Summary
Рак мозга метастазы модель груди мыши устанавливается с ультразвуковой визуализации наведением внутрисердечной инъекции MDA-MB231/Br-GFP клеток. Развитие мультифокальными внутричерепных метастазов была контролироваться продольно использованием высокого разрешения 9.4 T MRI.
Abstract
Рак молочной железы метастазами в головной мозг, происходящие в 30% больных раком молочной железы на стадии IV, связано с высокой смертностью. Медиана выживаемости составляет всего 6 месяцев. Это важно иметь подходящие животные модели для имитации гемодинамики распространение метастатических клеток в клинической ситуации. Здесь мы представляем использование небольшого ультразвуковых животное, чтобы вести точную инъекцию мозга раковых клеток тропический груди в левый желудочек бестимусных голых мышей. Продольная МРТ используется для оценки внутричерепного инициирование и рост метастазов в головной мозг. Ультразвуковая руководствуясь внутрисердечное впрыска обеспечивает не только точное инъекции и настоящим более высокую успешную ставку, но и значительно снизилась смертность, по сравнению с нашей предыдущей ручной процедуре. В естественных условиях с высоким разрешением МРТ позволяет визуализировать гиперинтенсивным мультифокальными поражений, как малые, как 310 мкм в диаметре на Т 2-взвешенных изображениях на 3 недели после инъекции. Фоллож-до МРТ показывает внутричерепное рост опухоли и увеличение количества метастазов, которые распространяют по всей мозга.
Introduction
Мозг метастазы является наиболее распространенным внутричерепное злокачественных опухолей у взрослых. Прогноз крайне бедных, при медиане выживаемости 4-6 месяцев даже с агрессивного лечения. Рак молочной железы является одним из трех основных первичных раковых заболеваний с высокой заболеваемостью метастаза мозга 1-3. Несколько линий рака молочной железы мозга Тропик способны развивать метастазы мозга после внутрисердечной или intracarotid инъекции 4. Прямой впрыск опухолевых клеток в левый желудочек может обойти капиллярное русло легких и тем самым увеличить частоту формирования метастазов в головном мозге при минимизации висцеральные метастазы. MDA-MB231Br линия является одним из наиболее широко используемых человека линий рака молочной железы по развитию мозга метастазы в моделях грызунов 5,6.
Как и многие другие исследования 4,7, мы провели ручную процедуру инъекции внутрисердечной в наших предыдущих исследованиях. Тем не менее, только 50% успеха ставка была получена с руководствомвпрыска и доля мышей умерли от повторных инвазивных процедур, если предыдущие испытания не удалось. Здесь мы представляем использование процедуры обработки изображений наведением, чтобы закрепить инъекцию мозга ищущих раковых клеток молочной железы в левый желудочек бестимусных мышей. Продольная высокое разрешение МРТ применяется следовать внутричерепное развитие метастазов в головной мозг.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Университета Техаса Юго-западного медицинского центра.
1. Подготовка клеток MDA-MB231/Br-GFP
- Получить и культура клеток MDA-MB231/Br-GFP (любезно предоставленные доктором. Пальмиери и Steeg, NCI) в DMEM среде, содержащей 10% FBS, 1% глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина.
- Соблюдайте состояние клеток и цвет среде, и заменить среднего каждые 2-3 дня.
- Trypsinize и сбора клеток при 80% слияния будет достигнута, как описано в пунктах 1.3.1-1.3.5:
- Удалите старый среду полностью и добавить 5 мл PBS (1x), чтобы промыть клетки мягко. Снимите PBS от блюда.
- Добавить 1,5 мл трипсина в блюдо; наклонить блюдо осторожно, чтобы гарантировать, что все клетки покрыты трипсина. Поставьте блюдо обратно в камеру инкубатора и держать его при 37 ° С в течение 1 мин.
- Возьмите блюдо из инкубатора и наблюдатьклетки под оптическим микроскопом для обеспечения клетки отделяются от блюда.
- Добавить 3 мл среды прекратить действие трипсина. Сбор смеси клеток в центрифужную пробирку. Центрифуга смеси при 2000 оборотах в минуту в течение 5 мин.
- Осторожно снимите среду и не ресуспендирования клеток в 5 мл бессывороточной среде до получения однородной консистенции.
- Всего соответствующее количество клеток и ресуспендируют их в бессывороточной DMEM среде с конечной концентрации 1,75 × 10 5 клеток в 100 мкл объем.
- Возьмите 50 смесь мкл клеток и добавить 50 мкл трипанового синего. После смешивания, взять 10 мкл смеси и тщательно добавить в счетной ячейки слайда. Используйте несколько образцов, чтобы обеспечить точную оценку номер ячейки.
- Придерживайтесь в счетной ячейки горкой, одного конца в то время, и клеточной счетчик начинает отсчет автоматически. Возьмите среднее значение всех результатов подсчета и расчета общего количества клеток.
- Центрифуга клетки снова и ресуспендируют их вСоответствующий объем бессывороточной среде, приведет к конечной концентрации 1,75 × 10 5 клеток/100 мкл объем.
- Место клетки на льду до внутрисердечной инъекции.
2. Ультразвуковое исследование наведением Внутрисердечный впрыска
- Используйте Обнаженная мышей (BALB / с ню / ню) между 6-8 недель.
- Войти в систему визуализации. Инициализация датчика 704 (40 МГц).
- Начните новое исследование и заполните информацию.
- Обезболить (3% isoflurane/100% О 2 в индукционной камере) и поддерживать животных изофлураном (2%) в 100% O 2 (1 дм 3 / мин) в течение всей процедуры через носовой обтекатель. Анестезия подтверждается, когда нет вывода рефлекс не наблюдается с ног крайнем случае.
- Установите температуру таблицы изображений до 37 ° C. Лента наркозом мышь к столу с подогревом изображений в положении лежа на спине.
- Держите ультразвуковой гель при 37 ° С до имстарения. Нанесите гель на грудь мыши.
- Установите датчик в держатель. Опустите датчик до достижения требуемой глубины изображения. Перемещение на сцену, пока левый желудочек не отождествляется с восходящей аорты как ориентир (рис. 1А). Зафиксируйте этап, когда четкое представление о левого желудочка визуализируется.
- Нарисуйте 100 мкл смеси клеток в 1 мл шприц с 22 G иглы. Место и закрепите шприц на шприц монтировать.
- Перемещение шприц вперед к груди мыши и тщательно перемещать его из стороны в сторону, пока кончик иглы не находится в поле изображения зрения (перед входом мышь).
- Отрегулируйте высоту иглы и угол, чтобы прицелиться вниз в левый желудочек.
- Проникнуть иглу шприца в межприбрежного пространства незамедлительно через кожу и мышечные слои в левый желудочек под руководством ультразвуковой визуализации.
Указание успешного введении иглы в левую VentriНКУ является рефлюкс свежего артериальной крови (розового цвета в отличие от темно-красного венозной крови) в шприц - Введите смеси клеток медленно (рис. 1В).
- После завершения, извлеките иглу, поднимите преобразователь, очистить ультразвуковой гель с влажной марлей и удалить ленту.
- Подготовьте чистую клетку с разогретой площадку.
- Место животное на площадку и наблюдать животное до полного выздоровления.
- Контролировать поведение животного каждые 24 ч в течение двух дней.
- Мониторинг Общие условия и неврологические признаки осложнений в подопытных мышей регулярно.
3. МРТ Мониторинг внутричерепного развития опухоли
- Используйте 9,4 Тесла магнит для мониторинга внутричерепного развитие метастазов в головной мозг.
- Инициировать МРТ через две недели после имплантации опухоли и повторить один раз в неделю на срок до трех недель.
- Степенный животных с 3% изофлуран и поддерживать их под генаRAL анестезии (1,5% изофлуран).
- Контролировать и поддерживать температуру тела животных и постоянную дыхания в течение всего эксперимента.
- Высокое разрешение мультиспиральной (14 ломтики с толщиной 1 мм, без зазора) Т 1 - и Т 2-взвешенный корональные изображения, охватывающие область от лобной доли в задней черепной ямке, приобретаются со следующими параметрами: T 1-взвешенных изображениях: спинового эха несколько ломтик (SEMS), TR / TE = 400 msec/20 мс, матрица: 256 х 256, угол обзора 20 х 20 мм, в резолюции плоскости: 78 х 78 мкм 2. T 2-взвешенных изображениях: быстро спинового эха несколько ломтик (FSEMS) последовательностей, TR / TE = 2500 msec/48 мс, 8 эхо поезда, матрица: 256 х 256, угол обзора 20 х 20 мм, в резолюции плоскости: 78 х 78 мкм 28,9.
Опухолевые поражения появляются ярче, чем обычные тканях мозга на Т 2-взвешенных изображениях. - Размер опухоли определяется на Т 2-взвешенных изображениях вручную изложением enhanCing долю массы на каждом изображении с помощью MATLAB программы, написанные нами 8.
Учитывая большую часть опухоли диаметры меньше, чем толщина среза (1 мм), размер опухоли представлен как в плоскости области, а не объема.
4. Н & E Окрашивание Подтверждение метастазов
- Жертвоприношение мышей сразу после последнего MR сканирования, препарировать опухолями мозга и вставлять его в октябре среды и замораживали в -80 ° С
- Раздел серия 10 мкм толщиной корональной мозга образцы с криостата.
- Выполните H & E окрашивание на участках головного мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С высоким пространственным разрешением МРТ (78 мкм в резолюции плоскости), гиперинтенсивных повреждения могут быть определены как малые, как 310 мкм в диаметре (рис. 2). Так как метастазы в этом исследовании очень малы и развитие некроза и отека минимальна, гиперинтенсивным поражение на Т 2-взвешенных изображениях действительно представлял массы опухоли.
Продольные исследования МРТ позволяют в естественных условиях неинвазивной оценки роста опухоли. Как показано на фиг.3, с высоким разрешением МРТ удалось обнаружить несколько небольших поражений 3 недели после инъекции внутрисердечного (фиг.3А). На 4-й неделе, поражения, которые были замечены в предыдущей проверки всех стало больше; больше новых поражений появилась на Т 2-взвешенных изображениях (рис. 3б).
Н & E окрашивание выявило либо диффузное или тип кластера метастатические поражения (рис. 4).Увеличенные сосуды часто видели вокруг опухоли, что указывает nonsprouting ангиогенез (Рисунок 4D).
Рисунок 1. Ультразвуковая руководствуясь внутрисердечное инъекции. (А) Идентификация восходящей аорты (стрелка) в качестве ориентира левого желудочка сердца мыши. (В) Игла (стрелка) вставки в левый желудочек, чтобы придать опухолевые клетки. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Высокое разрешение Т 2-взвешенных изображениях рака молочной железы метастазы в головной мозг. Четырнадцать последовательных срезов МРТ представительного мозга мыши, приобретенных через четыре недели после инъекции внутрисердечной, четко выявлены мультифокальные метастазы распространении через весь мозг мыши, от обонятельной луковице, чтобы мостовое и мозга. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Продольная МРТ развития метастазов в головной мозг. A. Шесть последовательных корональные разделы МРТ в неделю 3 определены несколько поражений с гипер-интенсивности на Т 2-взвешенных изображениях. B. Увеличение числа лesions появился на изображениях на 4 неделе, и эти повреждения видны на 3-й неделе стало больше. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Микроскопические повреждения наблюдались на H & E окрашивания.. Целый смонтировать корональной разделе изображены многочисленные повреждения. BD. Более высокие изображения коэффициент увеличения показали либо диффузное или поражения кластерного типа (В и С). Увеличенные судов были замечены вокруг опухоли. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем исследовании мы показали, что ультразвуковое исследование наведением впрыска левого желудочка обеспечивает точность, так что наблюдалось каждое животное в данном исследовании разработана метастазами в головной мозг и ни одно животное смерть. Красота изображений наведением инъекции, что путь проникновения иглы кожи и, наконец, в левый желудочек может контролироваться и регулироваться под изображением, которое отличается от ручной процедуры, требующее строгие анатомические ориентиры для подражания.
Текущие договоренности внутричерепного развития метастазов в головной мозг в значительной степени основаны на гистологических исследований на животных моделях 4,10. Тем не менее, гистологические исследования обычно требуют большое количество мышей, которые погибли в различные моменты времени после имплантации опухоли. Что еще более важно, информация о временном развития в отдельных поражений не хватает от гистологических исследований.
В естественных изображений обещает большую еfficiency с каждого животного служит своим собственным контролем и различные моменты времени может быть рассмотрено последовательно 7,11. T 2-взвешенные изображения с высоким разрешением позволяют обнаруживать мультифокального инициации опухоли на самой ранней стадии (поражений с диаметром как малые, как 310 мкм могут видеть). Продольная МРТ позволяет отдельным метастазы в головной мозг должны быть рассмотрены в течение долгого времени. Кроме того, в естественных условиях неинвазивный МРТ будет особенно ценным в продольном исследовании терапевтического ответа, например всей излучения мозга.
Формирование мультифокальными метастазами в головной мозг приводится характеристика модели MDA-MB231Br. Кроме того клеточной линии MDA-MB231/Br-GFP мы показали в настоящем исследовании, родительский клон MDA-MB231/Br и MDA-MB231/Br-luc также демонстрируют подобные метастатических поражений. В противоположность этому, несколько других головного мозга, ищущих линии, такие как MCF-7BR и 4T1, как было показано в разработке одиночного метастаза после внутрисердечной инъекции 12. Обамодели, отражая клинические аналоги, полезные модели на животных из метастазами в головной мозг. Тем не менее, в дополнение к метастазами в головной мозг, висцеральных метастазов, например, легочных и костных метастазов часто наблюдаются в этой модели. Создание моделей на животных, которые развиваются метастазы мозга исключительно будет иметь решающее значение, в частности, для оценки реакции на лечение.
В заключение, мы показали полезность изображений наведением инъекции внутрисердечной о создании метастазами в головной мозг модель мыши и высоким разрешением МРТ для оценки внутричерепного развитие мультифокальными метастазов в модели мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарны д-ра. Диана Пальмиери и Патрисия Steeg из NCI за предоставленную нам MDA-MB231Br клетки. Мы благодарим доктора Ральфа Мейсон, мистер Джейсон Reneau и г-жу Рамона Lopes технической и коллегиального поддержки. Эта работа была частично поддержана на DOD IDEA наград W81XWH-08-1-0583 и W81XWH-12-1-0317. МРТ эксперименты проводились в Advanced Imaging Research Center, в объекте NIH BTRP # P41-RR02584 и ультразвуковым контролем впрыска внутрисердечное проводили с VisualSonics Vevo 770 под 1S10RR02564801.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-051-C1 | |
| Automatic cell counter | BioRad | TC10 | |
| Isoflurane | Baxter International Inc. | 1001936060 | |
| VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System | Visual Sonics Inc. | ||
| 9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system | Agilent | ||
| O.C.T Compound | Sakura Finetek USA | 4583 |
References
- Schouten, L. J., et al. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94, 2698-2705 (2002).
- Lin, N. U., et al.
- Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nat. Rev. Clin. Oncol. , (2011).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clin. Cancer Res. 16, 5664-5678 (2010).
- Yoneda, T., et al. A bone-seeking clone exhibits different biological properties from the MDA-MB-231 parental human breast cancer cells and a brain-seeking clone in vivo and in. 16, 1486-1495 (2001).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Res. 67, 4190-4198 (2007).
- Percy, D. B., et al. In vivo characterization of changing blood-tumor barrier permeability in a mouse model of breast cancer metastasis: a complementary magnetic resonance imaging approach. Invest. Radiol. 46, 718-725 (2011).
- Zhou, H., et al. Longitudinal MRI evaluation of intracranial development and vascular characteristics of breast cancer brain metastases in a mouse model. PLoS One. 8, (2013).
- Zhou, H., et al. Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice. PLoS One. 4, (2009).
- Zhang, R. D., et al. Differential permeability of the blood-brain barrier in experimental brain metastases produced by human neoplasms implanted into nude mice. Am. J. Pathol. 141, 1115-1124 (1992).
- Mason, R. P., et al. Tumor oximetry: comparison of 19F MR EPI and electrodes. Adv. Exp. Med. Biol. 530, 19-27 (2003).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clin. Cancer Res. 17, 142-153 (2010).
