p = 0.184 لتحريض، F 2، 88 = 2.89 و p = 0.061 للظهور). هذا يشير إلى أن الخلايا العصبية الماوس VLPO هي مقاومة للآفة مع IBA 1٪، وهي حقيقة أكد مع الأنسجة بعد الوفاة (لا يظهر). لو وآخرون. وقد أثبتت سابقا أن جرعة من 10٪ IBA هو مطلوب لآفة الفئران VLPO 31، ولكن الفحص النسيجي للVLPO الماوس بعد الحقن من 10٪ كما أظهرت IBA أي دلالةفقدان الخلية غير قادر على (لا يظهر). ومن المعروف أن الفئران VLPO للتعبير مستقبلات NMDA 32. منذ 10٪ IBA قادرة على ممارسة تأثير حاد على حساسية مخدر عند حقنها في VLPO (انظر الشكل 2، المناقشة أدناه)، وهذا يؤكد أن الماوس VLPO يجب أن تمتلك أيضا مستقبلات NMDA الإجراءات اللازمة لنقابة المحامين الدولية. مما سبب التناقض بين الأنواع لا يزال غير واضح. تحققت الآفات الماوس VLPO ناجحة باستخدام استهدفت galanin-saporin 23.
على الرغم من IBA لا يكون لها تأثير طويل الأمد على حساسية isoflurane وعند حقنها في VLPO، من المتوقع أن تحفز الخلايا العصبية VLPO وعابر زيادة حساسية مخدر طبيعة مثير الحادة من هذا الدواء. في الشكل 2، ونحن قد استخدمت من الوقت لاختبار ظهور ليبرهن على وجود تحول كبير في الحساسية الحادة isoflurane ومباشرة بعد حقن مكروي IBA الثنائية في VLPO كما يتضح من فترات طويلة بشكل ملحوظالتنويم المغناطيسي بعد وقف تسليم مخدر (ع <0.001). على العكس، Microinjection من IBA في الحاجز الإنسي القريبة تسبب أي تغيير في الوقت المناسب لظهور مقارنة مع الضوابط حقن السيارة (ع> 0.05). يضيف هذه النتيجة أحد الجوانب المثيرة للاهتمام في العمل السابقة تبين أن تعطيل هذه النواة يمتد الوقت إلى ظهور 33،34. وقد بلغ متوسط البيانات للمجموعات التجريبية والضابطة في وقت لاختبار ظهور ومقارنة مع ANOVA في اتجاه واحد.
| وقت | isoflurane و(٪ ATM) | الماوس # 1 | الماوس # 2 | # 3 الماوس | ... |
| 0.4 | - | - | - | - | |
| 12:15 | 0.45 | - | X | - | - |
| 12:30 | 0.5 | - | X | X | - |
| 12:45 | 0.55 | - | X | X | |
| ... | 0.6 | - | X | X | X |
تم تقييم كل 15 دقيقة تم زيادة جرعة مخدر بنسبة 0.05٪ والمنعكس التقويمي لكل حيوان: الجدول 1 مثال على ورقة دخول لفترة طويلة الأجل التخدير تقييم الحساسية. "X" ترمز الحيوانات التي فقدت المنعكس المقوم من أجل نقطة زمنية معينة و"-" يدل على تلك التي حافظت المنعكس المقوم بهم.
الشكل 1. تقييم المنعكس التقويمي أسبوع واحد بعد حقن حمض Ibotenic في بطناني أمام البصرية رعبleus: أجريت على المدى الطويل حساسية مخدر فحص على الفئران مع أي مركبة أو حمض ibotenic (IBA) حقنها في منطقة بطناني أمام البصرية (VLPO) أسبوع واحد قبل الاختبار. وتناسب الاستقراء والبيانات ظهور لكل مجموعة مع منحنى الاستجابة للجرعة السيني (الاستقراء في خطوط الصلبة، وظهور في الخطوط المتقطعة) جنبا إلى جنب مع فاصل الثقة 95٪ بين أقواس ومنحنيات أفضل تناسب (الحانات المظللة). وقد تآمر تركيز المخدر على نطاق وسجل 10. وتظهر تداخل فترات الثقة 95٪ باللون الأرجواني. والسيني جرعة repsonse يناسب لكل من السيارة وتشير جماعات IBA أي دليل على منحنيات مميزة أفضل مناسبا استنادا EC 50 وهيل المنحدر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. الوقت لEmergence بعد حقن مكروي المحلي من حمض Ibotenic: مباشرة قبل التقييم، تلقت الفئران Microinjection من وN-ميثيل-D-asparate (NMDA) ناهض مستقبلات حمض ibotenic (IBA) في نواة أمام البصرية بطناني (VLPO). وتعرف هذه المنطقة ليتم تفعيلها خلال الناجم عن isoflurane والتنويم المغناطيسي. أدى حقن IBA إلى زيادة حادة في الوقت للعودة من المنعكس التقويمي مقارنة مع الضوابط حقن السيارة (ع <0.001). الوقت للظهور للحيوانات مع IBA حقنها الحاجز الإنسي لم تختلف عن الضوابط (ع> 0.05). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من تقييم LORR في ماوس واحدة هي المهمة التي تبدو واضحة، إلا أن ذلك ضروري للحفاظ على الظروف الفسيولوجية متطابقة بين الموضوعات من أجل جمع بيانات موثوقة من مجموعة من الحيوانات. وينظم بإحكام، ذات قدرة عالية جهاز LORR المقدمة هنا يوفر وسيلة لتوحيد التجارب وتعظيم الكفاءة. عن طريق اتباع المبادئ الأساسية للتنظيم الحرارة وتوزيع تدفق على قدم المساواة، وهذا النظام يمكن إنشائها بسهولة ومصممة خصيصا لتناسب الاحتياجات الفردية المجربون. يمكن تحجيم حجم الغرفة لأنواع أخرى، مثل الفئران، ويمكن استيعابها غرف إضافية عن طريق ربط المزيد من النقاط فرع لتدفق والفراغ. جميع المواد مرئية بسهولة من خلال غرف الاكريليك واضحة، الأمر الذي يجعل من الممكن لتجارب تسجيل الفيديو لتأكيد آخر مخصص الثانوي من النتائج. الاكريليك هو أيضا متوافقة مع أنظمة القياس عن بعد ترددات الراديو، والتي يمكن استخدامها لرصد درجات الحرارةتلح، وضغط الدم، وbiopotentials.
نقدم طريقتين مختلفتين لتقدير حساسية مخدر بعد التدخل الدوائي. كل من الوقت لظهور والاختبارات تحريض تدريجي تتطلب المجرب ليسجل وجود أو غياب المنعكس المقوم. حتى مع وجود تعريف صريح للLORR، مثل "غير قادر على إخضاع جميع الكفوف الأربعة في الطابق غرفة في غضون دقيقتين من أن توالت على ظهرها"، يمكن أن يكون تقييما موضوعيا إلى حد ما. فمن الأفضل أن يكون نفس الشخص بالعمى العلاج يسجل كل حيوان لمدة التجربة لضمان الاتساق. عند اختيار أي اختبار لاستخدامها لتقييم حساسية مخدر، يجب أن يكون طول المتوقعة للأثر من التدخل الدوائي العامل الحاسم. العديد من الأدوية لها مدة قصيرة من العمل، والتي في الوقت حادة لظهور نموذج يمكن أن توفر معلومات مفيدة عن حساسية مخدر في فترة محدودةمن الزمن. ومع ذلك، فإن الدواء قد يؤثر بشكل تفضيلي حساسية الحيوان للتحريض من التنويم المغناطيسي بدلا من ظهور، والتغيرات في الوقت المناسب لالاستقراء وغالبا ما يصعب اكتشاف لأن الاستقراء يحدث بسرعة، وبالتالي يتطلب التقييم المستمر. اختبار متدرج أطول لEC 50 من تحريض وظهور يمكن أن تعطي معلومات عن كل من مدخل والخروج من التنويم المغناطيسي. ويبلغ طول التجربة تعتمد على حجم الزيادة التي يتم من خلالها تغيير تركيز مخدر في كل خطوة، مع الحث + ظهور اختبارات نموذجية دائم حوالي 8 ساعة. سوف يقلل من حجم الخطوة مخدر حول المتوقعة EC 50 وزيادة عدد الحيوانات في كل مجموعة إعطاء منحنى الاستجابة للجرعة أفضل المجهزة ولكن أيضا إطالة الوقت اللازم لإتمام الفحص.
بعض التدخلات الدوائية قد يغير تفاضلي التهوية دقيقة من حيوانات التجارب بالمقارنة مع ضوابطها. Tله يمكن أن تسبب مجموعة واحدة إلى الزفير مخدر متقلبة في الوقت المناسب لاختبار ظهور بسرعة أكبر من غيرها، وبالتالي بتفاقم هذه النتائج. SOLT وآخرون. وصف طريقة بديلة جيدة لاختبار حساسية مخدر في هذا السيناريو 35. في تجربتهم، يتم تسليم الميثيلفينيديت النظامية خلال التعرض المستمر isoflurane وفي الحيوانات التي معايرتها بالفعل مع مخدر. وبالتالي استبعاد آثار الخلط المحتمل على التهوية دقيقة أثناء التعرض المستمر مخدر كما امتصاص وتوزيع مخدر أثناء ظروف الحالة المستقرة ومتوازنة بدقة عن طريق عملية التمثيل الغذائي والقضاء عليها. غرف وصفنا يمكن تعديلها بسهولة مع منفذ الغاز محكم إضافية للسماح بمرور أنابيب لفي الوريد أو داخل المخ تسليم المخدرات. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن وصفها 15 دقيقة من موازنة لكل تركيز مخدر في خطوة حكيمة فحص قد لا تكون كافية في بعض الحالات. AnesthetICS مع الذوبان أعلى من isoflurane و، مثل هالوثان، وسوف يستغرق وقتا أطول للوصول إلى تركيزات الكاملة في الأنسجة. الحيوانات والحيوانات الكبيرة التي تخضع لخطوات أكبر في تركيز مخدر قد تتطلب أيضا مزيدا من الوقت لكي تتوازن. لتحديد ما إذا كان 15 دقيقة كافية حقا لموازنة، وينبغي قياس مستويات الأنسجة مخدر في نفس التركيز من مخدر على حد سواء تصاعدي تنازلي وأطرافه من التعرض.
في الحالات التي يتم فيها عرقلة قدرة الحيوان على التحرك جسديا أو دوائيا، LORR قد لا تخدم كإجراء بديل جيد من التنويم المغناطيسي. البديل الأكثر موثوقية وتستخدم على نطاق واسع هو القشرية الكهربي (EEG) التسجيلات. على الرغم من EEG قد يكون من الأفضل قادرة على التقاط المزيد من التغييرات الطفيفة في حساسية مخدر، بل هو إلى حد كبير أكثر تكلفة لإنشاء من الجهاز وصفنا. زرع الأقطاب الكهربائية EEG هو إجراء الغازية ومضيعة للوقت، والقدرة ل obtaفي البيانات من الفئران متعددة في نفس الوقت وغالبا ما يحد من توافر المعدات. وعلاوة على ذلك، وتحليل تسجيلات EEG هو المفهوم أكثر تجريدا ويصعب تفسير من إخراج ثنائي بسيط لتقييم LORR. لهذه الأسباب، والاختبارات السلوكية مثل تلك الموصوفة هنا غالبا ما تكون وسائل أكثر جدوى للفحص بسرعة حساسية مخدر. لاحظ أن أنماط التخطيط الدماغي توحي الشهوة والتنويم المغناطيسي قد لا يتماشى جيدا مع السلوك. LORR وEEG هي النهاية متميزة وكلاهما من المرجح تقديم المعلومات المفيدة عن حساسية مخدر.
بالإضافة إلى التغيرات الناجمة عن المخدرات المحتملة في التهوية دقيقة والتنقل، وهناك العديد من القيود الأخرى على الطرق الموضحة في هذه الوثيقة. على الرغم من LORR هو بديل لمعيار التنويم المغناطيسي عبر الميدان، والمعايير والمنهجية المستخدمة لقياسه تختلف عبر المختبرات. بعض داعية أن الفئران يجب أن تكون استدارة بسرعة ثابتة لتقييم المنعكس المقوم. التقييم المستمر يضيق منطقيا التوقيت الدقيق الذي يتم فقدان المنعكس المقوم و / أو عوائد، ولكن فعل يجري تحولت مستلق قد يكون أكثر إثارة من مجرد المتبقية ضعيف. بالإضافة إلى ذلك، تقييم LORR خطوة حكيمة هو الفحص تستغرق وقتا طويلا قد تمديدها اذا تم العثور على 15 دقيقة من موازنة في كل خطوة غير كافية.
على الرغم من هذه القيود، والتطبيقات المحتملة لهذا البروتوكول تمتد إلى أبعد من حالات محددة قدمناه. بوضوح، والتدخلات الدوائية ليست هي الطريقة الوحيدة التي يمكن من خلالها تغيير حساسية مخدر؛ الآفات المستهدفة، وتشوهات التشريحية، والطفرات الوراثية قد تكون كل اختبار باستخدام نفس تدريجي تقرير EC 50. نظام بيئة تسيطر المقدمة هنا يمكن استخدامها لتقديم أي نوع من المخدرات استنشاقه، مثل الكورتيزون والمضادات الحيوية، أو المداواة التجريبية. القدرة على كشف العديد من الفئران إلى نفس عموالاتحاد الوطني للعمال من المخدرات في وقت واحد يجعل هذا المثل الأعلى الإعداد لدراسات علم السموم. بالإضافة إلى ذلك، غرف بمثابة بيئة التعافي بعد الجراحة المثالي مع تنظيم درجة الحرارة المحيطة وتدفق الاوكسجين النقي. هذا الجهاز مفيد لأي مثيل التي تحتاج علامات الحيوان الأساسية الحيوية التي يتعين رصدها والسيطرة عليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل R01 GM088156 وT32 HL007713-18. نود أن نشكر بيل ومايكل Pennie كارمان من جامعة ولاية بنسلفانيا البحوث الأجهزة محل لمساعدتهم في تجميع جهاز لدينا المقوم منعكس.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Oxygen | Airgas | OX300 | |
| Isoflurane | Butler Schein | Any volatile anesthetic of interest may be substituted | |
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mass flow meter- 10 SLPM | Omega Engineering | FMA-A2309 | |
| Mass flow meter- 500 SCCM | Omega Engineering | FMA-A2305 | |
| Anesthetic agent analyzer/gas indicator | AM Bickford | FI-21 Riken | |
| Heating water pump | Fisher Scientific | 13-874-175 | |
| Temperature transponders | BMDS | IPTT-300 | |
| RF temperature reader | BMDS | DAS-6007 |
References
- Meyer, H. H. Zur theorie der alkoholnarkose. I. Mittheilung. Welche Eigenschaft der An#228;sthetica bedingt ihre narkotische Wirkung? Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42, 109-137 Forthcoming.
- Overton, C. E. Studien über die Narkose: Zugleich ein Beitrag zur allgemeinen Pharmakologie. , Fischer. Jena. (1901).
- Bignall, K. E. Ontogeny of levels of neural organization: the righting reflex as a model. Exp. Neurol. 3 (3), 566-573 (1974).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat. Rev. Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab. Anim. 27 (1), 30-39 (1993).
- Schernthaner, A., Lendl, C., Busch, R., Henke, J. Clinical evaluation of three medetomidine--midazolam--ketamine combinations for neutering of ferrets (Mustela putorius furo)]. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift. 121 (1-2), 1-10 (2008).
- Mohammad, F. K., Zangana, I. K., Abdul-Latif, A. R.
- Nicholls, E. A., Louie, G. L., Prokocimer, P. G., Maze, M. Halothane anesthetic requirements are not affected by aminophylline treatment in rats and dogs. Anesthesiology. 65 (6), 637-641 (1986).
- Tung, A., Szafran, M. J., Bluhm, B., Mendelson, W. B. Sleep Deprivation Potentiates the Onset and Duration of Loss of Righting Reflex Induced by Propofol and Isoflurane. Anesthesiology. 97 (4), 906-911 (2002).
- Pal, D., et al. Determination of Minimum Alveolar Concentration for Isoflurane and Sevoflurane in a Rodent Model of Human Metabolic Syndrome. Anesth. 2 (2), 297-302 (2012).
- Eger, E. I., Saidman 2nd,, J, L., Brandstater, B. Temperature dependence of halothane and cyclopropane anesthesia in dogs: correlation with some theories of anesthetic action. Anesthesiology. 26 (6), 764-770 (1965).
- Vitez, T. S., White, P. F., Eger, E. I. 2nd Effects of hypothermia on halothane MAC and isoflurane MAC in the rat. Anesthesiology. 41 (1), 80-81 (1974).
- Antognini, J. F. Hypothermia eliminates isoflurane requirements at 20 degrees C. Anesthesiology. 78 (6), 1152-1156 (1993).
- McKenzie, J. D., et al. Effects of temperature on the anaesthetic potency of halothane, enflurane and ethanol in Daphnia magna (Cladocera: Crustacea). Comp. Biochem. Physiol. C. 101 (1), 15-19 (1992).
- Icaza, E. E., et al. Isoflurane-Induced Changes in Righting Response and Breathing are Modulated by RGS Proteins. Anesth. Analg. 109 (5), 1500-1505 (2009).
- Drexler, B., Antkowiak, B., Engin, E., Rudolph, U. Identification and characterization of anesthetic targets by mouse molecular genetics approaches. Can. 2 (2), 178-190 (2011).
- Wafford, K. A., et al. Differentiating the role of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor subtypes. Biochem. 32 (Pt3), 553-556 (2004).
- Lakhlani, P. P., et al. Substitution of a mutant α2a-adrenergic receptor via "hit and run" gene targeting reveals the role of this subtype in sedative, analgesic, and anesthetic-sparing responses in. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (18), 9950-9955 (1997).
- Sonner, J. M., Gong, D., Eger, E. I. Naturally Occurring Variability in Anesthetic Potency Among Inbred Mouse Strains. Anesth. 91 (3), 720-726 (2000).
- Sun, Y., et al. High throughput modular chambers for rapid evaluation of anesthetic sensitivity. BMC Anesthesiol. 6 (1), 13 (2006).
- Hu, F. Y., et al. Hypnotic Hypersensitivity to Volatile Anesthetics and Dexmedetomidine in Dopamine β-Hydroxylase Knockout Mice. Anesthesiology. , (2012).
- Kelz, M. B., et al. An essential role for orexins in emergence from general anesthesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (4), 1309-1314 (2008).
- Moore, J. T., et al. Direct Activation of Sleep-Promoting VLPO Neurons by Volatile Anesthetics Contributes to Anesthetic Hypnosis. Curr. 22 (21), 2008-2016 (2012).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079 (2012).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (67), e2771 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Szymusiak, R., Alam, N., Steininger, T. L., McGinty, D. Sleep-waking discharge patterns of ventrolateral preoptic/anterior hypothalamic neurons in rats. Brain Res. (1-2), 178-188 (1998).
- Nelson, L. E., et al. The sedative component of anesthesia is mediated by GABAA receptors in an endogenous sleep pathway. Nat. Neurosci. 5 (10), 979-984 (2002).
- Li, K. Y., Guan, Y., Krnjević, K., Ye, J. H. Propofol Facilitates Glutamatergic Transmission to Neurons of the Ventrolateral Preoptic Nucleus. Anesthesiology. 111 (6), 1271-1278 (2009).
- Friedman, E. B., et al. A Conserved Behavioral State Barrier Impedes Transitions between Anesthetic-Induced Unconsciousness and Wakefulness: Evidence for Neural Inertia. PLoS ONE. 5 (7), e11903 (2010).
- Lu, J., Greco, M. A., Shiromani, P., Saper, C. B. Effect of lesions of the ventrolateral preoptic nucleus on NREM and REM sleep. J. Neurosci. 20 (10), 3830-3842 (2000).
- Sun, X., Whitefield, S., Rusak, B., Semba, K. Electrophysiological analysis of suprachiasmatic nucleus projections to the ventrolateral preoptic area in the rat. Eur. J. Neurosci. 14 (8), 1257-1274 (2001).
- Ma, J., Shen, B., Stewart, L. S., Herrick, I. A., Leung, L. S. The septohippocampal system participates in general anesthesia. J. Neurosci. 22 (2), RC200 (2002).
- Leung, L. S., Ma, J., Shen, B., Nachim, I., Luo, T. Medial septal lesion enhances general anesthesia response. Exp. Neurol. , (2013).
- Solt, K., et al. Methylphenidate Actively Induces Emergence from General Anesthesia. Anesthesiology. 115 (4), 791-803 (2011).
