Summary
Till skillnad från cellfria HIV-1-partiklar, är infekterade CD4 + T-celler effektivt avkänns av plasmacytoid dendritiska celler (pDCs). Detta manuskript beskriver ett förfarande där perifera mononukleära blodceller (PBMC) eller isolerade pDCs är samodlade med HIV-1 infekterade T-celler för att utvärdera medfödd avkänning av pDCs såsom fastställts genom frisättning av typ I-IFN.
Abstract
HIV-1 medfödd avkänning kräver direkt kontakt mellan infekterade CD4 + T-celler med plasmacytoid dendritiska celler (pDCs). För att studera denna process, de protokoll som beskrivs här använder färskt isolerade humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) eller plasmacytoid dendritceller (pDCs) att avkänna infektioner i antingen T-cellinje (MT4) eller heterologa primära CD4 + T-celler. För att säkerställa en korrekt avkänning, är det väsentligt att PBMC isoleras omedelbart efter bloduppsamling och att optimal procentandel av infekterade T-celler användes. Dessutom kan flera parametrisk flödescytometrisk färgning användas för att bekräfta att PBMC prover innehåller olika cellinjer vid fysiologiska förhållanden. Ett antal kontroller kan också inkluderas för att utvärdera lönsamheten och funktionalitet pDCs. Dessa innefattar, närvaron av specifika ytmarkörer, bedöma cellulära svar till känd agonist till Toll-liknande receptorer (TLR) vägar, och som bekräftar en brist på spontaneous typ I interferon (IFN) produktion. I detta system, nyligen isolerade PBMC eller pDCs är samodlade med HIV-1 infekterade celler i plattor med 96 brunnar för 18-22 timmar. Supematanter från dessa samodlingar används sedan för att bestämma halter av bioaktiva typ-I IFN genom övervakning av aktivering av ISGF3 vägen i HEK-Blue-IFN-a / P-celler. Före och under samtidig odlingsbetingelser, kan målceller genomgå flödescytometrisk analys för att fastställa ett antal parametrar, inklusive procentsatsen av infekterade celler, nivåer av specifika ytmarkörer, och differentiell dödande av infekterade celler. Även dessa protokoll ursprungligen utvecklats för att följa typ I IFN produktion, kan de potentiellt användas för att studera andra imuno-modulerande molekyler frigörs från pDCs och få ytterligare inblick i de molekylära mekanismer som styr HIV-1 medfödda avkänning.
Introduction
Typ I IFN-producerande pDCs representerar den första försvarslinjen mot virusinfektioner, och som sådan fungerar som en viktig länk mellan medfödd och adaptiv immunitet 1. Medan cellfria HIV-1-partiklar är dåligt detekteras av det medfödda immunförsvaret, är HIV-1-infekterade CD4 ^ T-celler effektivt avkänns av pDCs 2. Den avkänningsmekanism förutsätter en initial kontakt mellan det virala höljesglykoproteinet (gp 120) vid ytan av den infekterade T-cellen och CD4-molekyler på PDC, som sedan följs av virus avskiljning och intemalisering av PDC. Efterföljande erkännande överförd HIV-1 RNA med TLR7 utlöser aktiveringen av MyD88 / IRF7 vägen och i slutändan leder till typ-I IFN produktion 3. Viktigt är det andra avkänningselementet vägen närvarande i pDCs, som förmedlas genom TLR9, inhiberas genom samverkan av det virala glykoproteinet, gp 120, med PDC-specifik ytmarkör BDCA2 4.
5. BST2 uttrycks vid höga nivåer på ytan av pDCs och vissa cancerceller, men vid relativt lägre nivåer i andra celltyper, såsom B-celler, makrofager och T-celler. Viktigt kan BST2 induceras av typ-I IFN i ett antal transformerade cellinjer liksom i primära cellkulturer av humana och murina ursprung 6. Bortsett från dess immunreglerande funktion, BST2 nyligen visat sig hämma frisättningen av HIV-1 och andra insvept viruspartiklar av tvärbindnings begynnande viruspartiklar på den infekterade cellytan 7. I fallet med HIV-1, var viruskodat accessoriskt protein U (Vpu) visat sig fungera som en BST2 antagonist. Man tror att Vpu nedreglerar BST2 från cellytan av HIV-1-infekterade celler, platsen för dess tjudering aktivitet och som ett resultat ökar viral utsläpp och sprida 7, även om detta begrepp har ifrågasatts 8,9. I frånvaro av Vpu, ett stort antal helt formad och moget avkomma HIV-1-partiklar hålls kvar vid cellytan. Huruvida dessa bundna partiklar kan utgöra effektiva mål för immunanalys är fortfarande en öppen fråga. Dessutom är det oklart om Vpu kan dysregulate typ I IFN produktion från pDCs genom att modulera ytan BST2 nivåer.
Tidiga studier för att utvärdera HIV-1 avkänning genomfördes med användning cellfria HIV-1-partiklar, som i allmänhet anses dåliga inducerare av typ I-IFN 3,10-12. Med tanke på att nya studier tyder på att PBMC och pDCs känner effektivt HIV-infekterade CD4 + T-lymfocyter 2,13,14, beskriver vi här en enkel metod för att mäta medfödda svar utlöses av pDCs vid erkännande av HIV-1-infekterade celler in vitro.
Protocol
Allmän information
Det är viktigt att hålla celler i odling utan antibiotika, eftersom även styrda bakteriella infektioner kan kännas av PBMC. Sådan avkänning av bakteriella komponenter kommer att inducera en bakgrund interferonproduktionen som inte kan särskiljas från den som utlöses av specifika HIV-1-avkänning. Dessutom, alla celler måste rutinmässigt testas för mykoplasmaförorening.
Använd alltid endotoxin fria lösningar när det är möjligt.
Flödescytometrisk karakterisering av de olika celler som skall användas i samkulturer (PBMCs, pDCs, MT4 och CD4 + T-celler) är ett valfritt steg, men rekommenderas starkt eftersom det kan ge värdefull information som krävs för en korrekt tolkning av en viss experiment.
1. Beredning av infekterade målceller
- Bibehåll humana CD4 + T-cellinje MT4 i RPMI 1640 mediett utökat med 10% fetalt bovint serum (FBS), hänvisas hädanefter såsom RPMI-1640 fullständigt medium.
- Isolering av primära CD4 + T-celler.
- Isolera mononukleära celler från humant perifert blod genom densitetsgradientcentrifugering.
- Isolera CD4 + -T-lymfocyter med användning av en CD4 + -T-celler negativ selektering kit, enligt tillverkarens rekommendationer.
- Aktivera CD4 + T-lymfocyter med PHA-L (5 | ig / ml) under 48 timmar och sedan behålla celler i RPMI-1640 fullständigt medium utökat med rekombinant IL-2 (100 E / ml). Infektera primära T-celler 5 dagar efter isolering.
- Infektion av målceller (MT4 T-cellinje eller heterologa primära CD4 + T-celler).
- Två dagar före samodling, infektera T-celler med HIV-1-virus. I det specifika exempel som beskrivs här pNL4.3-GFP_ires_Nef vildtyp (WT) eller pNL4.3-GFP_ires_Nef delta Vpu (dVpu) virus användes. Dessa virusstammar utgör green fluorescerande protein (GFP) -märkt isogena infektiösa molekylära kloner som skiljer sig endast i deras förmåga att uttrycka Vpu.
- Använd olika multipliciteter infektions (MOIs) och välj kulturer med liknande nivåer av infektion för samkulturer. Dagen för samodling, fastställa vilken andel av GFP + celler genom flödescytometri som en markör för infektion. Använd endast kulturer med en rad 20-50% infekterade celler för samkulturer.
Valfria steg: Utför flödescytometrisk infärgning vid denna tidpunkt att utvärdera yta uttryck av molekyler / ligander av intresse såsom BST2 och CD4. För cell ytfärgning, resuspendera 0,5 x 10 6 T-celler i 100 pl tvättlösning, tillsätt 1 pl av anti-CD4_PerCP / Cy5.5 och 1 | il av anti-BST2_A660. Inkubera rören i 45 minuter vid 4 ° C innan tvättning med flödescytometri tvättlösningen. Om studierna syftar till att utvärdera vilken roll Vpu-medierad BST2 antagonism, utför en HIV-1 partikelfrisättningsanalys vid denna tid, såsom tidigare beskrivits 15.
2. Isolering och anrikning av Sensing celler (Hela PBMC eller anrikas pDCs)
Obs! När PBMC används för avkänning, börja isolering inom en halv timme efter blodinsamling och genomföra det i tid. Använd PBMC omedelbart samkulturer eller pDC anrikning.
- Isolera mononukleära celler från humant perifert blod genom densitetsgradientcentrifugering.
Valfritt steg: Utför multi-parametrisk flödescytometri färgning för att bekräfta att nyisolerade PBMC innehåller olika cellinjer vid fysiologiska förhållanden. För cell ytfärgning, resuspendera 10 6 PBMC i 100 pl Fc-blockeringslösning och inkubera under 15 minuter vid 4 ° C. Efter blockering, tillsätt 1 pl av anti-CD3_Pacific blått (för T-celler), 1 | il av anti-CD14-PE_Texas Röd (för myeloida celler), 4 | il av anti-BDCA2_APC och 1 | il av anti-ILT7_PE (för pDCs). Inkuberarör för 45 minuter vid 4 ° C, före tvättning med flödescytometri tvättlösning. - Berika pDCs med användning av en pDC negativ selektering kit, enligt tillverkarens rekommendationer. Det rekommenderas att arbeta snabbt, hålla celler kall och använda förkyld lösningar. Detta kommer att förhindra begränsningen av antikroppar på cellytan och icke-specifik cellmärkning samt säkerställa maximal pDC aktivitet.
- Utför multi-parametrisk flödescytometrisk analys av de nyligen isolerade pDCs att bekräfta renhet, andel av vinst, och relativa mängder av pDC- specifik ytmarkörer (t.ex. ILT7 och BDCA2). För cell ytfärgning, resuspendera 10 4 pDCs i 100 pl Fc-blockeringslösning och inkubera under 15 minuter vid 4 ° C. Efter blockering, tillsätt 1 pl av anti-CD3_Pacific Blå, 1 | il av anti-CD14_PE_Texas Röd, 4 | il av anti-BDCA2_APC och 1 | il av anti-ILT7_PE. Inkubera rör för 45 min vid 4 ° C innan tvättning med flödescytometri tvättlösning (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS). Minst 40% pDC renhet rekommenderas (om utgångsmaterialet har 0,4% pDC, skulle detta motsvara en 100-faldig anrikning).
3. Co-kultur av infekterade CD4 + T-celler och Sensing celler (Hela PBMC eller anrikas pDCs)
- Blanda 220 pl av PBMC (utspätt till 850.000 celler / ml) eller 220 | il pDCs (vid en koncentration som sträcker sig från 100 tusen till 500 tusen celler / ml) med 30 pl av infekterade T-celler (spädda vid 10 6 celler / ml) per brunn i en U-bottnad 96 brunnars platta.
- Som kontroller, tallriks PBMC eller pDCs och T-celler enbart. Justera volym i brunn till 250 | j, l med RPMI 1640 komplett medium.
- Bedöma cellulära svar på känd agonist av TLR7 och TLR9 vägar. För detta ändamål platt 220 pl av PBMC (utspätt till 850.000 celler / ml) eller 200 pl pDCs (vid en koncentration som sträcker sig från 100 tusen till 500 tusen celler / ml) per brunn i en U-bottnad 96-brunnsplatta och till TLR7 agonist ( Imiquimod, slutkoncentration: 2,5 | ig / ml) eller TLR9-agonist (ODN 2216 CpG-A, slutkoncentration: 5 ^ M). Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 under 18-22 h och behandla dem på ett sätt som liknar de co-kulturer som beskrivs nedan.
- Inkubera samkulturer vid 37 ° C och 5% CO2 under 18-22 timmar, och sedan överföra dem till en V-botten 96 brunnar. Centrifugera i 5 minuter vid 400 x g.
- Överför supernatanterna till en flatbottnad platta med 96 brunnar. Terna kan förvaras vid -80 ° C eller användas för typ-I IFN upptäckt omedelbart.
- Resuspendera samodlade celler i 2% paraformaldehyd och analysera dem med hjälp av flödescytometri. På grund av skillnader i storlek och granulering, MT4-celler är lätt skiljas från PBMC eller pDCs baserat på deras sidospridning (SS) jämfört med framåtspridning (FS) profiler. Om primära T-celler används som mål-infekterade celler, kan dessa färgas med någon cell tracker färgämne, såsom CSFE, före samodling.
- Mätning av bioaktiv typ I IFN med användning av HEK-Blått IFN-a / p-reporterceller.
Obs: Dessa celler genererades genom stabil transfektion av HEK293-celler med humana STAT2 och IRF9 gener för att få en fullt aktiv typ I IFN-signalvägen. De innehåller också den utsöndrade alkaliskt fosfatas (SEAP) reportergen under kontroll av IFN-α / p inducerbar ISG54 promotor. Stimulering av dessa celler med typ-I-IFN aktiverar JAK / STAT / ISGF3-vägen och inducerar produktionen av SEAP.- Bibehåll HEK-Blått IFN-α / P-celler i DMEM kompletterat med 10% FBS. Plattan dem vid en densitet av 50.000 celler per brunn i en flatbottnad 96-brunnsplatta, i en slutlig volym av 180 | il.
- Tillsätt 20 pl av samodling supernatanten till varje brunn i duplikat. Varje platta kräver också en uppsättning interna standardkontroller (human IFNa, slutlig koncentration av 100 U / ml till 2500 U / ml). Inkubera plattorna vid 37 ° C och 5% CO2 under 18-22 H.
- Bestämma nivåer av alkaliskt fosfatas-aktivitet med användning av Quanti-blå lösning, som ändras från rosa till lila / blå i närvaro av enzymet. Förbered Quanti-Blue enligt tillverkarens rekommendationer. Lägg 180 pl av denna lösning till varje brunn i en flatbottnad 96 brunnars platta. Till varje brunn också lägga 20 | il av de inducerade HEK-Blått IFN-α / P-celler supernatanter, och inkubera plattan i en 37 ° C inkubator tills färg utvecklas i standard IFN kontrollbrunnarna.
- Utvärdera nivåerna av SEAP-med användning av en spektrofotometer vid 620 till 655 nm och bestämma koncentrationen av typ I IFN genom extrapolering från den linjära delen av IFN standardkurvan.
Representative Results
Den samodlingssystem beskrivs i figur 1 medger en kontrollerad studie av HIV-1 medfödda avkänning. På grund av den variabla naturen av primära celler, är det viktigt att normala förhållanden av myeloida och T-celler (CD14 + och CD3 + respektive) observeras, såsom i exemplet visat i figur 2A exempel. Dessutom, bara ett litet antal aktiverade T-celler (högre FS och högre CD3 nivåer jämfört med icke-aktiverade T-celler) är önskvärda i nyisolerade PBMC kulturer. PBMC med onormala förhållanden mellan de olika celltyper är ofta oförmögna att montera en ordentlig medfödda immunsvar in vitro, sannolikt på grund av en redan aktiverad fenotyp som en konsekvens av en pågående infektion. Viktigast behöver den relativa andelen för pDCs utvärderas såsom visas i fig 2B. Även om denna procentsats kan variera från 0,2 till 1,2%, är en onormal sensor fenotyp också observerats med både extremes av detta intervall. Anrikning av pDCs använder negativ selektion ger ofta 50-95% pDC renhet, vilket kan ses i de två exemplen från i figur 2B (92% och 72%). Ett prototypiska exempel för den övergripande experiment visas i figurerna 3 och 4. I detta exempel framställdes MT4-celler infekterades med pNL4.3-GFP_ires_Nef WT eller delta Vpu att uppnå 30% infektion vid tiden för samodling (fig 3A). Såsom tidigare beskrivits, endast de infektioner med WT-virus resulterade i en signifikant nedreglering av ytan BST2 (figur 3B). På grund av deras skillnader i storlek och granularitet kan MT4-celler lätt särskiljas från PBMC genom flödescytometri (figur 4A). Efter samodlingen inkubationen endast PBMC i kontakt med kända TLR7 eller TLR9-agonist och PBMC i kontakt med HIV-1-infekterade celler som frigörs betydande mängder av typ I-IFN (figur 4B). Ingen IFN påvisades i PBMC enbart i PBMCs co-cultured med skeninfekterade MT4-celler, eller enbart infekterade MT4-celler (Figur 4B). I exemplet som presenteras här, var inneboende avkänning av HIV-1-infekterade MT4-celler från PBMC visat sig vara betydligt mindre i närvaro av Vpu.
Figur 1:. Schematisk översikt av experimentell design SUP: supernatant Klicka här för att se en större bild.
Figur 2: Fenotypisk karakterisering av nyisolerade PBMC och Enriched pDCs. (A) Normal fördelning av myeloida celler och T-celler som observerats i PBMC isolerade från en frisk donator (Andel av myeloidceller skall variera mellan 10-20% och T-celler mellan 55-65%). PBMC prov färgades med hjälp av fluoroforen-konjugerade antikroppar som känner igen yta CD14 (myeloid härstamning markör) och CD3 (T-cellmarkör). (B) Fenotypisk karakterisering av pDCs. Före anriknings pDCs utgör mellan 0,2-1,2% av det totala antalet celler i PBMC (0,99% i det visade exemplet). Dessa celler kan identifieras baserat på uttryck av specifika markörer, såsom BDCA2 och ILT7, som förekommer vid cellytan. Negativ selektion kan användas för att avsevärt berika antalet pDCs och eliminera potentiellt skadliga föroreningar, såsom CD14 + myeloidceller (anrikning når 92% och 72% i de två exemplen visade). Click här för att visa en större bild.
Figur 3:. Karakterisering av HIV-1-infekterade mål-MT4-celler (A) Procent av infekterade celler inom de MT4 kulturer infekterade med pNL4.3-GFP_ires_Nef WT eller dVpu bestämd genom den procentuella andelen GFP-positiva celler. (B) BST2 cellyte-expression i de infekterade cellerna utvärderades efter ytfärgning. De grå fyllda histogram representerar skeninfekterade celler färgade med pre-immunt kaninserum (ofärgade kontroll); de återstående histogrammen representerar celler färgade med anti-BST2 polyklonalt kaninserum. Histogram med heldragna linjerna representerar styr GFP negativ (neg) celler; medan histogram med streckade linjer motsvarar infekterade GFP-positiva (pos) celler. Medelvärde influensaorescence intensitet (MFI) värden indikeras för varje prov. Flödescytometri utfördes och analyserades såsom beskrivits i figur 2. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4:. Co kultur nyisolerade PBMC och infekterade MT4 T-celler (A) Jämförelse av flödescytometri FS / SS profiler som observerats för MT4 T-celler enbart, ensamma PBMCs, eller samkulturer mellan PBMC och MT4 T-celler. På grund av skillnader i storlek och granularitet kan MT4 T-celler lätt särskiljas från PBMC i samodlingar använder flödescytometri. (B) Ett representativt exempel på den mängd av typ I IFN släpptes efter stimulering av PBMC med TLR7 eller TLR9 agonist (sedan), eller efter samkulturer med håna eller de angivna MT4-celler infekterade med pNL4.3-GFP_ires_Nef WT eller dVpu. Rådata visas som OD 650 värden och deras motsvarande converseion att typ I IFN koncentration uttryckt i U / ml. Klicka här för att visa en större bild.
Discussion
De protokoll som beskrivs här mäta avkänning av T-celler som infekterats med GFP-märkta HIV-1-virus som skiljer sig endast i deras förmåga att uttrycka Vpu, som beskrivs i vår senaste rapport 18. Däremot kan dessa metoder lätt modifieras för att studera avkänning av omärkta virus samt virus som saknar andra virusgener som potentiellt skulle kunna modulera medfödda avkänning. Om de virus som används inte uttrycker GFP, bör andelen infekterade målceller bestämmas på annat sätt före co-kultur, såsom p24 (kapsid) intracellulär färgning och flödescytometri eller p24 ELISA. Vidare kan dessa protokoll användas med olika mål-T-celler, innefattande en mängd olika tillgängliga cellinjer och primära celler.
De metoder som beskrivs i detta manuskript har ett antal fördelar jämfört med tidiga metoder som används för att studera HIV-1 avkänning. Först och främst har fastställts genom ett antal grupper som cellfria HIV-1 partiklar är dåliga inducerare av typ-I IFN 2,13,14. Dessutom tidiga studier förlitat sig på äldre IFNa ELISA-baserade metoder för att kvantifiera mängden av typ I IFN produceras. En begränsning med denna detektionsteknik är att de flesta av de äldre IFNa ELISA-satser mäter endast en typ av IFNa, medan utsikt de andra typerna av IFNa och IFNp. Användningen av de beskrivna reporter cellinjer vinner denna begränsning när koncentrationen av alla bioaktiva former av humana typ I interferoner kan mätas på en gång. Tekniken är mycket känslig, billigare än den nya generationen av IFN ELISA-kit och för många givare stora mängder av typ-I IFN kan lätt upptäckas. Ändå kan detta protokoll enkelt anpassas för användning med andra typ I IFN utlästa metoder såsom ELISA.
Kritiska steg: Det är viktigt att kvaliteten på alla cellulära komponenter (både mål och effektenheter) vara hårt kontrollerad. Potentiell förorening, även när asymptiska, måste övervakas och kontrolleras. Som vi tidigare nämnt, antibiotika styrda asymtomatisk bakteriell kontamination, och eventuellt andra intracellulära patogener såsom mykoplasma, kan generera liknande immunsvar mot dem som observerades efter HIV-1-infektion, nämligen produktion av typ I IFN. Dessutom är alla reagens måste vara fria från LPS eller andra potentiella endotoxiner. På samma sätt är också viktigt övervakning av PBMC och pDCs sedan prover från människa ofta kan förberedas genom att underliggande pågående infektioner, som kan påverka normal avkänning. Vi rekommenderar alltid inklusive de föreslagna negativa kontroller, till exempel avsaknad av målceller samt samkulturer med skeninfekterade celler. Livskraft infekterade celler är också viktigt för korrekt pDC avkänning eftersom typ-I IFN inte produceras efter samodling med apoptotiska celler 2,14.
En viktig begränsning av tekniken är behovet av nyisolerade primära celler. Detta förfarande var intetestas med användning av PBMC eller pDCs som antingen tidigare frysta eller hålls i kultur. Isoleringen av PBMC är arbetskrävande och dessa celler har en mycket begränsad livslängd. Dessutom bör standardprotokoll för att skydda mot blodburna patogener användas när du arbetar med humant blod. Det finns ofta flera källor till variabilitet i samband med arbete som involverar färskt isolerade humana celler. Bland dem är de olika förfaranden som genomförs för att isolera dessa celler, och den övertagna variabiliteten stött från donator till donator. Även om det är omöjligt att undvika variationsrikedomen bland givare, användningen av de föreslagna positiva kontroller, såsom mätning svar på kända agonister av TLR7 och TLR9 vägar, skulle ge en viktig intern kontroll för dessa experiment. Vi observerade att en robust svar på agonister av TLR9 vägen kan korreleras med en hälsosam pDC svar, medan en lyhörd TLR7 väg krävs för ett korrekt svar mot HIV-1 3.
2, ofta inte behövs anrikning av pDCs från PBMCs. Men om experimentell design kräver (till exempel i samband med där det behövs utarmning av specifika PDC ytmarkörer) negativ selektion är att föredra framför positiv selektion, som celler förblir fria från antikroppar efter urvalsprocessen. Isolerade pDCs genomgår snabb apoptos i kultur. För experiment som kräver dessa celler som skall odlas för längre tid, kan odlingsmedier kompletteras med IL-3. Denna cytokin inducerar pDC proliferation och hämmar deras apoptos 16. Behöver dock IL-3 användning för att vara hårt kontrollerad, eftersom det kan leda till pDC mognad eller differentiering.
Den här beskrivna metoden kombinerar mål HIV-1-infekterade celler med nyisolerade PBMC eller pDCs för att återskapa de initiala steg som är involverade vid medfödd avkänning. Denna metod kommer utan tvekan att vara till nytta för explore tidiga medfödda immun händelser i samband med HIV-infektion. Även om tillhörande protokoll syftar till att mäta typ-I IFN, kunde de lätt ändras för att mäta andra bioaktiva molekyler frigörs från pDCs vid erkännande av infekterade celler. Dessa kan omfatta: typ III IFN (IFN-λ), pro-inflammatoriska cytokiner (t.ex. TNF-α och IL-6) och kemokinerna CXCL10, CCI4 och CCL5 17.
Acknowledgments
Vi tackar E. Massicotte och J. Lord för teknisk experthjälp under flödescytometri och cellsortering experiment. Dessutom skulle vi vilja tacka IRCM kliniken personal och alla givare för att ge blodprov. Perifera blodprover erhölls från friska vuxna givare som gav skriftligt informerat samtycke i enlighet med Helsingforsdeklarationen i forskningsprotokoll som godkänts av forskningsetikprövningsnämnd av Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). Följande reagens erhölls genom NIH AIDS Reagens Program, Avdelningen för aids, NIAID, NIH: MT4-celler från Dr. Douglas Richman; och mänskliga rIL-2 från Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.
Dr Cohen är mottagare av Kanada forskning ordförande i Human Retrovirology. Detta arbete har finansierats med bidrag från CIHR (CIHR 111226) till Dr. Cohen och från Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) AIDS nätverk till Dr. Bego och Dr Cohen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MT4 cells | NIH AIDS Reagent Program | 120 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman. |
| HEK-Blu IFN-α/β reporter cells | Invivogen | HKB-IFNAB | |
| RPMI | Wisent | 350-000-CL | |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| FBS | Wisent | 080-150 | |
| Ficoll-Pâque Plus | Myltenyi | 17-1440-03 | |
| CD4+ T cell isolation kit II | Myltenyi | 130-091-155 | |
| Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II | Myltenyi | 130-097-240 | |
| PHA-L | Sigma-Aldrich | O2769 | |
| Human rIL-2 | NIH AIDS Reagent Program | 136 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc. |
| Imiquimod | Invivogen | TLRL-IMQS | |
| ODN 2216 CpG-A | Hycult Biotec | HC4037 | |
| Human IFNα | PBL Interferon source | 11100-1 | |
| QUANTI-Blue | Cedarlane | REP-QB2 | |
| Flow cytometry (Antibodies/reagents) | |||
| Fc blocking solution (composition below): | Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS) | ||
| 10% Goat serum | Sigma-Aldrich | G 9023 | |
| 10% Rabbit serum | Sigma-Aldrich | R 9133 | |
| 10% Mouse serum | Sigma-Aldrich | M 5909 | |
| 2.5 mg/ml human IgG | Sigma-Aldrich | I 4506 | |
| anti-CD3_Pacific Blue | Biolegend | 300417 | |
| anti-CD14_PE-TxRed | Life Technologie | MHCD1417 | |
| anti-BDCA2_APC | Myltenyi | 130-090-905 | |
| anti-ILT7_PE | Biolegend | 326408 | |
| anti-CD4_PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317427 | |
| anti-BST2_Alexa 660 | eBioscience | 50-3179 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P 6148 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Cyan ADP instrument | Beckman Coulter | CY20030 |
References
- Colonna, M., Trinchieri, G., Liu, Y. J.
- Lepelley, A., et al.
- Beignon, A. S., et al. Endocytosis of HIV-1 activates plasmacytoid dendritic cells via Toll-like receptor-viral RNA interactions. The Journal of clinical investigation. 115, 3265-3275 (2005).
- Martinelli, E., et al. HIV-1 gp120 inhibits TLR9-mediated activation and IFN-{alpha} secretion in plasmacytoid dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3396-3401 (2007).
- Cao, W., et al. Regulation of TLR7/9 responses in plasmacytoid dendritic cells by BST2 and ILT7 receptor interaction. The Journal of experimental medicine. 206, 1603-1614 (2009).
- Bego, M. G., Mercier, J., Cohen, E. A. Virus-activated interferon regulatory factor 7 upregulates expression of the interferon-regulated BST2 gene independently of interferon signaling. Journal of virology. 86, 3513-3527 (2012).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Miyagi, E., Andrew, A. J., Kao, S., Strebel, K. Vpu enhances HIV-1 virus release in the absence of Bst-2 cell surface down-modulation and intracellular depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2868-2873 (2009).
- McNatt, M. W., Zang, T., Bieniasz, P. D. Vpu binds directly to tetherin and displaces it from nascent virions. PLoS pathogens. 9, e1003299 (2013).
- Manel, N., et al. A cryptic sensor for HIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells. Nature. 467, 214-217 (2010).
- Yan, N., Regalado-Magdos, A. D., Stiggelbout, B., Lee-Kirsch, M. A., Lieberman, J. The cytosolic exonuclease TREX1 inhibits the innate immune response to human immunodeficiency virus type 1. Nature immunology. 11, 1005-1013 (2010).
- Fonteneau, J. F., et al. Human immunodeficiency virus type 1 activates plasmacytoid dendritic cells and concomitantly induces the bystander maturation of myeloid dendritic cells. Journal of virology. 78, 5223-5232 (2004).
- Ankel, H., Capobianchi, M. R., Frezza, F., Castilletti, C., Dianzani, F. Interferon induction by HIV-1-infected cells: a possible role of sulfatides or related glycolipids. Virology. 221, 113-119 (1996).
- Schmidt, B., Ashlock, B. M., Foster, H., Fujimura, S. H., Levy, J. A. HIV-infected cells are major inducers of plasmacytoid dendritic cell interferon production, maturation, and migration. Virology. 343, 256-266 (2005).
- Bego, M. G., Dube, M., Mercier, J., Cohen, E. A. Effect of calcium-modulating cyclophilin ligand on human immunodeficiency virus type 1 particle release and cell surface expression of tetherin. Journal of virology. 83, 13032-13036 (2009).
- Grouard, G., et al. The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand. The Journal of experimental medicine. 185, 1101-1111 (1997).
- Fitzgerald-Bocarsly, P., Jacobs, E. S. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection: striking a delicate balance. Journal of leukocyte biology. 87, 609-620 (2010).
- Bego MG,, Côté, É, Aschman, N., Mercier, J., Weissenhorn, W. Cohen ÉA. Exploits the Cross-Talk between BST2 and the ILT7 Receptor to Suppress Anti-HIV-1 Responses by Plasmacytoid Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11 (7), e1005024 (2015).
