Summary
En bröstcancer metastaser i hjärnan musmodell etableras med ultraljud-guidad intrakardiell injektion av MDA-MB231/Br-GFP celler. Utveckling av multifokala intrakraniella metastaser har övervakats i längdled med hjälp av högupplösande 9,4 T MRI.
Abstract
Bröstcancer metastaser i hjärnan, förekommer hos 30% av patienter med bröstcancer i stadium IV, är förknippad med hög dödlighet. Medianöverlevnaden är bara 6 månader. Det är kritiskt att ha lämpliga djurmodeller för att efterlikna den hemodynamiska spridningen av metastatiska celler i den kliniska scenariot. Här introducerar vi användning av små djur ultraljud för att styra en riktig injektion av hjärn tropiska bröstcancerceller i vänster kammare av atymiska nakna möss. Längsgående MRI används för att bedöma intrakraniell initiering och tillväxt av hjärnmetastaser. Ultraljud-styrd intrakardiell injektion ger inte bara en korrekt injektion och härmed en högre framgångsrik avgift utan också minskat markant dödlighet, jämfört med vår tidigare manuell procedur. In vivo hög upplösning MRI möjliggör visualisering av hyper multifokala lesioner, så små som 310 nm i diameter på T 2-viktade bilder vid tre veckor efter injektion. Follow-up MRT avslöjar intrakraniell tumörtillväxt och ökat antal metastaser som distribuerar i hela hjärnan.
Introduction
Metastaser i hjärnan är den vanligaste intrakraniell malignitet hos vuxna. Prognosen är mycket dålig, med en medianöverlevnad på 4-6 månader till och med aggressiv behandling. Bröstcancer är en av de tre stora primära cancer med hög sjuklighet av hjärnmetastaser 1-3. Flera brain-tropism bröstcancerlinjer kan utveckla hjärnmetastaser efter intrakardiell eller intracarotid injektion 4. Direkt injektion av tumörceller in i den vänstra ventrikeln kan kringgå lungan kapillärbädden och sålunda öka incidensen av formnings hjärnmetastases samtidigt minimera viscerala metastaser. MDA-MB231Br linjen är en av de mest använda humana bröstcancerlinjer för att utveckla metastaser i hjärnan i gnagarmodeller 5,6.
Liksom många andra studier 4,7, har vi utfört en manuell procedur för intrakardiell injektion i våra tidigare studier. Dock endast 50% framgångsrik som erhålls med den manuellainjektion och en bråkdel av mössen dog av de upprepade ingrepp om tidigare försök misslyckats. Här introducerar vi användning av ett förfarande imaging-guidad att säkra injektion av hjärnsökande bröstcancerceller i vänster kammare i atymiska möss. Längsgående hög upplösning MRI används för att följa intrakraniell utvecklingen av hjärnmetastaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla animaliska förfaranden godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén av University of Texas Southwestern Medical Center.
1. Beredning av MDA-MB231/Br-GFP Cells
- Hämta och odla MDA-MB231/Br-GFP celler (vänligen tillhandahållen av Drs. Palmieri och Steeg, NCI) i DMEM-medium innehållande 10% FBS, 1% glutamin och 1% penicillin / streptomycin.
- Beakta tillståndet hos cellerna och färgen av medium, och byt medium var 2-3 dagar.
- Trypsinisera och samla cellerna vid 80% sammanflödet uppnås enligt beskrivningen i steg 1.3.1-1.3.5:
- Ta bort det gamla mediet helt och tillsätt 5 ml PBS (1x) att tvätta cellerna försiktigt. Ta bort PBS från skålen.
- Lägg till 1,5 ml trypsin i skålen, luta skålen försiktigt så att alla celler är täckta av trypsin. Sätt skålen tillbaka till cellen inkubatorn och hålla den vid 37 ° C i 1 min.
- Ta skålen ut ur inkubatorn och observeracellerna under optiskt mikroskop för att säkerställa att cellerna lossnar från skålen.
- Lägg 3 ml medium för att stoppa verkan av trypsin. Samla cellblandningen i ett centrifugrör. Centrifugera blandningen vid 2000 rpm under 5 min.
- Avlägsna mediet försiktigt och återsuspendera cellerna i 5 ml serumfritt medium till homogenitet.
- Räkna lämpligt antal celler och återsuspendera dem i serumfritt DMEM-medium med en slutkoncentration av 1,75 x 10 5 celler i 100 | il volym.
- Ta 50 | il cellblandningen och tillsätt 50 | il trypanblått. Efter blandning ta 10 | il blandning och tillsätt försiktigt till cellräkning slide. Använd flera prover för att säkerställa korrekt cell nummer uppskattning.
- Stick i cellräkning slide, en ände vid en tidpunkt och den cellräknare börjar räkna automatiskt. Ta medelvärdet av alla räkneresultat och beräkna det totala cellantalet.
- Centrifugera cellerna igen och återsuspendera dem ilämplig volym av serumfritt medium för att leda till den slutliga koncentrationen av 1,75 x 10 5 celler/100 pl volym.
- Placera celler på is före intrakardiell injektion.
2. Ultrasound Imaging-guidad Intrakardiell Injection
- Använd kvinnliga nakna möss (BALB / c nu / nu) mellan 6-8 veckor gamla.
- Logga in avbildningssystemet. Initiera givaren 704 (40 MHz).
- Starta en ny studie och fyll i uppgifterna.
- Bedöva (3% isoflurane/100% O 2 i en induktionskammare) och bibehålla djuren med isofluran (2%) i 100% O2 (1 dm 3 / min) under hela förfarandet via en noskon. Anestesi bekräftas när ingen tillbakadragande reflex observeras med tå nypa.
- Ställ in temperaturen på avbildningsbordet till 37 ° C. Tape sövd mus till den uppvärmda avbildningsbordet i ryggläge.
- Håll ultraljud gel vid 37 ° C före imåldrande. Applicera gelen till bröstet på musen.
- Montera givaren i hållaren. Sänk givaren tills den önskade avbildningsdjupet uppnås. Flytta bordet tills den vänstra ventrikeln är identifierad med aorta ascendens som landmärket (Figur 1A). Lås det skede när en klar vy av vänstra ventrikeln visualiseras.
- Draw 100 pl av cellblandningen in i en 1 ml spruta med en 22 G nål. Placera och fäst sprutan på sprutan fästet.
- Flytta sprutan framåt mot musen bröstet och försiktigt flytta den från sida till sida tills nålspetsen är i avbildning synfält (innan musen).
- Justera nålen höjd och vinkel för att sikta ned den vänstra ventrikeln.
- Penetrera injektionsnålen i Intercoastal utrymme snarast via hud-och muskelskikten i vänster kammare under ledning av ultraljud.
En indikation på lyckad insättning av nålen i vänstra ventrikel är återflöde av färskt arteriellt blod (rosa färg i motsats till mörkröd venblod) i sprutan - Injicera cellblandningen långsamt (Figur 1B).
- Efter avslutad, dra ut nålen, lyft upp givaren, rengör ultraljudsgel med fuktad gasväv och ta bort tejpen.
- Förbered en ren bur med en förvärmd pad.
- Placera djuret på plattan och observera djuret tills fullständig återhämtning.
- Övervaka beteende hos djuret varje 24 h under två dagar.
- Allmänna villkor och neurologiska tecken på komplikationer i experimentella möss rutinmässigt övervakas.
3. MRI Övervakning av Intrakraniell tumörutveckling
- Använd en 9,4 Tesla magnet för att övervaka intrakraniell utvecklingen av hjärnmetastaser.
- Initiera MRI två veckor efter tumörimplantation och upprepa en gång i veckan i upp till tre veckor.
- Söva djuren med 3% isofluran och underhålla dem under genral anestesi (1,5% isofluran).
- Övervaka och underhålla djurkroppstemperatur och andning konstant under hela experimentet.
- Högupplöst multislice (14 skivor med 1 mm tjock, inget gap) T 1 - och T 2-viktade frontala bilder, som täcker området från pannloben till den bakre fossa, förvärvas med följande parametrar: T 1-viktade bilder: spin eko multipel slice (SEMS), TR / TE = 400 msec/20 msek, matris: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, i planet upplösning: 78 x 78 ìm 2. T 2-viktade bilder: snabb spin eko flera segment (FSEMS) sekvenser, TR / TE = 2500 msec/48 ms, 8 eko tåg, matris: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, i planet upplösning: 78 x 78 ìm 28,9.
Tumörlesioner ljusare än normal hjärnvävnad på T 2-viktade bilder. - Tumörstorleken bestäms på T 2-viktade bilder genom att manuellt beskriver enhansiering del av massan på varje bild med hjälp av MATLAB program skrivna av oss 8.
Eftersom det mesta av tumören diametrar är mindre än den snittjocklek (1 mm), är tumörstorleken presenteras som i plan yta snarare än volymen.
4. H & E färgning Bekräfta Metastaser
- Offra mössen omedelbart efter sista MR skanning, dissekera tumörbärande hjärnor och bädda in den i oktober medium och fryst i -80 ° C.
- Avsnitt en serie av 10 | im tjocka koronala hjärnan prover med kryostat.
- Utför H & E färgning på hjärnan sektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hög rumslig upplösning av MRI (78 um i planet upplösning) kan lesioner identifieras så små som 310 nm i diameter (figur 2). Eftersom metastaser i denna studie är mycket små och utvecklingen av nekros och ödem är minimal, det hyper lesion på T 2-viktade bilderna representeras verkligen tumörmassan.
MRI-studier Longitudinella tillåter in vivo icke-invasiv bedömning av tumörtillväxt. Såsom visas i figur 3, den höga upplösningen MRI kunde upptäcka flera små lesioner tre veckor efter intrakardiell injektion (figur 3A). Vid vecka 4, lesioner som sågs i den föregående skann allt blev större, fler nya skador dök upp på T 2-viktade bilder (Figur 3B).
H & E färgning avslöjade antingen diffus eller kluster typ metastaser (Figur 4).Förstorade fartyg ofta ses runt tumören, vilket indikerar nonsprouting angiogenes (Figur 4D).
Figur 1. Ultraljud-styrd intrakardiellt injektion. (A) Identifiering av aorta ascendens (pilen) som landmärke i vänster kammare i musen hjärta. (B) En nål (pil) insättning i vänster kammare att injicera tumörcellerna. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Högupplöst T2-viktade bilder av bröstcancerhjärnmetastaser. Fjorton MRI skivor i följd av en representativ mus hjärna, förvärvat fyra veckor efter intrakardiell injektion, visade tydligt de multifokala metastaser distribuera genom hela musen hjärnan, från luktloben till Pontine och medulla. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Längsgående MRI av utvecklingen av hjärnmetastaser. A. Sex på varandra följande koronala MRI sektioner vid vecka 3 identifierat flera lesioner med hyper-intensitet på T 2-viktade bilder. B. Ett ökat antal lesions syntes på bilderna vid vecka 4, och dessa lesioner ses på vecka 3 blev större. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Mikroskopiska lesioner observerades på H & E färgning A.. En hel montera coronal avsnitt skildras flera lesioner. BD. Högre förstoring bilder visade en diffus eller kluster typ lesioner (B och C). Förstorade kärl sågs runt tumören. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I föreliggande studie har vi visat att ultraljud-styrda vänsterkammar injektion säkerställer riktigheten så att varje djur i denna studie utvecklade hjärnmetastaser och inga djur död observerades. Det fina med bildstyrd insprutning är att vägen av nål penetration av hud och slutligen in i vänster kammare kan övervakas och justeras i enlighet med bilden, som skiljer sig från det manuella förfarandet kräva strikta anatomiska landmärken att följa.
Aktuella förståelser av intrakraniell utvecklingen av hjärnmetastaser är till stor del baserade på histologiska studier på djurmodeller 4,10. Emellertid histologiska studier kräver normalt ett stort antal möss som avlivas vid olika tidpunkter efter tumörimplantation. Ännu viktigare är information om tidsutvecklingen i enskilda lesioner saknas från histologiska studier.
In vivo imaging lovar större eVerkningsgrad eftersom varje djur tjänar som sin egen kontroll och flera tidpunkter kan undersökas sekventiellt 7,11. Högupplösta T 2-viktade bilder gör det möjligt att upptäcka multifokal tumör initiering i mycket tidigt skede (lesioner med en diameter så liten som 310 nm är synliga). Längsgående MRI möjliggör individuella hjärnmetastaser som skall undersökas med tiden. Dessutom kommer in vivo icke-invasiv MRT vara särskilt värdefullt i longitudinell studie av terapeutisk respons, t.ex. hela hjärnan strålning.
Bildning av multifokala hjärnmetastaser är egenskaperna hos MDA-MB231Br modell. Förutom MDA-MB231/Br-GFP cellinje vi visade i denna studie, föräldra klon MDA-MB231/Br och MDA-MB231/Br-luc uppvisar även liknande metastaser. Däremot har flera andra hjärnsökande linjer såsom MCF-7BR och 4T1 visats utveckla en solitär metastas efter intrakardiell injektion 12. Båda demodeller, spegling kliniska motsvarigheter, är användbara djurmodeller av metastaser i hjärnan. Men förutom att hjärnmetastaser, viscerala metastaser, såsom lung-och skelettmetastaser observeras ofta i denna modell. Inrättande av djurmodeller som utvecklar hjärnmetastaser enbart kommer att vara avgörande, särskilt för utvärdering av behandlingssvar.
Sammanfattningsvis har vi visat på nyttan av imaging-guidad intrakardiell injektion för att etablera en hjärnmetastaser musmodell och hög upplösning MRI för att bedöma intrakraniell utvecklingen av multifokala metastaser i en musmodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till Dr. Diane Palmieri och Patricia Steeg av NCI för att ge oss MDA-MB231Br celler. Vi tackar Dr Ralph Mason, Mr Jason Reneau och Ms Ramona Lopes för tekniskt och kollegialt stöd. Detta arbete stöddes delvis av DOD IDEA Awards W81XWH-08-1-0583 och W81XWH-12-1 till 0317. MRI experiment utfördes i Advanced Imaging Research Center, en NIH BTRP # P41-RR02584 anläggning och ultraljud-styrda intrakardiell injektion utfördes med VisualSonics Vevo 770 i 1S10RR02564801.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-051-C1 | |
| Automatic cell counter | BioRad | TC10 | |
| Isoflurane | Baxter International Inc. | 1001936060 | |
| VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System | Visual Sonics Inc. | ||
| 9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system | Agilent | ||
| O.C.T Compound | Sakura Finetek USA | 4583 |
References
- Schouten, L. J., et al. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94, 2698-2705 (2002).
- Lin, N. U., et al.
- Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nat. Rev. Clin. Oncol. , (2011).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clin. Cancer Res. 16, 5664-5678 (2010).
- Yoneda, T., et al. A bone-seeking clone exhibits different biological properties from the MDA-MB-231 parental human breast cancer cells and a brain-seeking clone in vivo and in. 16, 1486-1495 (2001).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Res. 67, 4190-4198 (2007).
- Percy, D. B., et al. In vivo characterization of changing blood-tumor barrier permeability in a mouse model of breast cancer metastasis: a complementary magnetic resonance imaging approach. Invest. Radiol. 46, 718-725 (2011).
- Zhou, H., et al. Longitudinal MRI evaluation of intracranial development and vascular characteristics of breast cancer brain metastases in a mouse model. PLoS One. 8, (2013).
- Zhou, H., et al. Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice. PLoS One. 4, (2009).
- Zhang, R. D., et al. Differential permeability of the blood-brain barrier in experimental brain metastases produced by human neoplasms implanted into nude mice. Am. J. Pathol. 141, 1115-1124 (1992).
- Mason, R. P., et al. Tumor oximetry: comparison of 19F MR EPI and electrodes. Adv. Exp. Med. Biol. 530, 19-27 (2003).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clin. Cancer Res. 17, 142-153 (2010).
