En helautomatisk Rodent Conditioning Protokoll for sensorimotoriske Integrasjon og kognitiv kontroll eksperimenter

Summary

En helautomatisk protokoll for gnager operant betinging er foreslått. Protokollen er avhengig av presis tidsmessig kontroll av atferdsmessige hendelser for å undersøke i hvilken grad denne kontroll påvirkninger nevrale aktiviteten underliggende sensorimotorisk integrasjon og kognitiv kontroll eksperimenter.

Abstract

Gnagere har tradisjonelt blitt brukt som en standard dyremodell i laboratorieeksperimenter som involverer en myriade av sensoriske, kognitive og motoriske aktiviteter. Høyere kognitive funksjoner som krever presis kontroll over motoriske responser som beslutnings-og oppmerksomhetsmodulering, men er vanligvis vurdert i ikke-menneskelige primater. Til tross for rikdommen i primat atferd som gjør at flere varianter av disse funksjonene til å bli studert, forblir gnager modellen et attraktivt og kostnadseffektivt alternativ til primate modeller. Videre evnen til fullt automat operant betinging hos gnagere legger unike fordeler over arbeidsintensiv trening av ikke-menneskelige primater mens han studerte et bredt spekter av disse komplekse funksjoner.

Her introduserer vi en protokoll for operantly condition rotter på å utføre arbeidsminneoppgaver. Under kritiske epoker av oppgaven, sikrer protokollen som dyrets overt bevegelsen er minimert ved requIRING dyret til 'Fiksér' inntil en Go cue er levert, beslektet med ikke-menneskelige primater eksperimentell design. En enkel to alternative tvunget valg oppgave er gjennomført for å demonstrere ytelsen. Vi diskuterer anvendelsen av dette paradigmet til andre oppgaver.

Introduction

Studerer forholdet mellom nevrofysiologi og adferd er det endelige målet i systemer nevrovitenskap. Historisk har det vært en avveining mellom dyremodell valg og atferdsmessige repertoar ^1-5. Mens enkle organismer som sjøsnegler ⁶ eller blekksprut ⁷ har blitt brukt mye til å studere egenskapene til enkelt ionekanaler, nevroner og enkle nevrale kretser, er høyere ordre arter som trengs for å studere mer komplekse funksjoner som romlig navigasjon, beslutnings ^8-11 og kognitiv kontrollere ^12-14. Til tross for at en standard dyremodell for human lignende oppførsel, bruk av ikke-menneskelige primater ber kostnads-og etiske betraktninger som utelukker deres bruk i en lang rekke eksperimenter i et enkelt laboratorie innstilling ^15-18. Enklere dyremodeller for eksempel gnagere er generelt foretrukket ^19, forutsatt at de har lignende nevrale substrater underliggende atferd av interesse.

"> Det er rikelig med bevis som tyder på at gnagere dele lignende kortikale og subkortikale strukturer som de som finnes hos primater ^20-22. Gnagere er også kjent for å integrere informasjon på tvers av flere sensoriske modaliteter å veilede sine handlinger ^23-25, for eksempel ved å koordinere visping og sniffing under utforskende atferd ²⁶ eller ved å integrere auditive og visuelle / lukte hendelser ^25,27.

Her beskriver vi et rammeverk for operant betinging av gnagere som brukes til å teste kognitive oppgaver ^28-32. I denne rammen, er fagene som kreves for å fiksere inne i en nosepoke hull og opprettholde sin snute inni hullet til presentasjonen av en go kø. Den atferds oppgave er en fem-hulls nosepoke utforming som er konvensjonelt brukt for 5-choice serie reaksjonstid aktivitetsstudier. Under forsinkelsesperioden, er en rekke instruksjon signaler present å veilede faget til å utføre en handling. Dette rammeverket kan enkelt endres for å passeen lang rekke eksperimenter der trening faget for å minimalisere dens overt bevegelse over et kort intervall som er nødvendig. Dette gjør det mulig å studere hvorvidt spiking aktivitet av individuelle nevroner påvirkes av bestemte signaler i løpet av dette intervallet. Protokollen kan redusere opplæringstid og kan redusere over-faget læring variabilitet. Et skjematisk flytdiagram av oppgaven er vist i figur 1..

Protocol

Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av Michigan State University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).

En. Forsøksoppsett

1. Bruk en operant kondisjone boks som består av en fem-hullet nosepoke vegg på den ene side og en mat levering trau på den motsatte side.
   1. Senteret nosepoke hullet anses som en "fiksering" hull, og de fire andre hull (to på hver side av festehullet) betraktes motor target hull. Hvert hull er utstyrt med en trefarget LED og en infrarød stråle emitter-detektorsystem som detekterer når dyret kommer inn i og trekker seg tilbake fra festehullet.
   2. Bruk en programmerbar tone generator for å generere én frekvens, toner med millisekund presisjon og koble den til en høyttaler montert inne i operant boksen. Kontrollere tonegenerator og nosepokes gjennom atferds system for sporing ved hjelp av den aktuelle programvaren. Bruk en hardware og prog.vareer system som gir millisekund tidsskala overvåking av atferds hendelser og kontroll av signaler og reaksjoner.
      Merk: Størrelsen til både tone og støy signaler bør holdes rundt 60 ± 3 dB SPL.

2. Tidlig Tilvenning

1. Begrense motivets matinntak gradvis til ~ 5 g per 100 g av fagets normal vekt (f. eks i løpet av 3 dager). Faget bør opprettholde 85-90% av deres ad libitum vekt.
2. Tilvenne faget til håndtering av eksperimentator og lest emnet med apparatet fra den første dagen med å starte maten deprivasjon protokollen. Begynne å håndtere dyret og legg den i operant betinging boksen samtidig som det gir mat pellets i pellets trau å oppmuntre faget å utforske buret og bli kjent med belønning leveringssted.

Tre. Subject Training

1. Generelle notater
   1. Oppgaven foreslått her trenger presis koordinering mellom oppfatningen av en auditiv cue, minimere bevegelser under forsinkelsesperioden og bevegelse utførelse.
   2. Trene gradvis emnet steg-for-steg for å forberede dem for den endelige ønsket atferd.
   3. Sørg for at det ved utgangen av hvert trinn, vedlikeholder faget> 75% atferds ytelse for minst tre påfølgende økter før du går videre til neste trinn.
   4. Når den siste fasen er nådd, holder emnet på protokollen for en uke for å sikre at ytelsen blir opprettholdt på det ønskede nivå.
2. Start: Gjør emnet med nosepoke hull, matlevering port og sammenhengen mellom de blinkende hull og belønning.
   1. Velger en av de fire målene i et vilkårlig plan.
   2. Spill Go cue (en hvit auditiv støy) og holde LED inni hullet blinkende (0,3 sek puls varighet).
   3. Sett software å belønne faget på besøk til hullet.
   4. Time-out rettssaken etter 30 sekunder hvis hullet ikke er besøkt og starte en ny rettssak.
   5. Ikke belønne eventuelle besøk til de uriktige hull.
3. Target Utvalg: Straffe feilaktige besøk til nonselected hull.
   1. Ved besøk på feil hull, avslutte rettssaken etterfulgt av 5 sek av black-out.
      Merk: Under en black-out epoke, er festehullet LED slått av i buret. Dette betyr at faget ikke kan sette i gang en rettssak og må vente til fiksering hullet LED begynner å blinke.
   2. Velg et nytt hull og starte en ny rettssak.
4. Nosepoke: Tren faget å rote inne i fiksering hullet for å starte en rettssak.
   1. Blinke en gul LED inne i fiksering hullet.
   2. Når du besøker fiksering hullet med en gang spille Go kø og starte en ny rettssak.
   3. Straffe uriktige besøk etter 5 sek; Av black-out.
5. Forsinkelse: Lær faget for å opprettholde sin nesen inne i fiksering hull for en angitt tidsperiode (forsinkelsesperiode) som er økt gradvis som treningen skrider fram.
   1. Vent til under besøke fiksering hullet.
   2. Avslutte rettssaken om faget trekkes innen 500 msek. Ellers spille Go stikkordet.
   3. Straffe premature inndragninger av en black-out periode for 7 sek.
   4. Belønne de riktige besøkene ved å levere en mat pellet.
6. To Stikkordene (med lys): Øke og randomisere forsinkelsesperioden lengde og innføre hørsels instruksjon stikkordet.
   1. Øke lengden av forsinkelsesperioden til et gjennomsnitt på 1,5 sek.
   2. Velg tilfeldig forsinkelsesperiode lengde ved hvert forsøk basert på en jevn tetthet mellom 1,3 til 1,8 sek.
   3. Introduser instruksjon cue som en enkel frekvens hørbar tone Pulsed i trillinger, med en pulsvarighet på 150 msek oginterpulse intervall på 100 ms.
      1. Spill instruksjon cue umiddelbart etter at objektet kommer inn i festehullet.
      2. Tildele to instruksjon signaler til hvert av målene.
      3. Bruk bare én cue forbundet for hvert mål på dette stadiet.
   4. La motivet bruke både auditive og visuelle signaler for å velge målet hullet.
7. To Stikkordene (uten lys): Tog faget å bare bruke auditive signaler.
   1. Slå av de blinkende lysdioder inne i målet hullene slik at motivet ville bare bruke auditive instruksjon signaler.
8. Fire køer: Introduser de to andre signaler til sekvensen av tilfeldig present instruksjon signaler og gjenta avsnittene 3.5.3-3.6.1.

4. Behavioral Data Analysis

1. Suksess Rate: Definer suksessrate som prosentandelen av riktige besøk til målene dividert med det totale antall forsøk.
2. Feiltyper:
   1. For tidlig tilbaketrekking: måle prosentandelen av prøvelser for lang tid på grunn av tidlig retractions fra festehullet.
   2. Utsmykning error: Beregn prosentandelen av mislykkede forsøk når motivet besøker en uninstructed mål
   3. Utelatelse Feil: Beregn feilprosenten når motivet ikke besøke noen av målene etter prøvestart.
3. Målte variabler:
   1. Reaction Time (RT): For hver studie måle forsinkelsen mellom utbruddet av Go cue og faget tilbaketrekkings fra festehullet.
   2. Tid til Target (TT): Mål varigheten mellom subjektet tilbaketrekking fra festehullet og inn i målet hullet.

Representative Results

Den foreslåtte rammeverket gjør det mulig å trene motivet på en rekke kognitive oppgaver. Her har vi implementert en instruert forsinkelse oppgave designet for å undersøke mekanismene for målrettede handlinger i gnager prefrontal cortex. Figur 1 viser et flytdiagram av den eksperimentelle design.

For å sikre at faget forstår oppgaven kravet på alle trinn, bør arbeidsmål bli fortløpende vurdert. Figur 2 viser et eksempel ytelsen til ett fag på tvers av flere økter. Når emnet ervervet oppgaven ble det implantert med et 32 ​​kanals microelectrode matrisen i prelimbic område (svarende til den mediale prefrontale cortex). Multiunit aktivitet og lokale feltpotensialer (LFPs) ble registrert. Enkelt nevron pigg tog ble isolert ved hjelp av standard pigg sortering teknikker ³³ og hendelser knyttet til ulike epoker av oppgaven ble merket. Figurene 3 og <strong> 4 viser noen eksempler på resultater av selektive flere enkelt enhet modulasjoner i kritiske epoker av oppgaven.

Figur 1. Flytskjema av en prøve rettssaken som viser rekkefølgen av handlinger og hendelser i løpet av en prøveperiode. Faget selv starter en rettssak ved poking nesen inne i fiksering hullet. Kort etter at nosepoke, er en instruksjon cue (en enkel frekvens tone) spilte etterfulgt av en forsinkelsesperiode. Emnet er nødvendig for å opprettholde nese inne i festehullet før presentasjonen av Go signalet. Enhver tidlig tilbaketrekking vil føre rettssaken for å bli avbrutt og motivet blir straffet med en time-out. Etter en forsinkelse av tilfeldig lengde, er en Go Cue (auditiv hvit støy) presentert og motivet er fri til å bevege towards den instruerte målet. Vellykkede forsøk blir belønnet med en 45 mg mat pellet mens mislykkede forsøk er tidsbestemt ut for 15 sek. Klikk her for å se større bilde .

Figur 2. Behavioral ytelse score målt over flere økter. (A) Suksessraten er definert som forholdet mellom antall vellykkede forsøk til totalt antall forsøk i hver økt. Resultatene er vist for en fullt utdannet lagt over 14 innspillinger. (B) Fordeling av feiltyper. Tidlig tilbaketrekking skjer med tidlig tilbaketrekking før Go stikkordet. Kommisjonen feil er definert som besøker noen annen enn den som ble instruert og t måletHan oppstår unnlatelse feil når motivet ikke nå for noen mål i løpet av fem sekunder fra Gå Cue. (C) Et histogram av reaksjonstiden - perioden mellom utbruddet av Go kø og fagets bryte ut fiksering hullet strålen - som viser fordelingen av reaksjonstiden på tvers av ulike studier. (D) Et histogram av tid til å målrette - perioden mellom å bryte ut av fiksering hullet og bryte i målet hullet -. Viser fordelingen av tid til å målrette tvers av ulike studier Klikk her for å se større bilde .

Figur 3. Nevrofysiologi data fra et utvalg rettssaken. Etter emnet mestret than oppgave og opprettholdt et høyt prestasjonsnivå i minst en uke, ble det implantert med en 32 kanal microelectrode matrisen i prelimbic område av medial prefrontal cortex (mPFC) og multippel enkelt enhet aktivitet ble registrert sammen med lokale feltpotensialer. En prøve spor av LFP variasjon sammen med en raster tomt på 22 samtidig registrerte enheter (hver rad er en enhet og hver prikk representerer en pigg) er vist. Markører for atferds hendelser er også tegnet inn på toppen av sporene. Disse sporene viser høy prediksjon makt motor intensjon etter Go cue (analyse ikke vist her). Klikk her for å se større bilde .

Sensorisk Cue	Spatial Target Sted
1 KHz	Høyre
2 KHz	Høyre
4 KHz	Venstre
8 KHz

Tabell 1. Instruction cue oppdrag. Tabellen viser den tilsvarende motor målet tildelt hver instruksjon cue.

Sensorisk Cue	Spatial Target Sted
1 KHz	Høyre
2 KHz	Høyre
4 KHz	Venstre
8 KHz	Venstre

Tabell 2. Training tid tabellen. Tabellen viser lengden på treningsøkten brukt for hvert fag (2 treningsøkt / dag) for voksne kvinnelige Sprague-Dawley rotter (3-4 måneder gammel).

Protokoll	A24	A25	A26	A28	A29	Gjennomsnittlig
Start	4	2	4	4	4	3.6
TargetSelection	3	5	5	4	4	4.2
Nosepoke	8	7	9	5	2	6.2
Forsinkelse	8	8	5	4	3	5.6
To Stikkordene (med lys)	5	4	5	5	2	4.2
To Stikkordene (uten lys)	10	7	9	11	17	10.8
Fire køer	13	12	14	18	11	13.6
	51	45	51	51	43	48,2

Discussion

Rotter har vært mye brukt i nevrovitenskapelig forskning i over et århundre. Siden Thorndike introduksjon av begrepet loven om effekt hos katter ^34, har operant betinging vært standardmetoden for å teste ulike aspekter av dyrs atferd. Mange nevrovitenskap forsøk med beslutningsprosesser og motor forberedelse inkluderer en forsinkelsesperiode mellom instruksjons signaler og handlingen intervall. Det er ønskelig å minimere bevegelser under disse forsinkelsesperiodene for å redusere eventuelle confounds til de neurale data blir overtatt. Mens konvensjonelle labyrint navigasjons eksperimenter i gnagere kapitalisere på gnagere 'stor kapasitet til å samle mat, de er begrenset av bevegelsene at dyret utfører og kan derfor ikke brukes til å teste mer komplekse spørsmål som beslutningstaking og motor planlegging. Mens labyrint oppgaver er enkle å implementere som subjekter lære å navigere raskt, er utilslørt adferd ubegrenset under alle faser av oppgaven (f.eks

Her beskrev vi et fleksibelt rammeverk inspirert av visuell oppmerksomhet hos gnagere. De representative resultatene vi følger demonstrere at dyr kan lære oppgaven, selv når flere sensoriske signaler er forbundet med en enkelt motor mål. Denne utformingen er valgt for å teste evnen til arbeidshukommelsen som brukes til å styre motorens virkemåte. Den mest kritiske trinn i protokollen er å trene emnet for å opprettholde sin nese inne i festehullet for hele varigheten av forsinkelsesperioden.

Fordi frontal områdene er gjensidig forbundet med mange kortikale og subkortikale områder, presis timing av de atferdsmessige hendelser og synkronisere timingen av disse hendelsene til de oppkjøpte nevrale data kan lindre risikoen for potensielle confounds. Computer-automatisert registrering av atferds arrangementer (som nosepoke eller cue trigger) kan oppstå med millisekund presisjon. Video sporing av faget movement kan også utføres, og dataene kan synkroniseres med atferds arrangementer for å gi presis sammenheng mellom nevral aktivitet og atferd.

Mer komplekse kognitive evner av gnagere kan studeres ved hjelp av dette paradigmet. For eksempel har vi brukt den til å implementere en gnager versjon av den forsinkede kamp-til-sample oppgave med en auditiv sansemodalitet snarere enn romlig navigasjon. Faget ble spolt med en prøve auditiv cue etterfulgt av en matchende kø og måtte bestemme geografiske målområder basert på matchende avgjørelse.

Feilsøking:

Gjennomføringen av den eksperimentelle design er veldig grei å bruke et dataprogram, og fagene skal være i stand til å mestre oppgaven i løpet av ca 25-30 treningsøkter. Avvik fra denne planen kan være på grunn av manglende motivasjon, eller forvirring som kan være forårsaket av:

1. Unøyaktig auditiv tone frekvens: Designen er sterkt avhengigent på banen av instruert kø. Den experimenter skal kontrollere både frekvensen til audioutgangen og amplituden av tonen.
2. Mat levering: Ofte når motivet ikke er motivert til å utføre oppgaven, mat levering systemet bør sjekkes for eventuelle feil som kan ha koblet ut belønningen leveringssystem.

For å oppsummere, har teknologiske fremskritt i opptak og stimulering av store ensembler aktivert måling og avlesning av nevrale kretser underliggende handlingen forberedelse og gjennomføring med millisekund presisjon. Gnagere er blant de beste kandidatene på tvers av forskjellige dyrearter som skal brukes til slik forskning gitt deres evne til å utføre kognitive oppgaver og tilgjengeligheten av teknikker som er skreddersydd til gnagere. Protokollen er beskrevet i denne artikkelen kan bidra til å utforme eksperimenter for å svare på konkrete spørsmål om de kognitive aspekter av handling forberedelse og gjennomføring.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-holed Nose Poke with 3 Stim Cue Light Rat Cage	Coulbourn	H21-06M/R
Test cage	Coulbourn	H10-11R-TC
Graphic State Software	Coulbourn
Programmable tone/noise generator	Coulbourn	A12-33
Dustless precision pellets	Bio-Serv	F0165
Speaker module	Coulbourn	H12-01R