Summary
बैक्टीरियल सेल वॉल पेप्टिडोग्लिकन से बना है, जो पेप्टाइड्स द्वारा क्रॉसलिंक किए गए चीनी किस्में का एक मैक्रोमॉलिकुलर नेटवर्क है। अल्ट्रा परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी पेप्टिडोगलाइकन संरचना की उपन्यास खोजों के लिए उच्च संकल्प और थ्रूपुट प्रदान करता है। हम सेल दीवारों (sacculi) के अलगाव और UPLC के माध्यम से विश्लेषण के लिए उनके बाद की तैयारी के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
जीवाणु कोशिका दीवार विकास और विभाजन के दौरान कोशिका आकार के निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है, और टर्गोर दबाव के चेहरे में कोशिकाओं की यांत्रिक अखंडता को बनाए रखता है परिमाण में कई वायुमंडल । बैक्टीरियल साम्राज्य के विविध आकारों और आकारों में, सेल की दीवार पेप्टिडोगलाइकन से बनी है, जो शॉर्ट पेप्टाइड्स द्वारा क्रॉसलिंक किए गए चीनी किस्में का एक मैक्रोमॉलिकुलर नेटवर्क है। जीवाणु शरीर विज्ञान के लिए पेप्टिडोग्लीकन का केंद्रीय महत्व एंटीबायोटिक लक्ष्य के रूप में इसके उपयोग को रेखांकित करता है और आनुवंशिक, संरचनात्मक और सेल जैविक अध्ययनों को प्रेरित करता है कि यह विकास और विभाजन के दौरान कैसे मजबूती से इकट्ठा किया जाता है। फिर भी, व्यापक जांच अभी भी पूरी तरह से पेप्टिडोगलाइकन संश्लेषण और जीवाणु कोशिका दीवारों की रासायनिक संरचना में प्रमुख एंजाइमेटिक गतिविधियों की विशेषता के लिए आवश्यक हैं । उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) विभिन्न प्रकार के पर्यावरणीय और आनुवंशिक स्थितियों के तहत उगाए जाने वाले बैक्टीरिया की दीवारों की रासायनिक संरचना में अंतर की मात्रा के लिए एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक विधि है, लेकिन इसका थ्रूपुट अक्सर सीमित होता है। यहां, हम एचपीएलसी और अल्ट्रा परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (यूपीएलसी) के माध्यम से पेप्टिडोगलाइकन के जैविक विश्लेषणों के लिए बैक्टीरियल सेल दीवारों के अलगाव और तैयारी के लिए एक सीधी प्रक्रिया पेश करते हैं, जो एचपीएलसी का विस्तार है जो एचपीएलसी के लिए 15,000 साई तक के अल्ट्रा-हाई दबाव देने के लिए पंपों का उपयोग करता है, जबकि एचपीएलसी के लिए 6,000 साई की तुलना में। यहां प्रस्तुत बैक्टीरियल सेल दीवारों की तैयारी के संयोजन में, कम मात्रा वाले नमूना इंजेक्टर, उच्च नमूना दरों के साथ डिटेक्टर, छोटे नमूना मात्रा, और यूपीएलसी के छोटे रन समय एक अल्ट्रासेंट्राइज और यूपीएलसी तक पहुंच के साथ अधिकांश जैविक प्रयोगशालाओं में पेप्टिडॉगलाइकन संरचना और मौलिक जीवाणु कोशिका जीव विज्ञान की नवीन खोजों के लिए उच्च संकल्प और थ्रूपुट को सक्षम करेंगे।
Introduction
यहां वर्णित विधि का लक्ष्य बरकरार बैक्टीरियल सेल दीवारों (सैकुली) को अलग करना और पेप्टिडोग्लोलिकैन (पीजी) को पचाने के लिए है, जैसे कि अल्ट्रा परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (यूपीएलसी) का उपयोग मुरोपेप्टाइड घटकों और उनकी सांद्रता की पहचान, ग्लाइकैन किस्में की औसत लंबाई और किस्में के बीच क्रॉसलिंक में शामिल सामग्री के अंश जैसी जानकारी प्रदान करने के लिए किया जा सकता है। पीजी बायोकेमिस्ट्री और मुराोपेप्टाइड प्रजातियों की विस्तृत चर्चा के लिए, कई उत्कृष्ट समीक्षाएं हैं जो पीजी संरचना और संक्रमण, प्रतिरोध, मॉर्फोजेनेसिस और विकास1-6में इसकी भूमिका का वर्णन करती हैं। पीजी विश्लेषण के लिए उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) शुरू में 1980 के दशक में ग्लैनर और श्वार्ज द्वारा विकसित किया गया था, और हाल ही में मिगुएल डी पेड्रो और वाल्डेमार वोल्मर की प्रयोगशालाओं में बड़े पैमाने पर बढ़ाया गया है और लागू किया गया है। पिछले तरीकों में अमीनो एसिड विश्लेषण या पेपर क्रोमेटोग्राफी, समय लेने वाली और थकाऊ तकनीकों का उपयोग किया गया था जो सेल-वॉल घटकों का सटीक या पूर्ण आकलन नहीं करते हैं।
यूपीएलसी विश्लेषण को किसी भी बुनियादी अनुसंधान प्रयोगशाला में आसानी से लागू किया जा सकता है जिसकी पहुंच अल्ट्रासेंट्रफ्यूज और यूपीएलसी तक है। यूपीएलसी विधि जो हम नीचे प्रस्तुत करते हैं, वह पूर्ण सैकुली को अलग करती है, जिससे उसमें सभी रासायनिक प्रजातियों के बारे में व्यापक, मात्रात्मक जानकारी प्रदान की जा सके । यह विधि बैक्टीरिया की आबादी में सभी मुरोपेप्टाइड्स की सटीक मात्रा पैदा करता है, सभी एक 20 मिनट UPLC रन के भीतर । इस विधि के कार्यान्वयन में सामग्री में महत्वपूर्ण वित्तीय निवेश के बिना केवल बुनियादी प्रयोगशाला कौशल शामिल है। इस विधि में कदमों को निष्पादित करने के लिए, शोधकर्ताओं को केवल पाइपिंग, बफ़र्स और एंजाइमों को तैयार करने और पीएच को समायोजित करने में कुशल होने की आवश्यकता है, जिससे यह वैज्ञानिक विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए सुलभ हो सके । इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एंजाइमों की पसंद जीवाणु की प्रजातियों का विश्लेषण किए जाने पर निर्भर करती है; यहां वर्णित प्रोटोकॉल एस्चेरिचिया कोलाईके लिए उपयोगी है, और आम तौर पर अन्य ग्राम-नकारात्मक जीवों से सैकुली को अलग करने के लिए पर्याप्त पाया गया है। इस विधि को ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया पर लागू करते समय साहित्य के साथ परामर्श की सिफारिश की जाती है; इन प्रजातियों में, सैकुलस शुद्धि पारंपरिक रूप से अधिक कठिन रही है। विशेष रूप से, इस विधि को एंजाइम पसंद और पाचन समय की लंबाई के संदर्भ में बदलना पड़ सकता है ताकि ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया के टेचोइक एसिड जैसे मोटी दीवारों और सहायक बहुलकों को समायोजित किया जा सके। इस प्रोटोकॉल में पहला एंजाइम पेप्टिडोग्लाइकन के लिए बाहरी झिल्ली लिपोप्रोटीन (जैसे ब्रून के लिपोप्रोटीन, या एलपीपी) लगाव को क्षमा करता है, जिससे सेल की दीवार से एलपीपी के सी-टर्मिनल डी-(या त्रिकोणीय) पेप्टाइड सभी को जारी किया जाता है। एंटेरोबैक्टीरिया की जांच करते समय यह कदम आवश्यक है, लेकिन कई अन्य ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में कोई एलपीपी समकक्ष नहीं होता है, और इसलिए इस कदम को छोड़ दिया जा सकता है। पेप्टिडोग्लाइकन के मुरामिक एसिड घटक के बाद एक दूसरा एंजाइम विशेष रूप से क्लीव्स, डिस्चाराइड सबयूनिट को सोलूबिलाइज करता है जो मुरोपेप्टाइड प्रजाति बनाता है। पीजी की वास्तुकला का सटीक आकलन प्रदान करने के लिए, क्रॉसब्रिज या पेप्टाइड स्टेम के किसी अन्य हिस्से के दरार को रोकने के लिए सैकुली को पचाने में सावधानी बरती जानी चाहिए।
यद्यपि एचपीएलसी द्वारा ~ 40 जीवाणु प्रजातियों के 100 से अधिक उपभेदों से पेप्टिडोगलाइकन की रासायनिक रचनाओं का विश्लेषण किया गया है, लेकिन यूपीएलसी प्रौद्योगिकी के साथ कोई विश्लेषण नहीं किया गया है। इसके अलावा, पिछले काम ने एचपीएलसी के थ्रूपुट द्वारा सीमित हिस्से में बैक्टीरियल डोमेन के केवल एक छोटे से अंश से पेप्टिडोगलाइकन की विशेषता है। इसलिए, इस विधि का प्रचार-प्रसार यथासंभव अधिक से अधिक शोधकर्ताओं के लिए, और यूपीएलसी प्लेटफार्मों पर कार्यान्वयन, जीवाणु प्रजातियों के बड़े अंश के शारीरिक अध्ययन को चलाने के लिए महत्वपूर्ण होगा, जिनके पेप्टिडोग्वालिकर को अभी तक वर्गीकृत किया जाना है।
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Protocol
1. रातोंरात मीडिया के 2.5 मिलीलीटर में बैक्टीरियल संस्कृतियों को बढ़ाएं
वापस पतला संस्कृतियों 1:100 ताजा मीडिया के २५० मिलीलीटर में और0.7-0.8 के ओडी ६०० के लिए हो जाना । पानी में 6% सोडियम डॉडेसिल सल्फेट (एसडीएस) का घोल तैयार करें।
सावधानी: एसडीएस पाउडर खतरनाक है - एसडीएस पाउडर को साँस लेने से बचें; नाक और मुंह पर एक मुखौटा पहनें।
2. दिन 1 - Lysing बैक्टीरियल संस्कृतियों एक दिन और रात भर के पाठ्यक्रम पर किया जाता है
- जबकि पतला संस्कृतियों बढ़ रहे हैं, एक 1 एल बीकर में एक गर्म थाली पर एक उबलते पानी स्नान की स्थापना की । एक बार पानी उबलने के बाद, 50 मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में 6% एसडीएस के 6 मिलीलीटर, प्रत्येक ट्यूब में एक छोटा हलचल बार जोड़ें, उंगली-तंग करने के लिए ट्यूब ढक्कन सुरक्षित करें, पानी के स्नान में ट्यूब रखें, और गर्म प्लेट पर 500 आरपीएम तक सरगर्मी चालू करें।
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 5,000 × जी पर 250 मिलीलीटर संस्कृतियों की कटाई करें और 3 मिलीलीटर मीडिया या 1x फॉस्फेट-बफर खारा में छर्रों को फिर से खर्च करें। धीरे-धीरे पिपेट सेल कोशिकाओं (अंतिम एकाग्रता 4% एसडीएस) को lyse करने के लिए 6% उबलते एसडीएस के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूबों में निलंबन करता है, जबकि ट्यूब उबलते पानी के स्नान में डूबे होते हैं, और ढक्कन को उंगली-तंग करने के लिए फिर से बंद कर देते हैं। सेल निलंबन जल्दी से उबलते SDS में स्थानांतरित किया जाना चाहिए एक बार फिर से निलंबित कर दिया । अचानक पर्यावरणीय परिवर्तनों से बचा जाना चाहिए, क्योंकि इससे सेल की दीवार संरचना में गलत परिवर्तन हो सकताहै।
- उबलते पानी स्नान को कवर करें और कोशिकाओं को 3 घंटे के लिए उबालने की अनुमति दें, समय-समय पर पानी के स्तर की जांच करें और आवश्यक होने पर पानी स्नान को फिर से भरें। 3 घंटे के बाद, गर्म थाली के हीटिंग तत्व को बंद कर दें, और 500 आरपीएम पर रात भर हलचल जारी रखें।
3. दिन 2 - एंजाइमेटिक पाचन एक दिन के पाठ्यक्रम पर किया जाता है
- यदि एसडीएस रात भर 50 मिलीलीटर ट्यूबों में उपजी है, तो अतिरिक्त 1-2 घंटे के लिए उबालने के लिए पानी स्नान सेट करें। 60 डिग्री सेल्सियस तक हीट ब्लॉक चालू करें। 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.2) + 0.06% w/v NaCl में प्रोनेस ई का 1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक तैयार करें और कम से कम 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर प्रोनेस ई को सक्रिय करें।
- बड़े पीजी पॉलिमर को गोली मारने और इस तरह उन्हें अन्य सेलुलर घटकों से शुद्ध करने के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए नमूनों को स्पिन करने के लिए 400,× जी पर एक अल्ट्रासेंट्रफ्यूज सेट का उपयोग करें। सुपरनेट को ध्यान से निकालें, और फिर प्रत्येक गोली को कमरे के तापमान अल्ट्रापुरे पानी में फिर से व्यतीत करें। नोट: पुनर्पेजन की मात्रा उपयोग की जाने वाली अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों की मात्रा पर निर्भर करती है; एक मात्रा का उपयोग करें जो ट्यूबों को कम से कम आधा रास्ता भरता है लेकिन ट्यूबों की अधिकतम मात्रा से अधिक नहीं होता है। जब तक पानी पुनःपन्नने के दौरान बुलबुले नहीं बनाता है, तब तक अपकेंद्रित्र/धोने दोहराएं, यह दर्शाता है कि एसडीएस को पूरी तरह से हटा दिया गया है (आमतौर पर तीन वॉश)। यदि एक सफेद वर्षा रूपों को धोना बंद कर दें, क्योंकि यह इंगित करता है कि सैकुली एक साथ झुरमुट हैं। झुरमुट भयावह नहीं है, लेकिन झुरमुट प्लास्टिक और कांच के बर्तनों के लिए बहुत दृढ़ता से बांधते हैं जिससे बड़े नमूना नुकसान होते हैं। इस मामले में, झुरमुट सैकुली नमूने का उपयोग करके प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।
- अंतिम अपकेंद्रित्र/वाशिंग स्टेप पर, 10 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.2) + 0.06% डब्ल्यू/वी एनएसीएल के 900 माइक्रोन में नमूनों को फिर से खर्च करें और 2 मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें जो पहले एक छोटी सुई के साथ सबसे ऊपर में छेद के साथ प्रहार किया गया था। प्रत्येक नमूने में 1 मिलीग्राम/मिलीग्राम सक्रिय प्रोनेस ई (100 माइक्रोन/मिलीग्राम अंतिम एकाग्रता) का 100 माइक्रोन जोड़ें और 2 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 100 डिग्री सेल्सियस के लिए एक अलग गर्मी ब्लॉक सेट करें।
- प्रत्येक नमूने में 6% एसडीएस के 200 माइक्रोन जोड़कर प्रोनेस ई पाचन को रोकें और नमूनों को 30 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में उबालें। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक अलग हीट ब्लॉक सेट करें और 50 m m फॉस्फेट बफर (पीएच 4.9) में मुरमिडेस (mutanolysin) का 1 मिलीग्राम/मिलीग्राम स्टॉक बनाएं।
- चरण 3.2 के रूप में, कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए नमूनों को स्पिन करने के लिए 400,× जी पर एक अल्ट्रासेंट्रफ्यूज सेट का उपयोग करें और कमरे के तापमान अल्ट्रापुरे पानी से धोएं जब तक कि एसडीएस पूरी तरह से हटा न जाए (आमतौर पर तीन वॉश)। पुन:पित करने की मात्रा उपयोग की जाने वाली अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों की मात्रा पर निर्भर करती है; एक मात्रा का उपयोग करें जो ट्यूबों को कम से कम आधा रास्ता भरता है लेकिन ट्यूबों की अधिकतम मात्रा से अधिक नहीं होता है।
- अंतिम अपकेंद्रित्र/वाशिंग स्टेप पर, 50 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच 4.9) के 200 माइक्रोल में नमूने ों को फिर से उठाया। इस मात्रा को नमूने में पेप्टिडोगलाइकन की मात्रा के अनुसार समायोजित किया जा सकता है, और प्रजातियों पर निर्भर हो सकता है। यदि ब्याज की प्रजातियों के लिए एचपीएलसी विश्लेषण की पहले प्रकाशित रिपोर्टें हैं, तो इन क्वांटिटेशन के आधार पर इस मात्रा का अनुमान लगाया जा सकता है (एचपीएलसी पीजी अध्ययनों का संकलन संदर्भ7की पूरक जानकारी में पाया जा सकता है)। अन्य प्रजातियों के लिए, सैकुलस प्रेप को इस चरण तक निष्पादित किया जा सकता है और फिर न्यूनतम मात्रा निर्धारित करने के लिए नमूनों को दोहराने के लिए पुनर्संपन्न मात्रा की विभिन्न मात्रा जोड़ी जा सकती है जो पीजी को समाधान में रहने की अनुमति देती है (आगे के अनुमानों के लिए चर्चा देखें)। यदि नमूने में अधिक पेप्टिडोग्वालिकन होता है, तो पुनर्प्रेमी की मात्रा बढ़ाएं; यदि नमूने में थोड़ा पेप्टिडोग्लिकन है, तो पुनर्प्राप्ति की मात्रा को कम से कम 50 माइक्रोन तक कम करें।
- नमूनों को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और 40 माइक्रोग्राम/मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता देने के लिए 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर मुरामिडेस जोड़ें। 6-8 घंटे या रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
4. दिन 3-UPLC के लिए नमूनों की तैयारी अंतिम दिन किया जाता है
- 100 डिग्री सेल्सियस तक हीट ब्लॉक चालू करें। मुरमिडाज पाचन को रोकने के लिए 5 मिनट के लिए एसडीएस के बिना नमूनों को उबालें। कमरे के तापमान पर 16,000 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज नमूने, फिर सुपरनेट (मुरोपेप्टाइड्स अब घुलनशील हैं) को 13 मिमी x 100 मिमी ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित करें। जितना संभव हो उतना सुपरनेट ठीक करने की कोशिश करें, इसे परेशान किए बिना गोली के बहुत करीब हो रहे हैं।
- 100 एमएल बोरेट बफर की अंतिम एकाग्रता के लिए नमूने में 500 m m borate बफर (पीएच 9) जोड़कर पीएच को समायोजित करें। बोरेट बफर कम करने वाले एजेंट सोडियम बोरोहाइड्राइड के साथ संगत है। प्रत्येक नमूने को कम करने के लिए सोडियम बोरोहाइडाइड के 1-2 अनाज जोड़ें और प्रतिक्रिया को कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए आगे बढ़ने दें। सावधानी: सोडियम बोरोहाइड्राइड अत्यधिक प्रतिक्रियाशील और संभालना खतरनाक है - त्वचा के संपर्क से बचें (दस्ताने पहनें) और आंखों के संपर्क से बचें (सुरक्षा चश्मा पहनें)।
- पीएच 6 तक 20 माइक्रोन वेतन वृद्धि का उपयोग करके 50% v/v ऑर्थोफोस्फोरिक एसिड के साथ पीएच 3-4 (मुरोपेप्टाइड आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट ~ 3.5 है) के नमूनों को समायोजित करें, जैसा कि पीएच संकेतक पेपर के साथ मापा जाता है, फिर 2 माइक्रोल वेतन वृद्धि का उपयोग करके। सावधानी: ऑर्थोफोस्फोरिक एसिड संक्षारक और संभालना खतरनाक है - त्वचा के संपर्क से बचें (दस्ताने पहनें) और आंखों के संपर्क से बचें (सुरक्षा चश्मा पहनें)। नमूने को ऑर्थोफोस्फोरिक एसिड के अलावा के जवाब में बुलबुला होना चाहिए; जब नमूना बुदबुदाता बंद हो जाता है, तो यह आमतौर पर इंगित करता है कि 6 का पीएच पहुंच गया है। यदि नमूने में कोई बुदबुदाती नहीं होती है, तो यह इंगित कर सकता है कि सोडियम बोरोहाइड्राइड की मात्रा बहुत छोटी थी। इस मामले में, पीएच को कम करना बंद करें, ध्यान से सोडियम बोरोहाइड्राइड के एक या दो अनाज जोड़ें, 5-10 मिनट के लिए प्रतिक्रिया दें, फिर पीएच समायोजन फिर से शुरू करें।
- एक 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से नमूना सीधे एक UPLC शीशी में फ़िल्टर करें। यदि एक तेज़ी का गठन किया है, तो ट्यूब को छानने से पहले एक लौ के माध्यम से कई से गुजरता है। यदि नमूना दिन के भीतर यूपीएलसी उपकरण में इंजेक्ट नहीं किया जाएगा, तो रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर एक साल तक संग्रहीत किया जा सकता है। कई बार एक लौ से गुजरकर सैंपल को गल सकता है।
- 202-208 एनएम की निगरानी के लिए सी 18 1.7 माइक्रोन रिवर्स-फेज कॉलम और एक अवशोषण डिटेक्टर सेट से लैस एक यूपीएलसी उपकरण पर प्रत्येक नमूने के 10 माइक्रोन इंजेक्ट करें। नमूनों को क्रमिक रूप से इंजेक्ट किया जाता है, लेकिन ऑटोसम्पलर क्षमताएं बैच में ९६ नमूनों को संसाधित करने की अनुमति देती हैं । सॉल्वेंट ए के लिए 50 एमएम सोडियम फॉस्फेट (पीएच 4.35) + 0.4% v/v सोडियम एजाइड का उपयोग करें, और 75 mm सोडियम फॉस्फेट (पीएच 4.95) + 15% v/v मेथनॉल सॉल्वेंट बी नोट के लिए: सोडियम एजाइड को बहाव से बचने के लिए मेथनॉल के 205 एनएम अवशोषण की भरपाई के लिए जोड़ा जाता है। प्रवाह को 0.25 मिलीलीटर/मिनट तक सेट करें और 100% सॉल्वेंट बी प्राप्त करने के लिए 25 मिनट से अधिक रैखिक ढाल का उपयोग करें और 30 मिनट के भीतर मुरोपेप्टाइड्स के अनुक्रमिक एल्यूशन को प्राप्त करें। यदि यूपीएलसी के बाद मुरोपेप्टाइड्स की विशेषता के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग किया जाएगा, तो एक अंश कलेक्टर में ब्याज की चोटी के अंशों को इकट्ठा करें और एक अपकेंद्रित्र वाष्पीकरण का उपयोग करके अंशों को सुखाएं।
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Representative Results
चित्रा 1में उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, अंतिम नमूने में कम से कम 200 माइक्रोन स्पष्ट समाधान होना चाहिए जिसे सीधे यूपीएलसी शीशी (चरण 4.4) में फ़िल्टर किया गया है। एक जीवाणु नमूने में विभिन्न मुरोपेप्टाइड्स का यूपीएलसी पृथक्करण तरल मोबाइल चरण और कॉलम के स्थिर चरण के बीच उनकी सापेक्ष घुलनशीलता पर निर्भर करता है। उत्क्रमित चरण C18 कॉलम हाइड्रोफोबिकिटी और आकार8के आधार पर मुरोपेप्टाइड प्रजातियों को अलग करने के लिए एक दृढ़ता से हाइड्रोफोबिक मैट्रिक्स प्रदान करते हैं; ध्रुवीय, कम आणविक वजन मोनोमर पहले, और ध्रुव, उच्च आणविक वजन ओलिगोमर के बाद(चित्रा 2)elute । एक विशिष्ट यूपीएलसी परिणाम चित्रा 2में दिखाया गया है, जिसमें 202-208 एनएम पर यूवी अवशोषण के माध्यम से पता लगाया जाता है, जो एक विशेष मुरोपेप्टाइड के प्रतिधारण समय को स्थापित करता है। यह प्रतिनिधि परिणाम अधिकांश मुरोपेप्टाइड प्रजातियों और स्पेक्ट्रम में मजबूत संकेत शक्ति के बीच स्पष्ट संकल्प दिखाता है, जो विश्लेषण, और औसत ग्लाइकैन स्ट्रैंड लंबाई को सक्षम बनाता है।
चित्रा 1 में उल्लिखित अंतिम चरण में पीएच को समायोजित करना और किसी भी अच्छे कण को फ़िल्टर करना शामिल है जो यूपीएलसी में उपयोग किए जाने वाले ट्यूबिंग के छोटे आयामों को रोक सकता है। यदि किसी नमूने को सुपरकॉन्टेड किया जाता है, उदाहरण के लिए 200 माइक्रोन के बजाय चरण 3.5 में सोडियम फॉस्फेट बफर के 100 माइक्रोन में पुनर्व्यय करके, नमूना बादल बदल सकता है, यह दर्शाता है कि एक महत्वपूर्ण एकाग्रता प्राप्त की गई है और मुरोपेप्टाइड्स उपजी है। घुलनशीलता के इस नुकसान के परिणामस्वरूप चरण ४.४ में उपयोग किए जाने वाले सिरिंज फिल्टर को अवरुद्ध किया जा सकेगा, जिससे यूपीएलसी शीशी में मुरोपेपीड्स के जमाव को रोका जा सकेगा और/या यूपीएलसी मशीन नाली और कॉलम का क्लोजिंग होगा, जो प्रतिस्थापित करने के लिए महंगी वस्तुएं हैं । इस गुमराह नमूना प्रसंस्करण को दर्शाते हुए एक उदाहरण क्रोमेटोग्राम चित्र 3में दिखाया गया है ; कोई चोटियों eluted, पीजी संरचना पर किसी भी डेटा के अभाव में जिसके परिणामस्वरूप । पीएच को मुरोपेप्टाइड्स(उदाहरण के लिए 2 के पीएच के लिए) के आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु से अच्छी तरह से नीचे करने के लिए गलत निर्णय लेने से भी मुरोपेप्टाइड्स की वर्षा हो सकती है और इसलिए यूपीएलसी विश्लेषण से प्रत्यक्ष चोटियों की अनुपस्थिति हो सकती है।
चित्रा 1. सैकुली तैयारी की योजनाबद्ध। यह विधि गोली के थैली से दूर एसडीएस को शुद्ध करने के लिए अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन के पुनरावृत्ति दौर पर निर्भर करती है।
चित्रा 2। उदाहरण ई कोलाई MG1655 कोशिकाओं से पचा थैलीसी से पीजी के यूपीएलसी क्रोमेटोग्राम। ध्यान दें कि सभी मुरापेनपिड्स का तुलनीय संकल्प एक विशिष्ट एचपीएलसी रन के समय के 10% में प्राप्त किया जाता है। मुरोपेप्टाइड लेबल - एम = मोनोमर, डी = डिमर, टी = ट्रिमर; (2,3,4,5) अमीनो एसिड स्टेम पेप्टाइड्स की संख्या का संकेत देता है; संशोधन - जी = ग्लाइसिन एल-एलेनिन की जगह, एल = प्रोसे ई क्लीवेज, डी = 3,3-डायमिनोपीिलिक एसिड (डीएपी) से दो अतिरिक्त अमीनो एसिड- डीएपी क्रॉसब्रिज, एन = समाप्त एंहाइड्रो-मुरोपेप्टाइड। उदाहरण के लिए, D33DL 3-एए स्टेम पेप्टाइड्स के साथ एक डिमर है, जो डीएपी-डीएपी क्रॉसब्रिज के माध्यम से जुड़ा हुआ है, जिसमें प्रोनेज ई क्लीवेज से अतिरिक्त दो अमीनो एसिड होते हैं।
चित्र 3। ई. कोलाई MG1655 कोशिकाओं से पचा थैलीकुली के असफल UPLC विश्लेषण। चोटियों की अनुपस्थिति, यह दर्शाता है कि नमूने में कोई मुरोपेप्टाइड मौजूद नहीं था, एक यूपीएलसी शीशी (चरण 4.4) में निष्कर्षण से पहले समाधान से बाहर निकलने वाले मुरोपेप्टिड्स के कारण है। यह वर्षा मुरोपेप्टाइड्स के अतिप्रतिष्ठान या पीएच के बहुत कम होने के कारण हो सकती है ।
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Discussion
इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम नमूना तैयार करने के दूसरे दिन का चरण 3.1 है। यदि एसडीएस रात भर उपजी है, या यदि नमूनों को कमरे के तापमान पर कई हफ्तों के लिए 4% एसडीएस में संग्रहीत किया गया है, तो नमूनों को एसडीएस को फिर से समाप्त करने के लिए कम से 1 घंटे के लिए फिर से गिराया जाना चाहिए । एसडीएस वर्षा के लिए एक आम कारण पोटेशियम लवण के साथ मीडिया का उपयोग है, इसलिए यदि संभव हो तो मीडिया में पोटेशियम से बचा जाना चाहिए। जैसा कि प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उल्लेख किया गया है, पीएच को मुरोपेप्टिड्स (~ 3.5) के आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु के भीतर समायोजित करना भी महत्वपूर्ण है, लेकिन पीएच 3 की तुलना में बहुत कम नहीं है, या सामग्री तेज़ हो सकती है। अंत में, नमूने का पुनर्प्रापन्न सोडियम फॉस्फेट बफर (चरण 3.5) की उचित मात्रा में होना चाहिए, जिसे शोधकर्ता द्वारा आंका जाना चाहिए। सोडियम फॉस्फेट बफर की रीसोपेन की मात्रा चुनते समय, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि किसी विशेष जीवाणु संस्कृति से कितना मुराोपेप्टाइड सामग्री उत्पन्न होने की संभावना है। उदाहरण के लिए, यदि अंतिम संस्कृति की मात्रा 250 मिलीलीटर है, जैसा कि ऊपर उल्लिखित है, तो नमूने को सोडियम फॉस्फेट बफर के कम से कम 200 माइक्रोन में फिर से निलंबित किया जाना चाहिए। यदि शोधकर्ता विधि को 50 मिलीलीटर संस्कृतियों में संशोधित करता है, तो नमूनों को सोडियम फॉस्फेट बफर या उससे कम के 100 माइक्रोल में फिर से निलंबित किया जा सकता है। एक प्रजाति में पेप्टिडोगलाइकन की अनुमानित मात्रा पर विचार करना भी महत्वपूर्ण है; उदाहरण के लिए, ई कोलाई स्पेरोप्लास्लास्ट में काफी कम पेप्टिडोग्लाइकन (जंगली प्रकार ई. कोलाई कोशिकाओं10में राशि का लगभग 7%), और इसलिए 100 माइक्रोन या सोडियम फॉस्फेट बफर के कम में पुनर्प्राप्ति उचित है। यदि एक निश्चित जीवाणु प्रजातियों को विकसित करना मुश्किल है या बड़ी मात्रा (२५० मिलीलीटर) के लिए तनाव है, तो अंतिम संस्कृति की मात्रा को कम किया जा सकता है और/या रातोंरात संस्कृति को कमजोर किया जा सकता है । अंत में, एचपीएलसी प्रणाली पर इंजेक्शन के लिए न्यूनतम मात्रा 200 माइक्रोन की आवश्यकता होती है, जबकि 10 माइक्रोन एक यूपीएलसी प्रणाली के लिए पर्याप्त है।
विभिन्न जीवों में या विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए पीजी घटकों की शुद्धि को यूपीएलसी उपकरण पर मोबाइल चरण, कॉलम और ढाल के प्रकार को अलग-अलग करके ट्यून किया जा सकता है। मोबाइल चरण जो सॉल्वेंट-आधारित हैं, जैसे एसिटोनिट्रिल, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले नमूनों को डीसाल्ट करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। बाद के विश्लेषण के लिए नमूनों को अच्छी तरह से डीसाल्ट करने के लिए विभिन्न कॉलम रसायनों की भी आवश्यकता हो सकती है। चित्रा 2 ग्राम-नकारात्मक रॉड के आकार के जीवाणु ई. कोलाई MG1655 के लिए मुरोपेप्टाइड्स के आम एल्यूशन प्रोफाइल को दिखाता है; ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया और/या अन्य आकृतियों वाली प्रजातियों से पीजी के विश्लेषण के लिए कदम ४.५ में उल्लिखित ढाल की ठीक ट्यूनिंग की आवश्यकता हो सकती है । यद्यपि यूपीएलसी स्पेक्ट्रा जैसे कि चित्र 2 में दिखाया गया है, पेप्टिडॉगलाइकन से संबंधित कई वर्ग उत्पन्न करता है, जैसे कि मुरोपेप्टाइड पहचान, क्रॉसलिंकिंग प्रतिशत, और ग्लाइकैन स्ट्रैंड लंबाई, विधि में कई सीमाएं हैं, जिनमें सैकुली में संरचनात्मक सुविधाओं के स्थानिक वितरण को मैप करने में असमर्थता शामिल है। उदाहरण के लिए, न तो ग्लाइकन श्रृंखला के साथ क्रॉसब्रीडिंग के स्थानों और न ही बाध्य लिपोप्रोटीन के स्थानों को एचपीएलसी या यूपीएलसी के माध्यम से समझा जा सकता है।
एचपीएलसी के साथ पीजी की रासायनिक संरचना का विश्लेषण करने के फायदों में अमीनो एसिड विश्लेषण12-14 या पेपर क्रोमेटोग्राफी15, 16 जैसी पारंपरिक तकनीकों की तुलना में उच्चसंकल्प,कम विश्लेषण समय और सटीक मात्रा11शामिल हैं। यूपीएलसी उच्च दबावों के कारण एचपीएलसी की तुलना में उच्च गति और संवेदनशीलता प्रदान करता है जो तेजी से प्रवाह को सक्षम करता है और इसलिए कम रन बार। संकल्प UPLC के साथ बलिदान नहीं है, के रूप में उप-2 μm कण आकार कॉलम, उच्च नमूना दर डिटेक्टरों, और कम मात्रा इंजेक्टर बहुत उच्च दबाव का सामना करने में सक्षम है और इस तरह उच्च गति17,18पर सही कार्य करते हैं । इसके परिणामस्वरूप एचपीएलसी के लिए 200 माइक्रोन और घंटों की तुलना में दसियों मिनट में 1 माइक्रोन के आदेश पर नमूना संस्करणों का विश्लेषण करने की क्षमता होती है।
यूपीएलसी के पूरक तकनीकों में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मुरोपेप्टाइड मास विश्लेषण शामिल है। यूपीएलसी एक विनाशकारी तकनीक नहीं है; कॉलम से एल्यूएट को यूवी डिटेक्शन के बाद एकत्र किया जा सकता है और अधिकांश प्रयोगशालाओं में आमतौर पर उपलब्ध एक अपकेंद्रित्र वाष्पीकरण का उपयोग करके सूखा जा सकता है। हालांकि नमूने को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (चरण 4.5) के लिए तैयार करने के लिए डीसाल्ट किया जा सकता है, मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर डेसोरपशन/आयनीकरण - उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री का समय नमक एकाग्रता19के प्रति अधिक संवेदनशीलता के बिना विश्लेषण को सक्षम बनाता है, और बड़े पैमाने पर डेटा पैदा करता है जो मुरोपेप्टाइड्स की निश्चित पहचान करने में सक्षम है। यूपीएलसी के लिए एक सेल वॉल नमूना तैयार करने की लागत लगभग $ 6-7 है, जिसमें एंजाइमों, रसायनों और उपयोग की जाने वाली आपूर्ति की लागत शामिल है। बैक्टीरियल सेल दीवार के अध्ययन के लिए इसकी सस्ती रनिंग लागत, पहुंच और प्रदर्शित उपयोगिता को देखते हुए, यूपीएलसी को बैक्टीरियल साम्राज्य में पेप्टिडोगलाइकन संरचना के उच्च-रिज़ॉल्यूशन, उच्च-थ्रूपुट, सटीक मात्राकरण के लिए पसंद की विधि बनना चाहिए।
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Disclosures
इस लेख के लिए उत्पादन लागत जल निगम द्वारा प्रायोजित किया गया ।
Acknowledgments
इस काम को एनआईएच निदेशक के नए इनोवेटर पुरस्कार DP2OD006466 (K.C.H.) द्वारा समर्थित किया गया था । लेखकों विधि के एक व्यावहारिक प्रदर्शन के लिए और वैज्ञानिक चर्चा के लिए रसेल Monds शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler |
References
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