Summary
En brystkreft hjernemetastaser musemodell er etablert med ultralydavbildning-guidet intrakardiell injeksjon av MDA-MB231/Br-GFP celler. Utvikling av multifokale intrakranielle metastaser har vært overvåket i lengderetningen ved hjelp av høyoppløselig 9,4 T MR.
Abstract
Brystkreft hjernemetastaser, som forekommer i 30% av brystkreftpasienter i stadium IV, er forbundet med høy dødelighet. Median overlevelse er bare seks måneder. Det er kritisk å ha egnede dyremodeller for å etterligne den hemodynamiske spredning av metastatiske celler i den kliniske situasjon. Her introduserer vi bruk av små dyr ultralyd for å veilede en nøyaktig injeksjon av hjerne tropisk brystkreftceller inn i venstre hjertekammer av atymiske nakne mus. Langsgående MRI brukes til å vurdere intrakraniale dannelse og vekst av hjernemetastaser. Ultralydveiledet intrakardiell injeksjon sikrer ikke bare en nøyaktig injeksjon og herved en høyere vellykket sats, men også betydelig redusert dødelighet, sammenlignet med vår forrige manuell prosedyre. In vivo høyoppløselig MR tillater visualisering av hyper multifokale lesjoner, så liten som 310 mikrometer i diameter på T 2-vektede bilder på tre uker etter injeksjon. Follow-up MR avslører intrakraniell tumor vekst og økt antall metastaser som distribuerer gjennom hele hjernen.
Introduction
Hjernemetastaser er den vanligste intrakranielle malignitet hos voksne. Prognosen er ekstremt dårlig, med en median overlevelse på 4-6 måneder selv med aggressiv behandling. Brystkreft er en av de tre store primære kreft med en høy sykelighet av hjernemetastaser 1-3. Flere hjerne-tropiske brystkreft linjene er i stand til å utvikle hjernemetastaser etter intrakardiale eller intracarotid injeksjon fire. Direkte injeksjon av tumorceller inn i det venstre hjertekammer kan omgå lungekapillære sjiktet og derved øke forekomsten av dannelse av hjernemetastaser samtidig minimere viscerale metastaser. Den MDA-MB231Br linjen er en av de mest brukte humane brystkreft linjer for å utvikle hjernemetastaser i gnagermodeller 5,6.
I likhet med mange andre studier 4,7, har vi foretatt en manuell prosedyre for intrakardiell injeksjon i våre tidligere studier. Det ble imidlertid bare 50% vellykket som oppnås med den manuelleinjeksjon og en brøkdel av mus døde av de gjentatte invasive prosedyrer hvis tidligere studier lyktes ikke. Her introduserer vi bruken av en avbildningsstyrt fremgangsmåte for å sikre tilførsel av hjerne-søker brystcancerceller inn i den venstre ventrikkel i atymiske mus. Langsgående høy oppløsning MRI brukes til å følge utviklingen av intrakranielt hjernemetastaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyre prosedyrene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité University of Texas Southwestern Medical Center.
En. Utarbeidelse av MDA-MB231/Br-GFP Cells
- Hente og kultur de MDA-MB231/Br-GFP celler (vennlig levert av legene. Palmieri og Steeg, NCI) i DMEM medium som inneholder 10% FBS, 1% glutamin og 1% penicillin / streptomycin.
- Observere tilstanden til cellene og farge på medium, og erstatte medium hver 2-3 dager.
- Trypsinize og samle cellene når 80% samløpet er nådd som skissert i trinn 1.3.1-1.3.5:
- Fjern det gamle mediet helt og tilsett 5 ml PBS (1x) å vaske cellene forsiktig. Fjern PBS fra fatet.
- Tilsett 1,5 ml Trypsin i fatet, vippe fatet forsiktig for å sikre at alle cellene er dekket av Trypsin. Sett rett tilbake til cellen inkubatoren og holde det ved 37 ° C i 1 min.
- Ta fatet ut av kuvøse og observerede cellene under optisk mikroskop for å sikre at cellene løsner fra fatet.
- Tilsett 3 ml medium for å stanse virkningen av trypsin. Samle celleblandingen i et sentrifugerør. Sentrifuger blandingen ved 2000 rpm i 5 min.
- Fjern mediet forsiktig og resuspender cellene i 5 ml serum fritt medium før homogen.
- Telle passende antall celler og resuspender dem i serumfritt DMEM medium med en sluttkonsentrasjon på 1,75 x 10 5 celler i 100 ul volum.
- Ta 50 mL celle blandingen og tilsett 50 mL Trypan Blå. Etter blanding, ta 10 ul blandingen og tilsett forsiktig til celletelling lysbilde. Bruk flere prøver for å sikre nøyaktig celle nummer estimering.
- Hold deg i cellen telling lysbilde, den ene enden av gangen og celleteller begynner å telle automatisk. Ta gjennomsnittet av alle telleresultatene og beregne det totale celleantallet.
- Sentrifuger cellene igjen og resuspender dem ipassende volum av serumfritt medium til å gi den endelige konsentrasjon på 1,75 x 10 5 cells/100 pl volum.
- Plasser cellene på is før intrakardiell injeksjon.
2. Ultralyd Imaging-guidet Intrakardial Injection
- Bruk kvinnelige nakenmus (BALB / c nu / nu) mellom 6-8 uker gamle.
- Logg i bildebehandlingssystem. Initialsvinger 704 (40 MHz).
- Start en ny studie, og fyll inn informasjonen.
- Anesthetize (3% isoflurane/100% O 2 i en induksjonskammeret) og opprettholde dyrene med isofluran (2%) i 100% O 2 (1 dm 3 / min) i løpet av hele prosessen via en nesekonus. Anestesi er bekreftet når ingen tilbaketrekking refleks er observert med tå klype.
- Sett temperaturen på avbildningstabellen til 37 ° C. Tape bedøvet musen til oppvarmet bildebehandling tabellen i liggende stilling.
- Hold ultralyd gel ved 37 ° C før imaldring. Påfør gel til brystet av musen.
- Monter svingeren i holderen. Senk svingeren til den ønskede bildedybden er nådd. Flytt scenen til venstre ventrikkel er identifisert med den stigende aorta som landemerke (figur 1A). Lås scenen når et klart syn på venstre ventrikkel er visualisert.
- Tegn 100 ul av celleblanding i en 1 ml sprøyte med en 22 G nål. Plasser og fest sprøyten på sprøyten montere.
- Flytt sprøyten frem mot muse brystet og nøye flytte den fra side til side før den er nede i bilde synsfelt (før vi går i mus).
- Juster nålen høyde og vinkel for å sikte på venstre hjertekammer.
- Trenge sprøytespissen inn inter plass raskt gjennom huden og muskellagene inn i venstre hjertekammer under veiledning av ultralyd billeddiagnostikk.
En indikasjon på vellykket innføring av nålen inn i den venstre ventrikkelcle er tilbakeløp av frisk arterieblod (rosa farge i kontrast til mørkerød veneblod) inn i sprøyten - Injiseres celleblandingen langsomt (figur 1B).
- Ved ferdigstillelse, ut kanylen, løft opp svingeren, rengjør ultralyd gel med fuktet kompress og fjerne tapen.
- Forbered et rent bur med en forvarmet pad.
- Plasser dyret på puten og observere dyret til full gjenoppretting.
- Overvåke oppførselen til dyret hver 24. time i to dager.
- Generelle vilkår og nevrologiske tegn til komplikasjoner i eksperimentell mus blir rutinemessig overvåkes.
Tre. MR Overvåking av Intrakraniell Tumor Development
- Bruk en 9,4 Tesla magnet for å overvåke intrakraniell utvikling av hjernemetastaser.
- Initiere MR to uker etter tumorimplantasjonen og gjenta en gang i uken i opp til tre uker.
- Sedate dyrene med 3% isofluran og vedlikeholde dem under genetral bedøvelse (1,5% isofluran).
- Overvåke og vedlikeholde dyrets kroppstemperatur og respirasjon konstant gjennom hele forsøket.
- Høy oppløsning Multispiral (14 skiver med en mm tykk, noe gap) T 1 - og T 2-vektede koronale bilder, som dekker området fra frontallappen til bakre skallegrop, er kjøpt med følgende parametere: T 1-vektede bilder: spin ekko multippel skive (SEMS), TR / TE = 400 msec/20 msek, matrise: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, i plan-oppløsning: 78 x 78 mikrometer to. T 2-vektede bilder: rask spin ekko flere skive (FSEMS) sekvenser, TR / TE = 2500 msec/48 msek, 8 ekkotog, matrise: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, i plan-oppløsning: 78 x 78 mikrometer 28,9.
Tumorlesjoner ser lysere enn normalt hjernevev på T 2-vektede bilder. - Tumor størrelse bestemmes på T 2-vektede bilder ved å manuelt skisserte ekstr.utscing del av massen på hvert bilde ved hjelp MATLAB-programmer som er skrevet av oss 8..
Gitt det meste av tumor diameter er mindre enn den skive tykkelse (1 mm), blir tumorstørrelse presentert som i plan området heller enn volumet.
4. H & E Farging Bekrefte metastaser
- Ofre musene umiddelbart etter siste MR skanner, dissekere tumor-bærende hjerner og legge det i oktober medium og frosset i -80 ° C.
- § en serie av 10 mikrometer tykke koronale hjernen eksemplarer med kryostat.
- Utfør H & E flekker på hjernen seksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med den høye romlige oppløsning av MRI (78 mikrometer i plan oppløsning), kan lesjoner identifiseres så liten som 310 mikrometer i diameter (figur 2). Siden metastaser i denne studien er svært små og utvikling av nekrose og ødem er minimalt, den hyper lesjon på T 2-vektede bilder virkelig representerte tumormassen.
Longitudinelle MRI studier tillate in vivo ikke-invasiv evaluering av tumorvekst. Som vist i figur 3, med høy oppløsning MRI var i stand til å gjenkjenne flere små lesjoner 3 uker etter intrakardial injeksjon (figur 3A). På uke 4, lesjoner som ble sett i den forrige skanningen alle ble større, flere nye lesjoner finnes på T 2-vektede bilder (Figur 3B).
H & E flekker avslørt enten diffuse eller klynge typen metastatiske lesjoner (figur 4).Forstørrede fartøy ble ofte sett rundt svulsten, noe som indikerer nonsprouting angiogenese (Figur 4D).
Figur 1. Ultralydveiledet intrakardiell injeksjon. (A) Identifikasjon av stigende aorta (pil) som landemerke i venstre hjertekammer av musen hjertet. (B) En nål (pil) innsetting i venstre hjertekammer å injisere kreftceller. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Høy oppløsning T 2-vektede bilder av brystkreft hjernemetastaser. Fjorten påfølgende MR skiver av en representant mus hjernen, kjøpte fire uker etter intrakardiell injeksjon, tydelig avslørte multifokale metastaser distribuere gjennom hele musen hjernen, fra luktelappen til Pontine og medulla. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Langsgående MR av utvikling av hjernemetastaser. A. Seks sammenhengende koronale MR seksjoner på uke 3 identifisert flere lesjoner med hyper-intensitet på T 2-vektede bilder. B. Et økt antall lesions dukket opp på bildene i uke 4, og disse lesjoner sett på uke 3 ble større. Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. Mikroskopiske lesjoner ble observert på H & E flekker. A. En hel montere koronale delen avbildet flere lesjoner. BD. Høyere forstørrelse bilder viste enten diffuse eller cluster typen lesjoner (B og C). Forstørrede fartøy ble sett rundt svulsten. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien har vi vist at ultralydavbildning-guidet venstre ventrikkel injeksjon sikrer nøyaktigheten slik at alle dyr i denne studien utviklet hjernemetastaser og ingen dyr død ble observert. Det fine med bildestyrt injeksjon er at banen nålkraft av huden og til slutt inn i venstre hjertekammer kan overvåkes og justeres under bildet, som er forskjellig fra den manuelle fremgangsmåten krever strenge anatomiske landemerker å følge.
Omløps forståelser av intrakranielle utvikling av hjernemetastaser er i stor grad basert på histologiske studier på dyremodeller 4,10. Imidlertid histologiske undersøkelser normalt kreve et stort antall mus som er drept på forskjellige tidspunkter etter tumor-implantasjon. Enda viktigere, er informasjon om timelige utviklingen i enkelte lesjoner mangler fra histologiske undersøkelser.
In vivo avbildning lover større efficiency siden hvert dyr fungerer som sin egen kontroll og flere tidspunkter kan undersøkes sekvensielt 7,11. Høyoppløselige T 2-vektede bilder aktiverer påvisning av multifokal startfasen ved svært tidlig stadium (lesjoner med diameter så liten som 310 mikrometer er synlige). Langsgående MR gjør at enkelte hjernemetastaser til å bli undersøkt over tid. Videre vil in vivo ikke-invasiv MRI være særlig verdifullt i langsgående studium av terapeutisk respons, f.eks hele hjernen stråling.
Dannelse av multifokale hjernemetastaser er egenskapene til MDA-MB231Br modell. Foruten MDA-MB231/Br-GFP cellelinje vi viste i denne studien, foreldre klone MDA-MB231/Br og MDA-MB231/Br-luc også viser lignende metastatiske lesjoner. I motsetning til dette har flere andre hjerne-søker linjer som MCF-7br og 4T1 vist seg å utvikle en enslig metastase etter intrakardiell injeksjon 12. Begge demodeller, speiling kliniske kolleger, er nyttige dyremodeller av hjernemetastaser. Men i tillegg til hjernemetastaser, visceral metastaser, for eksempel lunge-og skjelettmetastaser er ofte observert i denne modellen. Etablering av dyremodeller som utvikler hjernemetastaser utelukkende vil være avgjørende, særlig for evaluering av behandlingsrespons.
I konklusjonen, har vi demonstrert nytten av bildebehandlingsstyrt intrakardiell injeksjon for å etablere en hjernemetastaser mus modell og den høye oppløsningen MR for å vurdere intrakraniell utvikling av multifokale metastaser i en musemodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for legene. Diane Palmieri og Patricia Steeg av NCI for å gi oss MDA-MB231Br celler. Vi takker Dr. Ralph Mason, Mr. Jason Reneau og Ms Ramona Lopes for teknisk og kollegial støtte. Dette arbeidet ble støttet delvis av DOD IDEA Awards W81XWH-08-1-0583 og W81XWH-12-1-0317. MR eksperimenter ble utført i Advanced Imaging Research Center, en NIH BTRP # P41-RR02584 studio og ultralydveiledet intrakardiell injeksjon ble utført med VisualSonics Vevo 770 henhold 1S10RR02564801.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-051-C1 | |
| Automatic cell counter | BioRad | TC10 | |
| Isoflurane | Baxter International Inc. | 1001936060 | |
| VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System | Visual Sonics Inc. | ||
| 9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system | Agilent | ||
| O.C.T Compound | Sakura Finetek USA | 4583 |
References
- Schouten, L. J., et al. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94, 2698-2705 (2002).
- Lin, N. U., et al.
- Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nat. Rev. Clin. Oncol. , (2011).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clin. Cancer Res. 16, 5664-5678 (2010).
- Yoneda, T., et al. A bone-seeking clone exhibits different biological properties from the MDA-MB-231 parental human breast cancer cells and a brain-seeking clone in vivo and in. 16, 1486-1495 (2001).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Res. 67, 4190-4198 (2007).
- Percy, D. B., et al. In vivo characterization of changing blood-tumor barrier permeability in a mouse model of breast cancer metastasis: a complementary magnetic resonance imaging approach. Invest. Radiol. 46, 718-725 (2011).
- Zhou, H., et al. Longitudinal MRI evaluation of intracranial development and vascular characteristics of breast cancer brain metastases in a mouse model. PLoS One. 8, (2013).
- Zhou, H., et al. Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice. PLoS One. 4, (2009).
- Zhang, R. D., et al. Differential permeability of the blood-brain barrier in experimental brain metastases produced by human neoplasms implanted into nude mice. Am. J. Pathol. 141, 1115-1124 (1992).
- Mason, R. P., et al. Tumor oximetry: comparison of 19F MR EPI and electrodes. Adv. Exp. Med. Biol. 530, 19-27 (2003).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clin. Cancer Res. 17, 142-153 (2010).
