Summary
Tap av rettende refleks har lenge fungert som en standard atferds surrogat for bevisstløshet, også kalt hypnose, i forsøksdyr. Endringer i flyktige anestesi sensitivitet som følge av farmakologiske intervensjoner kan detekteres med en nøye kontrollert high-throughput vurderingssystem, som kan være innrettet for levering av inhalert terapeutisk.
Abstract
En ønskelig endepunkt av generell anestesi er den tilstand av bevisstløshet, også kjent som hypnose. Definere hypnotisk tilstand hos dyr er mindre oversiktlig enn det er hos mennesker. En mye brukt atferds surrogat for hypnose hos gnagere er tap av opprettingsrefleks (LORR), eller det punktet hvor dyret reagerer ikke lenger på sine medfødt instinkt for å unngå sårbarheten i rygg recumbency. Vi har utviklet et system for å vurdere LORR i 24 mus samtidig mens nøye kontrollert for potensielle confounds, inkludert temperatursvingninger og varierende gasstrømmer. Disse kamrene tillater pålitelig vurdering av anestesi følsomhet målt ved latens til å returnere til den rettende refleks (RORR) etter et fast bedøvelse eksponering. Alternativt, ved hjelp av trinnvis øker (eller minker) i bedøvelse konsentrasjon, kamrene også aktivere fastsettelse av en befolkning følsomhet for induksjon (eller veksten) som målt vedEC 50 og Hill skråningen. Endelig kan de kontrollerte miljøkamre som er beskrevet her være tilrettelagt for en rekke alternative bruksområder, inkludert inhalert levering av andre rusmidler, toksikologiske studier, og samtidig sanntids overvåking av vitale tegn.
Introduction
Generelle anestetika er definert av deres evne til å forårsake en reversibel tilstand av hypnose i et bredt spekter av arter, men en forklaring på hvordan en slik mangfoldig klasse av narkotika kan alle lokke fram et entall endepunkt fortsatt ukjent. En rekke teorier har blitt fremføres i løpet av årene, fra og med Meyer-Overton korrelasjon mellom bedøvelse potens og lipid løselighet, som foreslo generelle membran forstyrrelser som grunnlag for hypnose 1,2. Nyere bevis tyder på at protein mål påvirker nevronal signale bidra til bedøvende effekter. Mus har vist seg å være et uunnværlig modell for å utforske disse teorier på grunn av homologi mellom murine og humane anestesirespons. Selv om en mus ikke kan bli spurt om sin subjektive bevissthet under narkose, enkelte primitive reflekser tjene som nyttige surrogat tiltak av gnager hypnose. I de første dagene etter fødsel, musene utvikler en refleksiv rettende response som hindrer dem fra å bli passivt plasseres i liggende stilling tre. Dosen av anestesi på som en mus mister sin rettende refleks korrelerer godt med menneskelige hypnotiske doser fire.
Vurdering av tap av opprettingsrefleks (LORR) er blitt en utbredt laboratoriestandard for testing av anestesi sensitivitet i mus, så vel som en rekke andre arter, inkludert rotte, marsvin, kanin, ilder, sau, hund og 5-8. Den dose av et gitt anestesi ved hvilken LORR vil oppstå for medlemmer av en art som er meget jevn, men det kan forskyves i betydelig grad av miljøfaktorer. For eksempel søvnmangel rotter er mer følsomme for både flyktige og intravenøse anestetika 9 og rotter med høy aerob kapasitet er mindre følsomme for isofluran 10. Hypotermi er også blitt vist å redusere dosen av mange anestetika som kreves for hypnose i et stort spektrum av arten 11-14. Forpå en pålitelig måte å identifisere det anestetiske dose ved hvilken LORR forekommer i en gruppe av forsøksdyr, er det avgjørende at vurderingen miljøet kontrolleres nøye for å minimalisere stress, opprett euthermia, og levere like mengder medikament til alle fag. Ikke overraskende er genetiske faktorer også kjent å endre bedøvelse følsomhet 15-18. Derfor bør nøye vurdering også gis til å kontrollere for genetisk bakgrunn 19.
Vi har utviklet en anordning som sikrer identiske gassformig anestetikum levering til hver av 24 mus, og samtidig opprettholde et konstant 37 ° C miljø. Den transparente sylindriske design av våre eksponeringskamrene tillater rask LORR vurdering og enkel integrasjon av telemetriske fysiologiske målinger. Dette system har vist seg å måle isofluran, halotan, og sevoflurane induksjon EC 50 og tid til å fremveksten i villtype-mus 20. Vi har også benyttetdette systemet for å observere endringer i anestesi følsomhet i mus med genetiske mutasjoner og målrettede hypothalamus lesjoner 21-23. Her beskriver vi to måter som bedøvelse følsomhet kan vurderes etter en farmakologisk intervensjon ved hjelp av vår kontrollert miljø apparat. Steady-state phenotyping av flyktige anestesi induksjon og fremveksten følsomhet krever 8-10 timer, og er dermed beste skreddersydd for studier hvor forsøksbetingelsene ikke endres, for eksempel i kroniske eller langtidsvirkende farmakologiske intervensjoner. Men for korttidsvirkende behandlinger hvor virkningen spre seg betydelig over tid presenterer vi også en enkel prosedyre for å vurdere endringer i rettende refleks følgende stereotactically målrettede microinjections eller intravenøse medikamentelle behandlinger som vesentlig påvirker bedøvelse veksten. Disse tester representerer en liten del av den potensielle anvendelser for denne kontrollert miljø system, som kan tilpasses for en rekke subjekter av en rekke arter å motta noen form for inhalert terapeutisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr er skissert her har blitt godkjent av University of Pennsylvanias Institutional Animal Care og bruk komité.
En. Oversikt over Testing Apparatus
- Testapparatet består av 24 klare akryl sylindriske kamre 10 cm i lengde og 5 cm i diameter (totalt volum på 200 ml). Denne størrelse er passende for en typisk 25 g-voksne mus. Chambers har porter i hver ende for gassinnløp og-utløp. Den utløpsende er avtagbar, slik at dyrene kan lett legges inn i kammeret. Gass-portåpninger er omhyggelig forseglet med Teflon-tape, mens gummi o-ringpakninger som brukes til å forsegle den uttakbare ende av de sylindriske kamre.
- Hvert kammer er montert på et stativ som sitter inne i et vannbad. Stativet er montert slik at bare den nedre del av kamrene (under gassinnløp) er neddykket. For stabilitet, bakenden av kammeret hviler på en støtte slik at hele chambeh sitter horisontalt. Dette sikrer jevn kontakt over hele kammeret med badekaret.
- Polyetylen rør kobler en oksygentank til en anestesifordamper, og deretter passerer gjennom en 10 L / min strømningsmåler. Slangen deles i 25 liten diameter motstander av lik lengde for å sikre likestrøm leveres til hvert av de kamre 24 og til en agent analysator.
- Vakuum linjer avslutte hvert kammer på den motsatte ende av gassinnløpet. Dette fremmer ensrettet strømning som fjerner gjenpustings av utåndet karbondioksyd. Vakuumledningene kombinere på en manifold for å koble til en in-house sugerøret. En pop-off ventil langs hoved vakuum linjen sikrer atmosfæriske trykkforhold innenfor hvert kammer.
- Badekaret fylles med nok vann til å ha full kontakt med bunnen av hvert kammer. Vannet sirkuleres gjennom badet og opprettholdt ved en konstant 37 ° C av en pumpe.
2. Sjekk system Før Eksponering
- Cavbryter at temperaturen i vannbadet er 37 ° C gjennom hele badet.
- Strømnings oksygen med en hastighet på 5 l / min (200 ml / min pr kammer + middel analysator). Senk hvert kammer under vann og se etter bobler eller oppføring av vann inn i kammeret, som begge er en indikasjon på lekkasje. Tett eventuelle lekkasjer før du starter eksperimentet.
- For hvert kammer, koble en 500 ml / min strømningsmåler i kø etter kammeret for å være sikker på at strømmene er balansert over hver av de 25 gassledninger. Dette sikrer at inngangs 5 l / min strømmer vil bli jevnt fordelt, slik at hvert kammer får 200 ml / min strømning. Enhver kammeret ikke får den forventede strømmen skal ha sin tilsig og avløp rør kontrolleres for hindringer.
- Kalibrere agenten analysator for å sikre en lesning av 0,00% isofluran når 100% oksygen strømmer.
Tre. Implant Temperatur Transponder
- En uke før tilvenning, anesthetize hver mus med 2% isofluran.
- Steril dorsal nakkeområdet med betadine.
- Injiser et temperatur transponder subkutant mellom skulderbladene ved hjelp av sterile, forhåndsdefinerte injektor nål.
- Overvåk injeksjonsstedet daglig for infeksjon og migrering av transponderen.
4. Tilvenne Dyr to Testing Chambers
- Fire dager før den første vurderingen, plassere alle mus i individuelle kamre for 2 timer med 100% oksygen strømmer.
- Gjenta trinn 4.1 daglig i fire dager før evaluering for å unngå kompliserende virkninger av stress på grunn av et nytt miljø.
5. Utfør farmakologisk intervensjon som du ønsker å teste for effekter på Bedøvelse Følsomhet
- Dette intervensjon kan være en stereotaxic injeksjon i en bestemt del av hjernen 24, en intravenøs eller intraperitoneal injeksjon 25, eller levering av et medikament til en bestemt hjerneområde via kanyle 26.
- Fordi disse fremgangsmåter seg selv kan endre seg bedøvelse sensitivitet sammenlignet med et naivt dyr, bør en passende kontrollgruppe gjennomgå den samme prosedyre med kjøretøy injeksjoner.
- Kontroller at farmakologisk intervensjon har en hensiktsmessig lang virkningstid hvis du planlegger å gjøre en trinnvis økende og / eller redusere bestemmelse av bedøvelse følsomhet som vist i trinn 6 nedenfor, ellers går videre til trinn 7.
6. Vurdere Bedøvelse Følsomhet hjelp av en trinnvis EC 50 Fastsettelse for induksjon og Emergence
- Plasser hvert dyr i individuelle kamre med 100% oksygen strømmer.
- Sett isofluran konsentrasjonen til 0,4% * i 15 min. I løpet av de siste to minutter av denne perioden vurdere hver dyrets rettingsrefleksen av bølgende kammeret inntil mus plasseres på ryggen. Den opprettingsrefleks er ansett å være intakt hvis og bare hvis musen er i stand til å gjenopprette alleav labbene til gulvet i kammeret i løpet av 2 min.
- * Vær oppmerksom på at 0,4% isofluran er en subhypnotic dose i C57BL/6J mus. Hvis noen mus mister sin rettende refleks på første trinn, den første dosen var for stor og bør reduseres på påfølgende dager.
- Spill staten rettende refleks for hver mus og skanne hver mus for temperaturdata. En mal rekord er vist i tabell 1.
- Øk isofluran konsentrasjonen av ~ 0,05% i 15 min og gjenta trinn 7.2. Fortsett å gjøre dette til alle dyrene har mistet sin rettende refleks.
- Valgfritt: gjenta samme prosedyre for å redusere trinnvis isofluran doser til alle dyr har fått tilbake sin rettende refleks (se trinn 6.3).
- For å avslutte forsøket, slå av isofluran og skyll hele systemet med 100% oksygen i 15 min. Dette vil bidra til å hindre hypoksi som musene gjenopprette før de blir returnert til sine hjem bur og vil beskytte experimenter fra noen bedøvelse eksponering.
- Valgfritt: hvis antall dyr eller antall anestesi konsentrasjoner er begrenset på grunn av ressurs eller tidspress, de kurvetilpasning parameterestimater-spesielt den Hill skråningen-kan ha undervurdert, feilaktig lav feilestimat. I slike tilfeller kan det være nødvendig å gjenta bedøvelse følsomhet måling som er beskrevet i trinn 6.1 til 6.6 i ytterligere opptil to eksperimentelle dager å full skaffe den sanne Hill skråningen parameter og den tilsvarende feilestimering.
7. Vurdere kortsiktige endringer i Bedøvelse Følsomhet med Time to Emergence
- Plasser hvert dyr i individuelle kamre med 100% oksygen strømmer.
- Sett isofluran konsentrasjon til 1,2%, noe som tilsvarer den induksjon ED 99 for villtype C57BL/6J mus 20. Opprettholde i 30-60 min avhengig av forventet varighet av virkningen av akutt intervensjon.
- Bekreft LORR ialle dyr av bølgende hvert kammer før mus er plassert på ryggen.
- Slå av isofluran og flyte 100% oksygen. Mål tiden til hvert dyr gjenvinner sin rettende refleks. Denne er definert ved plassering av alle fire poter på gulvet av kammeret og bekreftet ved tilstedeværelse av tre påfølgende forsøk med en intakt rettingsrefleksen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser nytten av trinnvis LORR analysen for å bestemme langsiktige effektene av en farmakologisk intervensjon. Ibotenic syre (IBA) er en agonist av glutamaterg N-metyl-D-asparate (NMDA)-reseptor som er ofte brukt som et excitotoxin å forårsake permanente neuronale lesjoner. Her vi injisert 10 nl av 1% IBA bilateralt inn i ventrolateral preoptic området (VLPO) av C57BL/6J mus én uke før testing. Flertallet av nevroner i denne kjernen stille lave priser av avfyring under våkenhet og spesielt øke sin aktivitet under non-rapid eye movement søvn, raske øyebevegelser søvn, og med eksponering for hypnotiske doser av generell anestesi 23,27-29. Vellykket lesjoner i VLPO bør føre til resistens mot isofluran-indusert hypnose. På hvert økende grad av isofluran ble brøkdel av mus som hadde mistet den rettende refleks plottet mot bedøvelse konsentrasjon på en log 10 skala. Datafor hver gruppe av mus (kjøretøy-injisert og IBA-injisert) ble deretter i form med en sigmoidal dose-responskurve. Fordi denne analysen starter alltid med alle dyr oppreist og alltid ender med alle dyr som har mistet rettende refleks, bunn og topp konstanter ble begrenset til 0 og 1, henholdsvis. De gjenværende frie parametere av kurvene EC 50, eller konsentrasjonen av bedøvelse ved hvilken 50% av musene har mistet sin rettingsrefleksen, og Hill stigningen, som reflekterer populasjonsvariansen under hypnotiske tilstandsovergang. En F-test ble brukt til å spørre om en enkelt induksjon kurve med delt EC 50 og Hill skråningen parametere best passer både kjøretøy og IBA grupper eller om separate induksjons kurver med forskjellige parametre bedre passe dataene. De frihetsgrader i denne testen oppstå fra de rå-datapunktene ligger til grunn for kurve og følgelig være avhengig av antallet anestesi konsentrasjoner som ble testet, og det antall parametere blir fit-EC 50 og Hill skråningen i dette tilfellet. Trinnvis veksten data ble analysert og modellert identisk til data for induksjon. Legg merke til at EC 50 for veksten er nesten alltid lavere enn for induksjon på grunn av bedøvelse hysterese også kjent som neural treghet 30.. I motsetning til forventede resultater, dyr som fikk IBA i VLPO viste ingen signifikante forskjeller i EC 50 eller Hill skråningen for induksjon eller veksten i forhold til kjøretøy injisert kontroller (F 2,80 = 1,73 og p = 0,184 for induksjon, F 2, 88 = 2,89 og p = 0,061 for fremveksten). Dette indikerer at muse VLPO nevroner er motstandsdyktig mot lesjon med 1% IBA, noe som ble bekreftet med post-mortem histologi (ikke vist). Lu et al. tidligere har vist at en dose på 10% IBA er nødvendig for å lesjon rotte VLPO 31, men histologisk undersøkelse av muse VLPO etter injeksjon av 10% IBA viste også ingen betydcant celle tap (ikke vist). Rotte VLPO er kjent for å uttrykke NMDA reseptorer 32. Siden 10% IBA er i stand til å utøve en akutt effekt på anestesi følsomhet når de injiseres inn i den VLPO (se figur 2, diskusjonen nedenfor), hevder at dette muse VLPO må også ha den NMDA-reseptorer er nødvendig for IBA handlinger. Dermed årsaken til avviket mellom arter er fortsatt uklart. Vellykket mus VLPO lesjoner har blitt oppnådd ved hjelp av en målrettet galanin-saporin 23.
Selv IBA ikke har en langsiktig effekt på isofluran følsomhet når injiseres i VLPO, ville den akutte eksitatoriske natur av dette stoffet kan forventes å stimulere VLPO nevroner og forbigående øke anestesi følsomhet. I figur 2 har vi brukt tiden til fremveksten test for å demonstrere et stort akutt skifte i isofluran følsomhet umiddelbart etter bilateral IBA mikroinjeksjon inn i VLPO som gjenspeiles av utpreget forlengethypnose etter opphør av bedøvelse levering (p <0,001). Motsatt, mikroinjeksjon av IBA inn i den nærliggende mediale septum forårsaket ingen endring i tid til veksten i forhold til kjøretøy injisert kontroller (p> 0,05). Dette funnet gir et interessant fasett til tidligere arbeid som viser at inaktivering av denne kjernen strekker seg tid til veksten 33,34. Data for forsøks-og kontrollgrupper i tiden for å fremveksten testen ble gjennomsnitt og sammenliknet med en enveis ANOVA.
| Tid | Isofluran (% atm) | Mus # 1 | Mus # 2 | Mus # 3 | ... |
| 0,4 | - | - | - | - | |
| 12:15 | 0,45 | - | X | - | - |
| 12:30 | 0,5 | - | X | X | - |
| 12:45 | 0,55 | - | X | X | |
| ... | 0.6 | - | X | X | X |
. Tabell 1 Eksempel på en Log Sheet for Long-term Bedøvelse Følsomhet Assessment: Every 15 min narkosen Dosen ble økt med 0,05% og rettende refleks ble vurdert for hvert dyr. "X" betyr dyr som hadde mistet sin rettingsrefleksen for et gitt tidspunkt, og "-" betegner dem som opprettholdt sin rettingsrefleksen.
Figur 1. Vurdering av opprettingsrefleks En uke etter ibotenic Acid Injeksjon i ventrolateral preoptic NucLeus: Den langsiktige bedøvelse følsomhet analysen ble utført på mus med enten bil eller ibotenic syre (IBA) sprøytes inn i ventrolateral preoptic området (VLPO) en uke før testing. Induksjon og fremveksten av data for hver gruppe ble plass med en sigmoidal dose-responskurve (induksjon i heltrukne linjer, veksten i stiplede linjer) sammen med 95% konfidensintervall bracketing de best-fit kurver (skraverte søyler). Bedøvelse konsentrasjon ble plottet på en log 10 skala. Overlappende 95% konfidensintervall er vist i lilla. Den sigmoidal dose-repsonse passer for både kjøretøy og IBA grupper foreslår ingen bevis for distinkte best tilpasning kurver basert på EC 50 og Hill skråningen. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Tid til Emergence Etter lokal Mikroinjeksjon av ibotenic Acid: Umiddelbart før vurdering, mottok musene en mikroinjeksjon av N-metyl-D-asparate (NMDA) reseptor-agonist ibotenic syre (IBA) inn i ventrolateral preoptic kjernen (VLPO). Dette området er kjent for å bli aktivert under isofluran-indusert hypnose. IBA injeksjon førte til en akutt økning i tid for å gå tilbake til rettende refleks i forhold til kjøretøy injisert kontrollene (p <0,001). Tid til utvikling for dyr med IBA injiseres i mediale septum skilte seg ikke fra kontrollene (p> 0,05). Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om vurderingen av LORR i et enkelt muse er en tilsynelatende enkel oppgave, er det likevel viktig å opprettholde samme fysiologiske forhold mellom fag for å samle inn pålitelige data fra en gruppe av dyr. Den strengt regulert, høykapasitets LORR apparat presenteres her tilbyr en måte å standardisere eksperimenter og maksimere effektiviteten. Ved å følge de grunnleggende prinsippene for termoregulering og lik strømningsfordeling, kan dette systemet være lett gjenskapt og tilpasset for å passe individuelle forskere behov. Kammer størrelse kan skaleres for andre arter, slik som rotter, og ytterligere kamre kan innpasses ved å feste flere forgreningspunktene til innstrømningen og vakuum. Alle fag er lett synlig gjennom den klare akryl kamre, noe som gjør det mulig å video rekordforsøk for sekundær post-hoc bekreftelse av resultatene. Den akryl er også kompatibelt med radiofrekvens-telemetri-systemer, som kan anvendes for å overvåke temperature, blodtrykk, og biopotentials.
Vi presenterer to ulike metoder for å vurdere anestesi følsomhet etter en farmakologisk intervensjon. Både tid til fremveksten og den stegvise induksjons testene krever eksperimentator å score nærvær eller fravær av rettende refleks. Selv med en eksplisitt definisjon av LORR, slik som "ute av stand til å plassere alle fire labbene på kammeret gulvet i løpet av to minutter for å bli rullet på ryggen", kan vurderingen være noe subjektivt. Det er best å ha den samme behandlings-blindet individuell vurdering hvert dyr for varigheten av forsøket for å sikre konsistens. Når du velger hvilken test som skal brukes til bedøvelse sensitivitetsvurderingen, bør den forventede lengden av effekten fra den farmakologisk intervensjon være den avgjørende faktoren. Mange legemidler har en kort virkningstid, hvor akutt tid til veksten paradigme kan gi nyttig informasjon om bedøvelse følsomhet i en begrenset periodetid. Imidlertid kan et medikament fortrinnsvis påvirke et dyrs følsomhet for induksjon av hypnose i stedet veksten; endringer i tid til induksjons er ofte vanskelige å oppdage fordi induksjon skjer raskt og dermed krever kontinuerlig vurdering. Jo lenger trinnvis test for EC 50 av induksjon og fremveksten kan gi informasjon om både inngang til og utgang fra hypnose. Den totale lengden av forsøket vil avhenge av størrelsen av tilveksten av hvilken anestesi konsentrasjon endres for hvert trinn, med typiske induksjon + veksten tester som varer omtrent 8 timer. Reduksjon av anestesitrinnstørrelsen rundt den forventede EC 50 og øker antallet dyr i hver gruppe vil gi en bedre montert dose-respons-kurve, men vil også forlenge den tid som kreves for å fullføre analysen.
Noen farmakologiske intervensjoner kan differentially endre minutt ventilasjon av forsøksdyr i forhold til sine kontroller. Thans kunne føre til en gruppe for å puste ut den volatile bedøvelse i tiden veksten test raskere enn den andre, og dermed confounding resultatene. Solt et al. beskrive et godt alternativ metode for å teste anestesi følsomhet i dette scenariet 35. I forsøket deres, er systemisk metylfenidat levert under konstant isofluran eksponering i dyr som allerede har likevekt med bedøvelse. Potensielle konfunderende effekter på minuttet ventilasjon er dermed ekskludert under kontinuerlig bedøvelse eksponering som bedøvelse opptak og distribusjon i løpet av steady-state er nøyaktig balansert ved metabolisme og eliminasjon. Kamrene vi beskriver lett kan modifiseres med en ytterligere gasstett port for å tillate passering av røret for intravenøs eller intracerebral levering av legemidler. Det bør også bemerkes at den beskrevne 15 min for ekvilibrering til hver konsentrasjon av bedøvelse i det trinnvis analysen ikke kan være tilstrekkelig i visse tilfeller. Anesthetics med en høyere løselighet enn isofluran, slik som halotan, vil ta lengre tid å nå sitt fulle konsentrasjoner i vevet. Større dyr og dyr som gjennomgår større skritt i bedøvelse konsentrasjon kan også kreve mer tid til å stabilisere seg. For å finne ut om 15 min er virkelig tilstrekkelig for Ekvilibreringen bør anestesi vevsnivåer på samme konsentrasjon av bedøvelse på både stigende og synkende lemmer av eksponering måles.
I tilfeller hvor et dyrs evne til å bevege seg er fysisk eller farmakologisk hindret, kan LORR ikke tjene som et godt surrogat mål på hypnose. Den mest pålitelige og mye brukt alternativ er kortikale elek (EEG) opptak. Selv EEG kan være bedre i stand til å plukke opp mer subtile endringer i anestesi følsomhet, er det betydelig dyrere å sette opp enn apparatet vi beskrive. Implantering av EEG-elektroder er en invasiv og tidkrevende prosedyre, og evnen til å obtai data fra flere mus samtidig er ofte begrenset av utstyret tilgjengelighet. Videre er analyse av EEG opptak konseptuelt mer abstrakt og vanskelig å tolke enn det enkle binære utgang av LORR vurdering. Av disse grunner, atferdstester som de som er beskrevet her, er ofte mer gjennomførbare metoder for hurtig screening av anestesi følsomhet. Merk at EEG-mønstre som tyder på opphisselse og hypnose ikke kan korrelerer godt med atferd. LORR og EEG er forskjellige endepunkter som begge trolig gi nyttig informasjon om bedøvelse følsomhet.
I tillegg til potensielle medikamentinduserte forandringer i liten ventilasjon og mobilitet, er det flere andre begrensninger for fremgangsmåtene beskrevet heri. Selv LORR er en standard surrogat for hypnose på tvers av feltet, kriterier og metoder som brukes for sin måling varierer på tvers av laboratorier. Noen talsmann for at musene skal roteres med en konstant hastighet for å vurdere rettende refleks. Kontinuerlig vurdering logisk smalner den nøyaktige timingen som rettende refleks er tapt og / eller avkastning, men kan det å bli slått liggende være mer stimulerende enn bare gjenværende liggende. I tillegg er trinnvis LORR vurderings en tidkrevende assay som kan forlenges ytterligere dersom 15 minutter av ekvilibrering ved hvert trinn finnes å være utilstrekkelig.
Til tross for disse begrensningene, de mulige bruksområder for denne protokollen strekker seg langt utover de konkrete tilfeller vi har presentert. Åpenbart farmakologiske tiltak er ikke den eneste metoden som bedøvelse sensitivitet kan endres; målrettede lesjoner, anatomiske abnormiteter, og genetiske mutasjoner kan alle bli testet ved hjelp av samme stegvis EC 50 besluttsomhet. Den kontrollerte miljø-systemet som presenteres her, kan brukes til å levere en hvilken som helst form for inhalerte medikament, slik som kortikosteroider, antibiotika, eller eksperimentelle terapeutiske midler. Evnen til å eksponere mange mus til samme amount av narkotika på en gang gjør dette oppsettet ideelt for toksikologi studier. I tillegg kamre tjener som et ideelt post-kirurgiske utvinning miljø med regulert temperatur og frisk oksygen. Denne anordning er nyttig ved hvilken som helst forekomst i hvilken basis animalske livstegn trenger å bli overvåket og kontrollert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av R01 GM088156 og T32 HL007713-18. Vi vil gjerne takke Bill Pennie og Michael Carman fra University of Pennsylvania Forskning Instrumentering Shop for deres hjelp i arbeidet med vår rettende refleks apparat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Oxygen | Airgas | OX300 | |
| Isoflurane | Butler Schein | Any volatile anesthetic of interest may be substituted | |
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mass flow meter- 10 SLPM | Omega Engineering | FMA-A2309 | |
| Mass flow meter- 500 SCCM | Omega Engineering | FMA-A2305 | |
| Anesthetic agent analyzer/gas indicator | AM Bickford | FI-21 Riken | |
| Heating water pump | Fisher Scientific | 13-874-175 | |
| Temperature transponders | BMDS | IPTT-300 | |
| RF temperature reader | BMDS | DAS-6007 |
References
- Meyer, H. H. Zur theorie der alkoholnarkose. I. Mittheilung. Welche Eigenschaft der An#228;sthetica bedingt ihre narkotische Wirkung? Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42, 109-137 Forthcoming.
- Overton, C. E. Studien über die Narkose: Zugleich ein Beitrag zur allgemeinen Pharmakologie. , Fischer. Jena. (1901).
- Bignall, K. E. Ontogeny of levels of neural organization: the righting reflex as a model. Exp. Neurol. 3 (3), 566-573 (1974).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat. Rev. Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab. Anim. 27 (1), 30-39 (1993).
- Schernthaner, A., Lendl, C., Busch, R., Henke, J. Clinical evaluation of three medetomidine--midazolam--ketamine combinations for neutering of ferrets (Mustela putorius furo)]. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift. 121 (1-2), 1-10 (2008).
- Mohammad, F. K., Zangana, I. K., Abdul-Latif, A. R.
- Nicholls, E. A., Louie, G. L., Prokocimer, P. G., Maze, M. Halothane anesthetic requirements are not affected by aminophylline treatment in rats and dogs. Anesthesiology. 65 (6), 637-641 (1986).
- Tung, A., Szafran, M. J., Bluhm, B., Mendelson, W. B. Sleep Deprivation Potentiates the Onset and Duration of Loss of Righting Reflex Induced by Propofol and Isoflurane. Anesthesiology. 97 (4), 906-911 (2002).
- Pal, D., et al. Determination of Minimum Alveolar Concentration for Isoflurane and Sevoflurane in a Rodent Model of Human Metabolic Syndrome. Anesth. 2 (2), 297-302 (2012).
- Eger, E. I., Saidman 2nd,, J, L., Brandstater, B. Temperature dependence of halothane and cyclopropane anesthesia in dogs: correlation with some theories of anesthetic action. Anesthesiology. 26 (6), 764-770 (1965).
- Vitez, T. S., White, P. F., Eger, E. I. 2nd Effects of hypothermia on halothane MAC and isoflurane MAC in the rat. Anesthesiology. 41 (1), 80-81 (1974).
- Antognini, J. F. Hypothermia eliminates isoflurane requirements at 20 degrees C. Anesthesiology. 78 (6), 1152-1156 (1993).
- McKenzie, J. D., et al. Effects of temperature on the anaesthetic potency of halothane, enflurane and ethanol in Daphnia magna (Cladocera: Crustacea). Comp. Biochem. Physiol. C. 101 (1), 15-19 (1992).
- Icaza, E. E., et al. Isoflurane-Induced Changes in Righting Response and Breathing are Modulated by RGS Proteins. Anesth. Analg. 109 (5), 1500-1505 (2009).
- Drexler, B., Antkowiak, B., Engin, E., Rudolph, U. Identification and characterization of anesthetic targets by mouse molecular genetics approaches. Can. 2 (2), 178-190 (2011).
- Wafford, K. A., et al. Differentiating the role of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor subtypes. Biochem. 32 (Pt3), 553-556 (2004).
- Lakhlani, P. P., et al. Substitution of a mutant α2a-adrenergic receptor via "hit and run" gene targeting reveals the role of this subtype in sedative, analgesic, and anesthetic-sparing responses in. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (18), 9950-9955 (1997).
- Sonner, J. M., Gong, D., Eger, E. I. Naturally Occurring Variability in Anesthetic Potency Among Inbred Mouse Strains. Anesth. 91 (3), 720-726 (2000).
- Sun, Y., et al. High throughput modular chambers for rapid evaluation of anesthetic sensitivity. BMC Anesthesiol. 6 (1), 13 (2006).
- Hu, F. Y., et al. Hypnotic Hypersensitivity to Volatile Anesthetics and Dexmedetomidine in Dopamine β-Hydroxylase Knockout Mice. Anesthesiology. , (2012).
- Kelz, M. B., et al. An essential role for orexins in emergence from general anesthesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (4), 1309-1314 (2008).
- Moore, J. T., et al. Direct Activation of Sleep-Promoting VLPO Neurons by Volatile Anesthetics Contributes to Anesthetic Hypnosis. Curr. 22 (21), 2008-2016 (2012).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079 (2012).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (67), e2771 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Szymusiak, R., Alam, N., Steininger, T. L., McGinty, D. Sleep-waking discharge patterns of ventrolateral preoptic/anterior hypothalamic neurons in rats. Brain Res. (1-2), 178-188 (1998).
- Nelson, L. E., et al. The sedative component of anesthesia is mediated by GABAA receptors in an endogenous sleep pathway. Nat. Neurosci. 5 (10), 979-984 (2002).
- Li, K. Y., Guan, Y., Krnjević, K., Ye, J. H. Propofol Facilitates Glutamatergic Transmission to Neurons of the Ventrolateral Preoptic Nucleus. Anesthesiology. 111 (6), 1271-1278 (2009).
- Friedman, E. B., et al. A Conserved Behavioral State Barrier Impedes Transitions between Anesthetic-Induced Unconsciousness and Wakefulness: Evidence for Neural Inertia. PLoS ONE. 5 (7), e11903 (2010).
- Lu, J., Greco, M. A., Shiromani, P., Saper, C. B. Effect of lesions of the ventrolateral preoptic nucleus on NREM and REM sleep. J. Neurosci. 20 (10), 3830-3842 (2000).
- Sun, X., Whitefield, S., Rusak, B., Semba, K. Electrophysiological analysis of suprachiasmatic nucleus projections to the ventrolateral preoptic area in the rat. Eur. J. Neurosci. 14 (8), 1257-1274 (2001).
- Ma, J., Shen, B., Stewart, L. S., Herrick, I. A., Leung, L. S. The septohippocampal system participates in general anesthesia. J. Neurosci. 22 (2), RC200 (2002).
- Leung, L. S., Ma, J., Shen, B., Nachim, I., Luo, T. Medial septal lesion enhances general anesthesia response. Exp. Neurol. , (2013).
- Solt, K., et al. Methylphenidate Actively Induces Emergence from General Anesthesia. Anesthesiology. 115 (4), 791-803 (2011).
