Summary
דופן התא החיידקי מורכבת מפפטידוגליקן, רשת מקרומולקולרית של גדילי סוכר המוצלבים על ידי פפטידים. כרומטוגרפיה נוזלית עם ביצועים גבוהים מספקת רזולוציה גבוהה ותפוקה לגילויים חדשניים של הרכב פפטידוגליקני. אנו מציגים הליך לבידוד קירות התא (sacculi) והכנתם לאחר מכן לניתוח באמצעות UPLC.
Abstract
דופן התא החיידקי היא קריטית לקביעת צורת התא במהלך הצמיחה והחלוקה, ושומרת על השלמות המכנית של התאים לנוכח לחצים טורגורים מספר אטמוספרות בעוצמה. על פני הצורות והגדלים המגוונים של ממלכת החיידקים, קיר התא מורכב מפפטידוגליקן, רשת מקרומולקולרית של גדילי סוכר המחוברים על ידי פפטידים קצרים. החשיבות המרכזית של Peptidoglycan לפיזיולוגיה חיידקית עומדת ביסוד השימוש בו כמטרה אנטיביוטית והניעה מחקרים ביולוגיים גנטיים, מבניים ותאיים של האופן שבו הוא מורכב באופן איתן במהלך צמיחה וחלוקה. עם זאת, עדיין נדרשות חקירות מקיפות כדי לאפיין באופן מלא את הפעילות האנזימטית העיקרית בסינתזה פפטידוגליקנית ואת ההרכב הכימי של קירות התא החיידקי. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) היא שיטה אנליטית רבת עוצמה לכימות הבדלים בהרכב הכימי של קירות החיידקים הגדלים תחת מגוון תנאים סביבתיים וגנטיים, אך התפוקה שלה מוגבלת לעתים קרובות. כאן, אנו מציגים הליך פשוט לבידוד והכנת קירות תא חיידקי לניתוחים ביולוגיים של פפטידוגליקן באמצעות HPLC ו כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC), הרחבה של HPLC המשתמשת במשאבות כדי לספק לחצים גבוהים במיוחד של עד 15,000 psi, לעומת 6,000 psi עבור HPLC. בשילוב עם הכנת קירות תא חיידקי המוצגים כאן, מזרקי המדגם בנפח נמוך, גלאים עם שיעורי דגימה גבוהים, נפחי מדגם קטנים יותר וזמני ריצה קצרים יותר של UPLC יאפשרו רזולוציה גבוהה ותפוקה לגילויים חדשים של הרכב פפטידוגליקני וביולוגיה בסיסית של תאי חיידקים ברוב המעבדות הביולוגיות עם גישה לאולטרה-סנטריפוג ו- UPLC.
Introduction
מטרת השיטה המתוארת במסמך זה היא לבודד קירות תא חיידקי שלמים (sacculi) ולעכל את הפפטידוגליקן (PG) כך שניתן יהיה להשתמש בכרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC) כדי לספק מידע כגון זהותם של רכיבי muropeptide וריכוזיהם, האורך הממוצע של גדילי הגליקן, ושבריר החומר המעורב בקישורים צולבים בין גדילים. לדיון מפורט על ביוכימיה PG ומינים muropeptide, ישנן מספר ביקורות מצוינות המתארות מבנה PG ותפקידה זיהום, התנגדות, morphogenesis, וצמיחה1-6. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) לניתוח PG פותחה בתחילה על ידי גלונר ושוורץ בשנות השמונים, ולאחרונה שופרה ויושמתה בהרחבה במעבדות של מיגל דה פדרו ו-וולדמר וולמר. שיטות קודמות השתמשו בניתוח חומצות אמינו או כרומטוגרפיה של נייר, טכניקות גוזלות זמן ומייגעות שאינן מניבות הערכות מדויקות או מלאות של רכיבי קיר התא.
ניתוח UPLC ניתן ליישם בקלות בכל מעבדת מחקר בסיסית שיש לה גישה ultracentrifuge ו UPLC. שיטת UPLC שאנו מציגים להלן מבודדת sacculi שלם, ובכך מספקת מידע מקיף, כמותי על כל המינים הכימיים בו. שיטה זו מניבה כימות מדויק של כל muropeptides על פני אוכלוסייה של חיידקים, כל בתוך 20 דקות UPLC לרוץ. יישום שיטה זו כרוך בכישורי מעבדה בסיסיים בלבד, ללא השקעה כספית משמעותית בחומרים. על מנת לבצע את השלבים בשיטה זו, החוקרים צריכים להיות מיומנים רק בצנרת, הכנת מאגרים ואנזימים, והתאמת ה- pH, מה שהופך אותו לנגיש למגוון רחב של דיסציפלינות מדעיות. הבחירה של אנזימים המשמשים בפרוטוקול זה תלויה במין החיידק המנותח; הפרוטוקול המתואר כאן שימושי עבור Escherichia coli, ובדרך כלל נמצא כי הוא מתאים לבודד sacculi מאורגניזמים אחרים גראם שלילי. התייעצות עם הספרות מומלצת בעת יישום שיטה זו על חיידקים גראם חיובי; במינים אלה, טיהור סקולוס באופן מסורתי היה קשה יותר. בפרט, שיטה זו עשויה להיות צריכה להיות שונה במונחים של בחירת אנזים ואורך זמני העיכול כדי להתאים את הקירות העבים פולימרים אביזר כגון חומצות teichoic של חיידקים גראם חיובי. האנזים הראשון בפרוטוקול זה מבקע ליפופרוטאין קרום החיצוני (כגון ליפופרוטאין של בראון, או Lpp) מצורף פפטידוגליקן, ובכך משחרר את כל אבל C-terminal di- (או תלת)פפטיד של Lpp מקיר התא. שלב זה נחוץ בעת בחינת Enterobacteria, אבל חיידקים רבים אחרים גראם שלילי אין מקבילות Lpp, ולכן צעד זה ניתן לדלג. אנזים שני נצמד במיוחד לאחר רכיב החומצה המורמית של הפפטידוגליקן, ומזלזל בתת-המין disaccharide היוצר את מינים muropeptide. כדי לספק הערכה מדויקת של הארכיטקטורה של PG, יש להקפיד על עיכול sacculi כדי למנוע מחשוף של הגשרים או כל חלק אחר של גזע פפטיד.
למרות ההרכבים הכימיים של peptidoglycan מעל 100 זנים של ~ 40 מינים חיידקיים נותחו על ידי HPLC, לא בוצעו ניתוחים עם טכנולוגיית UPLC. בנוסף, עבודה קודמת אפיינה peptidoglycan רק חלק קטן של התחום החיידקי, בחלקו מוגבל על ידי התפוקה של HPLC. לכן, הפצת שיטה זו לחוקרים רבים ככל האפשר, ויישום על פלטפורמות UPLC, יהיה קריטי להנעת מחקרים פיזיולוגיים של חלק גדול של מיני חיידקים אשר peptidoglycan עדיין לא סווג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לגדל תרבויות חיידקים ב 2.5 מ"ל של מדיה לילה
תרבויות לדלל בחזרה 1:100 לתוך 250 מ"ל של מדיה טרייה לגדול OD600 של 0.7-0.8. הכינו פתרון של 6% נתרן דודקיל סולפט (SDS) במים.
התראה: אבקת SDS מסוכנת - הימנע משאיפת אבקת SDS; ללבוש מסכה על האף והפה.
2. יום 1 - תרביות חיידקים Lysing מבוצע במהלך יום אחד ולילה
- בעוד תרבויות מדוללות גדלות, להקים אמבט מים רותחים על צלחת חמה 1 L. לאחר המים רותחים, aliquot 6 מיליליטר של 6% SDS לתוך צינורות פוליפרופילן 50 מ"ל, להוסיף בר ערבוב אחד קטן לכל צינור, מכסי צינור מאובטח כדי אצבע הדוקה, למקם צינורות באמבט מים, ולהדליק ערבוב 500 סל"ד על הצלחת החמה.
- לקצור את 250 מ"ל תרבויות ב 5,000 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ואת כדורי resuspend ב 3 מ"ל של מדיה או 1x פוספט אגירה מלוחים. לאט תלויי תא פיפטה לתוך צינורות 50 מ"ל עם 6% רותחים SDS כדי lyse התאים (ריכוז סופי 4% SDS) בעוד הצינורות שקועים באמבט המים הרותחים, ולשקם מחדש את העפעפיים כדי אצבע הדוקה. השעיות התא חייב להיות מועבר במהירות לתוך SDS רותחים פעם בשימוש חוזר. יש להימנע משינויים סביבתיים פתאומיים, שכן זה יכול לגרום לשינוי שגוי של מבנה קיר התא.
- מכסים אמבט מים רותחים ומאפשרים לתאים לרתיחה במשך 3 שעות, בדיקת מפלס המים מעת לעת ומילוי אמבט המים בעת הצורך. לאחר 3 שעות, לכבות את אלמנט החימום של הצלחת החמה, ולהמשיך לבחוש לילה ב 500 סל"ד.
3. יום 2 - עיכול אנזימטי מבוצעים במהלך יום אחד
- אם SDS יש זירז בצינורות 50 מ"ל לילה, להגדיר את אמבט המים לרתיחה במשך 1-2 שעות נוספות. הפעל בלוק חום ל 60 °C (60 °F). הכן 1 מ"ג / מ"ל מלאי של Pronase E ב 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0.06% w / v NaCl ולהפעיל Pronase E ב 60 °C (60 °F) לפחות 30 דקות.
- השתמש ultracentrifuge להגדיר ב 400,000 × גרם כדי לסובב דגימות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על מנת גלולות פולימרים PG גדול ובכך לטהר אותם מרכיבים סלולריים אחרים. הסר supernatant בזהירות, ולאחר מכן resuspend כל גלולה במים אולטרה-דק טמפרטורת החדר. הערה: נפח ההשעיה תלוי בנפח של צינורות ultracentrifuge בשימוש; השתמש בנפח הממלא את הצינורות לפחות באמצע הדרך אך אינו עולה על הנפח המרבי של הצינורות. צנטריפוגה חוזרת/כביסה עד שהמים אינם יוצרים בועות במהלך ההשעיה, מה שמצביע על כך שה- SDS הוסר לחלוטין (בדרך כלל שלוש שטיפות). להפסיק לשטוף את גלולה אם משקע לבן צורות, כמו זה מציין כי sacculi הם גושים יחד. גושים אינם קטסטרופליים, אך גושים נקשרים בחוזקה רבה לפלסטיק וכלי זכוכית הגורמים לאובדן מדגם גדול. במקרה זה, המשך עם הפרוטוקול באמצעות מדגם sacculi מגושם.
- על צעד צנטריפוגה / כביסה האחרון, resuspend את הדגימות ב 900 μl של 10 מ"מ Tris-HCl (pH 7.2) + 0.06% w / v NaCl ולהעביר 2 צינורות מיליליטר בעבר דקר עם חורים בחלק העליון עם מחט קטנה. הוסף 100 μl של 1 מ"ג / מ"ל מופעל Pronase E (100 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) לכל מדגם דגירה ב 60 °C (60 °F) במשך 2 שעות. הגדר בלוק חום שונה ל 100 מעלות צלזיוס.
- לעצור את עיכול Pronase E על ידי הוספת 200 μl של 6% SDS לכל מדגם להרתיח את הדגימות בלוק חום 100 °C במשך 30 דקות. הגדר בלוק חום שונה ל 37 °C (69 °F) ולעשות 1 מ"ג / מ"ל מלאי של muramidase (mutanolysin) ב 50 mM מאגר פוספט (pH 4.9).
- כמו בשלב 3.2, השתמש ב- ultracentrifuge מוגדר ב- 400,000 × גרם כדי לסובב דגימות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף עם מים אולטרה-דקים בטמפרטורת החדר עד ש- SDS יוסר במלואו (בדרך כלל שלוש שטיפות). נפח ההשעיה תלוי בנפח של צינורות ultracentrifuge בשימוש; השתמש בנפח הממלא את הצינורות לפחות באמצע הדרך אך אינו עולה על הנפח המרבי של הצינורות.
- על צעד צנטריפוגה / כביסה האחרון, resuspend דגימות ב 200 μl של 50 mM מאגר נתרן פוספט (pH 4.9). נפח זה יכול להיות מותאם על פי כמות peptidoglycan במדגם, והוא עשוי להיות תלוי מינים. אם יש דיווחים שפורסמו בעבר של ניתוח HPLC עבור המינים של עניין, נפח זה ניתן להעריך בהתבסס על כמויות אלה (אוסף של מחקרי HPLC PG ניתן למצוא את המידע המשלים של הפניה7). עבור מינים אחרים, הכנת sacculus יכול להתבצע עד שלב זה ולאחר מכן כמויות שונות של נפחי resuspension ניתן להוסיף כדי לשכפל דגימות על מנת לקבוע את נפח מינימלי המאפשר PG להישאר בפתרון (ראה דיון עבור הערכות נוספות). אם המדגם מכיל יותר peptidoglycan, להגדיל את נפח ההשעיה מחדש; אם המדגם יש פפטידוגליקן קטן, להפחית את נפח ההשעיה למינימום של 50 μl.
- להעביר דגימות 1.5 מיליליטר צינורות ולהוסיף 1 מ"ג / מ"ל muramidase לתת ריכוז סופי של 40 מיקרוגרם / מיליליטר. דגירה 6-8 שעות או לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
4. יום 3 - הכנת דגימות עבור UPLC מבוצעת ביום האחרון
- הפעל בלוק חום ל 100 °C (60 °F). מרתיחים את הדגימות ללא SDS במשך 5 דקות כדי לעצור את העיכול muramidase. דגימות צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 16,000 × גרם בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להעביר את supernatant (muropeptides הם עכשיו מסיסים) ל 13 מ"מ x 100 מ"מ צינורות זכוכית. לנסות להתאושש כמו supernatant ככל האפשר, מקבל קרוב מאוד גלולה מבלי להפריע לו.
- התאימו את ה-pH על ידי הוספת מאגר בוראט של 500 מ"מ (pH 9) לדגימה לריכוז סופי של 100 מ"מ מאגר בוראט. מאגר בוראט תואם לסוכן ההפחתה נתרן בורוהידריד. מוסיפים 1-2 גרגרי נתרן בורוהידריד כדי להפחית כל דגימה ולתת לתגובה להמשיך לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר. התראה: נתרן borohydride הוא תגובתי מאוד ומסוכן לטפל - להימנע ממגע עם העור (ללבוש כפפות) ולהימנע ממגע עם העיניים (ללבוש משקפי בטיחות).
- התאם דגימות ל- pH 3-4 (הנקודה האיזואלקטרית muropeptide היא ~ 3.5) עם 50% v / v חומצה אורתופוספורית באמצעות 20 הפרשים קבועים μl עד pH 6, כפי שנמדד עם נייר מחוון pH, ולאחר מכן באמצעות 2 μl במרווחים. התראה: חומצה אורתופוספורית היא מאכלת ומסוכנת לטיפול - יש להימנע ממגע עם העור (ללבוש כפפות) ולהימנע ממגע עם העיניים (להרכיב משקפי בטיחות). המדגם צריך בועה בתגובה לתוספת של חומצה אורתופוספורית; כאשר המדגם מפסיק לבעבע, זה בדרך כלל מציין pH של 6 כבר הגיע. אם אין מבעבע מתרחשת במדגם, זה עשוי להצביע על כך שכמות הנתרן borohydride הוסיף היה קטן מדי. במקרה זה, להפסיק להוריד את ה- pH, בזהירות להוסיף אחד או שניים גרגרי נתרן borohydride, לתת להגיב במשך 5-10 דקות, ולאחר מכן לחדש את התאמת ה- pH.
- דגימת מסנן דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר ישירות לתוך בקבוקון UPLC. אם נוצר משקע, מחממים את הצינור עם מספר מעברים דרך להבה לפני הסינון. אם המדגם לא יוזרק לתוך מכשיר UPLC בתוך היום, להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס לילה. ניתן לאחסן דגימות עד שנה ב-80 °C (60 °F). המדגם יכול להיות מופשר על ידי עובר דרך להבה מספר פעמים.
- הזרק 10 μl של כל מדגם על מכשיר UPLC מצויד C18 1.7 מיקרומטר הפוך פאזה עמודה גלאי ספיגה להגדיר לפקח 202-208 ננומטר. דגימות מוזרקות ברצף, אך יכולות דגימה אוטומטית מאפשרות עיבוד של עד 96 דגימות באצווה. השתמש 50 מ"מ נתרן פוספט (pH 4.35) + 0.4% v / v נתרן אזיד עבור ממס A, ו 75 mM נתרן פוספט (pH 4.95) + 15% v / v מתנול עבור ממס B. הערה: נתרן אזיד מתווסף כדי לפצות על ספיגת 205 ננומטר של מתנול כדי למנוע דריפט בסיסי. הגדר את הזרימה ל 0.25 מיליליטר / דקה ולהשתמש הדרגתי ליניארי מעל 25 דקות כדי להשיג 100% ממס B ו elution רציף של muropeptides בתוך 30 דקות. אם ספקטרומטריית מסה תשמש לאפיון muropeptides לאחר UPLC, לאסוף שברים של שיא העניין אספן שבר לייבש את השברים באמצעות מאייד צנטריפוגלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליך המתואר באיור 1, המדגם הסופי צריך לכלול לפחות 200 μl של פתרון ברור שסונן ישירות לתוך בקבוקון UPLC (שלב 4.4). הפרדת UPLC של המורופפטידים השונים במדגם חיידקי מסתמכת על המסיסות היחסית שלהם בין השלב הנייד הנוזלי לשלב הנייח של העמודה. עמודי C18 הפוכים מספקים מטריצה הידרופובית חזקה להפרדת מינים muropeptide המבוסס על הידרופוביות וגודל8; מונופולים קוטביים, בעלי משקל מולקולרי נמוך, נוטפים ראשונים, ואוליגומרים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר נוטפים לאחר מכן (איור 2). באיור 2מוצגת תוצאת UPLC טיפוסית , עם זיהוי באמצעות ספיגת UV במהירות של 202-208 ננומטר כפונקציה של זמן הקובעת זמן שמירה מסוים של muropeptide. תוצאה מייצגת זו מראה רזולוציה ברורה בין רוב המינים muropeptide וכוח אות חזק על פני הספקטרום, המאפשר ניתוח, ואורך גדיל הגליקן הממוצע.
השלב האחרון המתואר באיור 1 כולל התאמת רמת חומציות וסינון חלקיקים עדינים שעשויים לסתום את הממדים הקטנים של הצינור המשמש ב-UPLC. אם מדגם הוא superconcentrated, למשל על ידי resuspending ב 100 μl של מאגר נתרן פוספט בשלב 3.5 במקום 200 μl, המדגם עשוי להפוך מעונן, המציין כי ריכוז קריטי הושג ואת muropeptides יש זירז. אובדן מסיסות זה יגרום לסתימת מסנן המזרק המשמש בשלב 4.4, וימנע את התצהיר של muropeptides לתוך בקבוקון UPLC ו / או סתימה של תעלות ועמודה מכונת UPLC, שהם פריטים יקרים להחליף. כרומטוגרמה לדוגמה המשקפת עיבוד מדגם חריג זה מוצגת באיור 3; אין פסגות מרוממות, וכתוצאה מכך היעדר נתונים על הרכב PG. הטעיית ה- pH הרבה מתחת לנקודה האיזואלקטרית של המורופפטידים(למשל ל- pH של 2) עלולה גם לגרום למשקעים של muropeptides ומכאן היעדר פסגות ניכרות מניתוח UPLC.
איור 1. סכמטי של הכנת סקולי. שיטה זו מסתמכת על סבבים איטרטיביים של ultracentrifugation לטהר SDS מן sacculi גלולות.
איור 2. דוגמה כרומטוגרמה UPLC של PG מ sacculi מתעכל מתאי E. coli MG1655. שים לב כי רזולוציה דומה של כל muropeptides מושגת ב 10% מהזמן של ריצת HPLC טיפוסית. תוויות Muropeptide - M = מונומר, D = עמום יותר, T = trimer; (2,3,4,5) מציינים את מספר פפטידי גזע חומצות האמינו; שינויים - G = גליצין מחליף L-אלנין, L = שתי חומצות אמינו נוספות ממחשוף Pronase E, D = 3,3-diaminopimelic חומצה (DAP)-DAP crossbridge, N = סיום anhydro-muropeptide. לדוגמה, D33DL הוא דימר עם פפטידים 3-aa גזע, מקושר דרך גשר DAP-DAP, המכיל שתי חומצות אמינו נוספות מחשוף Pronase E.
איור 3. ניתוח UPLC לא מוצלח של sacculi מתעכל מתאי אי קולי MG1655. היעדר פסגות, המציין כי לא היו muropeptides נוכח המדגם, נובע muropeptides מתרסק מתוך הפתרון לפני החילוץ לתוך בקבוקון UPLC (שלב 4.4). משקעים זה יכול להיות בגלל צריכת יתר של muropeptides או pH להיות נמוך מדי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלב קריטי בהליך זה הוא שלב 3.1 של היום השני של הכנת מדגם. אם SDS יש זירז לילה, או אם הדגימות אוחסנו 4% SDS במשך כמה שבועות בטמפרטורת החדר, הדגימות חייבות להיות reboiled לפחות 1 שעה כדי לפתור מחדש את SDS. סיבה נפוצה עבור משקעים SDS היא השימוש במדיה עם מלחי אשלגן, ולכן אשלגן יש להימנע במדיה במידת האפשר. כפי שצוין בסעיף תוצאות מייצגות, זה גם קריטי כדי להתאים את ה- pH בתוך הנקודה האיזואלקטרית של muropeptides (~ 3.5), אבל לא נמוך מדי מאשר pH 3, או החומר עשוי לזרז. לבסוף, ההשעיה מחדש של המדגם חייבת להתרחש בנפח המתאים של מאגר נתרן פוספט (שלב 3.5), אשר חייב להישפט על ידי החוקר. בעת בחירת נפח ההשעיה מחדש של חיץ נתרן פוספט, חשוב לשקול כמה חומר muropeptide צפוי להיווצר מתרבות חיידקית מסוימת. לדוגמה, אם נפח התרבות הסופי הוא 250 מ"ל, כפי שתואר לעיל, יש לעשות שימוש חוזר במדגם בלפחות 200 μl של מאגר נתרן פוספט. אם החוקר משנה את השיטה ל 50 מיליליטר תרבויות, דגימות ניתן לעשות שימוש חוזר ב 100 μl של מאגר נתרן פוספט או פחות. התחשבות בכמויות החזויות של פפטידוגליקן במין חשובה גם היא; לדוגמה, E. coli spheroplasts מכילים באופן משמעותי פחות peptidoglycan (כ 7% מהכמות בתאי E. coli מסוג בר10), ולכן ההשעיה ב 100 μl או פחות של מאגר נתרן פוספט מתאים. אם קשה לגדל מין חיידקי מסוים או זן לכמויות גדולות (250 מ"ל), ניתן להפחית את נפח התרבות הסופי ו/או להפחית את הדילול של תרבות הלילה. לבסוף, הזרקה למערכת HPLC דורשת נפח מינימלי של 200 μl, ואילו 10 μl מספיק למערכת UPLC.
ניתן לכוונן את הטיהור של רכיבי PG באורגניזמים שונים או עבור יישומים שונים על-ידי שינוי סוג השלב, העמודה והמדרגיות הניידים במכשיר UPLC. שלבים ניידים המבוססים על ממס, כגון אצטוניטריל, יכולים לשמש כדי להתפיל דגימות לפני ספקטרומטריית מסה. כימאים עמודה שונים עשויים גם להידרש כדי להתפיל דגימות ביסודיות לניתוח הבא. איור 2 מציג את פרופיל ההתרוממות הנפוץ של muropeptides עבור החיידק בצורת מוט גראם שלילי E. coli MG1655; הניתוח של PG מחיידקים גראם חיוביים ו / או מינים עם צורות אחרות עשוי לדרוש כוונון עדין של השיפוע המתואר בשלב 4.5. למרות שספקטרום UPLC כמו זה המוצג באיור 2 יוצר סוגים רבים של מידע בנוגע לפפטידוגליקן, כגון זהות מרופפטיד, אחוז הצלבה ואורך גדיל הגליקן, לשיטה יש מספר מגבלות, כולל חוסר היכולת למפות את ההתפלגות המרחבית של תכונות מבניות ברחבי sacculi. לדוגמה, לא ניתן להבחין במיקומים של הצלבות לאורך שרשרת גליקן ולא במיקומים של ליפופרוטאינים מאוגדים באמצעות HPLC או UPLC.
היתרונות של ניתוח ההרכב הכימי של PG עם HPLC כוללים רזולוציה גבוהה יותר, זמן ניתוח קצר יותר, כמויות מדויקות11 לעומת טכניקות מסורתיות כגון ניתוח חומצות אמינו12-14 או כרומטוגרפיה נייר15,16. UPLC מציעה מהירות ורגישות גבוהות יותר מאשר HPLC בשל לחצים גבוהים יותר המאפשרים זרימות מהירות יותר ולכן זמני ריצה קצרים יותר. הרזולוציה אינה מוקרבת עם UPLC, שכן העמודות בגודל חלקיקים תת-2 מיקרומטר, גלאי קצב דגימה גבוה ומזרקים בנפח נמוך מסוגלים לעמוד בלחצים גבוהים מאוד ובכך לתפקד במדויק במהירויות גבוהות17,18. התוצאה היא היכולת לנתח נפחי מדגם בסדר של 1 μl בעשרות דקות, לעומת 200 μl ושעות עבור HPLC.
טכניקות משלימות UPLC כוללות ניתוח מסה muropeptide על ידי ספקטרומטריית מסה. UPLC אינה טכניקה הרסנית; ניתן לאסוף את ההמרה מהעמודה לאחר גילוי UV ויבש באמצעות מאייד צנטריפוגלי זמין בדרך כלל ברוב המעבדות. למרות שניתן להתפיל את המדגם כדי להכין אותו לספקטרומטריית מסה (שלב 4.5), מטריקס סייעה בלייזר Desorption / Ionization - זמן הטיסה ספקטרומטריית מסה מאפשר ניתוח ללא רגישות רבה לריכוז מלח19, ומניב נתונים המוניים המסוגלים לזהות סופית של muropeptides. העלות של הכנת דגימת קיר תא אחד עבור UPLC היא כ $6-7, כולל העלויות של אנזימים, כימיקלים, ואספקה בשימוש. בהתחשב בעלויות התפעול הזולות שלה, נגישות, ואת השירות הפגינו למחקרים של דופן התא החיידקי, UPLC צריך להיות השיטה של בחירה ברזולוציה גבוהה, תפוקה גבוהה, כימות מדויק של הרכב peptidoglycan ברחבי ממלכת החיידקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
עלויות ההפקה של מאמר זה מומנו על ידי תאגיד ווטרס.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרס החדשנות החדש של מנהל NIH DP2OD006466 (ל K.C.H.). המחברים מודים לראסל מונדס על הדגמה מעשית של השיטה ועל דיונים מדעיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler |
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A.
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A.
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U.
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D'Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , Walter De Gruyter Incorporated. (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
