Summary
私たちは、オピオイド誘発性痛覚過敏およびマウスにおける耐性の発生を調べるためのプロトコルを記述します。ナイーブおよびモルヒネで処置した動物の熱的および機械的な侵害刺激反応の測定に基づいて、疼痛感受性（痛覚過敏）の増加を定量化および慢性アヘン剤投与に関連した痛覚脱失（許容範囲）が減少することを可能にする。
Abstract
オピオイド誘発性痛覚過敏と寛容深刻な動物およびヒトにおける鎮痛剤としてアヘンの臨床的有効性に影響を与える。両方の現象の根底にある分子機構はよく理解されておらず、その解明は動物モデルの研究から、適切な実験プロトコルの設計の恩恵を受けられるはずです。
ここでは、誘導記録し、野生型マウスに尾の浸漬とテール圧力テストを使用して、鎮痛耐性を証明するためだけでなく、モルヒネ誘発痛覚過敏を定量化するための方法論的なアプローチを説明します。ビデオに示すように、プロトコルは、5つの連続ステップに分割される。取扱いおよび馴化相の動物の基礎侵害受容応答を安全に決定を可能にする。両方の熱的、機械的感受性の増加によって示されるように、慢性モルヒネ投与は、かなりの痛覚過敏を誘発するのに対し、後の鎮痛タイムコースの比較急性またはREPeatedモルヒネ治療は明らかに鎮痛応答振幅の減少によって明らか耐性の発生を示している。このプロトコルは、同様に、痛覚及びモルヒネ鎮痛作用の調節における個々の遺伝子の役割を評価するために、遺伝的に改変されたマウスに適合させることができる。それはまた、アヘン鎮痛剤の有効性を改善するために潜在的治療薬の有効性を調べるためのモデル系を提供する。
Introduction
オピオイド誘発性痛覚過敏（OIH）と鎮痛耐性動物とヒト1-3のアヘン剤の臨床的有効性を制限する。前炎症性4,5またはプロ侵害受容（抗オピオイド）6,7システムの関与は、現在の仮説を検討する。 OIHと寛容のメカニズムの解明は、適切な動物モデル、実験プロトコルおよび分子ツールを使用して、 インビボおよびインビトロのアプローチにおいての組み合わせを必要とする。
行動薬理学は、実験動物における鎮痛および痛覚過敏状態を監視し、定量化するための支配的なパラダイム（ラット、マウス）である。動物の便利な身体部位（後足、尾）に侵害刺激（熱的、機械的または化学的）の適用が容易で採点することができる侵害防御撤退につながる。
ここではOIHを誘導記録し、定量化するための方法論的なアプローチを提案し、野生型マウスにおける寛容、尾の浸漬及びテール圧力試験を用いて。手順は、マウスにおける熱的及び機械的侵害受容応答値の、容易に高感度で再現性のある測定を可能にする。ビデオプロトコルで示されているように、C57BL / 6マウスは、慢性モルヒネ投与後に有意な痛覚過敏を経験し、数日間、これを維持する。熱的及び機械的侵害受容の両方の値が有意にナイーブ動物に対するベースライン測定と比較して、低減される。また、当社の実験設備は、OIHの開発に加えて、モルヒネに対する鎮痛応答（寛容）の減少を監視することができます。提示されたデータは、これは文献1,10-12で争われているが、痛覚過敏と寛容は、8,9共通の細胞および分子機構を含むことができるという見解を支持している。最後に、このプロトコルは、同様に変調における個々の遺伝子の役割を評価するために、遺伝的に改変されたマウスに適応させることができる痛みのTiONから。それはまた、アヘン鎮痛効果を向上させるために潜在的治療薬の有効性を評価するためのモデル系を提供する。
Protocol
すべての実験は、実験動物（欧州共同体理事会指令86/609/ECC）および意識のある動物13における実験的痛みの研究に関する倫理指針のケアのための欧州のガイドラインを遵守して実施した。雄のC57BL6 / Nタックマウス（10週、25〜30グラム）を環境基準を遵守し、施設の操作を担当する医療スタッフとの制度的動物施設に収容した。動物は、食物と水を自由に一定の温度（21±1℃）で12時間/ 12時間の明/暗サイクルの下で（ケージ当たり最大5匹）のグループで飼育した。全ての実験は16匹のマウスのコホートを用いて、その日の同じ期間（午後4時まで午前10時）で実施した。具体的な材料および装置は材料表に示されている。
モルヒネ誘発性痛覚過敏と寛容を監視するための5ステップの手順
プロトコルです15日図1の期間にわたって5の連続工程（A〜E）に分割。
1マウスを取扱い。（ステップと、d-5のd-7）
- マウスを処理し、自由に制止に入るためにそれらを慣らす。このようにストレス誘発鎮痛との混同を最小限に抑える - - この予備的段階は、ストレスを軽減し、動物は、マウスレストレーナーに取り扱い、操作、調査官に慣れすることができます。各マウスを穏やかに毎日5分間処理されます。
図2基礎侵害受容応答（工程Bと、d-1〜D-4）
- テール浸漬試験（東工大）を使用して、尾の引っ込め潜伏時間を測定します。
- 48℃にサーモスタットを設定
- そっと制止にマウスを導入。水浴中にその尾の突出2月3日終了を浸しクロノメーターを開始します。
- とすぐにマウスがお湯から尻尾を撤回としてクロノメーターを止めて（秒単位）待ち時間を記録します。目の中に任意の侵害受容反応の電子の不在は、25秒のカットオフは、組織の損傷を防止するために使用される。
- そのケージにマウスを交換して、シリーズの終わりまで、次のいずれかをテスト。
- 同じ順序で、動物から測定値を取って、侵害刺激反応の測定を2回以上繰り返す。各マウスの侵害受容反応潜時（秒）は、連続する3つの測定の平均値として決定される。
- テール圧力テスト（TPT）を使用して、機械的な応答を測定
- そっと制止にマウスを導入し、無痛覚の円錐の先端の下に尻尾を配置します。
- 最初の侵害受容反応（苦労して、鳴き）が発生するまで尾の近位部に均一に増加する圧力を適用するためにフットスイッチを押してください。動物が反応する瞬間に、侵害受容応答を引き出す（グラム）現在の力を記録します。任意の反応の非存在下で、600グラムのカットオフ値をtを回避するために使用され被害を出す。
- 同じマウスの尾の中央値及び先端部分にこの測定を繰り返します。少なくとも30秒の間隔は、適応やストレスの偏りを避けるために与えられたマウスの措置との間で観察されている。そのケージにマウスを交換し、一連の（ つまり、すべてのマウスがテストされています）が終了するまで、次の動物をテストします。各マウスの侵害受容性の値（グラム）を3つの測定値（ すなわち 、近位、中央値、および各動物の尾の先端部）の平均値とする。
- その後の日を繰り返し侵害受容テスト（すべての手順は、手順2の下に概説され）、D-3、D-1へ。
モルヒネ鎮痛の3測定（ステップC; D0）
- 安定的かつ比較可能な平均侵害受容性の値を用いたマウスの2群（1群当たりn = 8） は 、いずれ侵害受容モダリティ（東工大またはTPT）の選択を考慮することができ、動物の最適な組み合わせを定義します。この値は、基礎とさせて頂きます将来の「生理食塩水」と「モルヒネ」のグループのための参照の侵害受容応答。
- 各動物の体重を測定します。
- 皮下投与（動物の体重1kg当たり5mgのモルヒネ）のために滅菌生理食塩水（塩化ナトリウム0.9％）にモルヒネ溶液（ml当たり0.5mgのモルヒネ）を準備します。
- 「生理食塩水」と東工大の「モルヒネ」のグループ（上記2.1の下ですべてのステップ）の両方の各マウスについて（時点0とする）侵害受容反応潜時を測定します。その後、TPT（上記2.2の下ですべてのステップ）で痛覚を測定します。
- それぞれ、「モルヒネ」および「生理食塩水」群に皮下にモルヒネ（25gのマウスの体重あたり0.5 mg / mlのモルヒネ溶液典型的に0.25ミリリットル）および食塩水（25gのマウス体重0.25 ml）を注入する。
- 30分intervで（時間経過とともに（下の上で概説し、すべての手続きは、それぞれ2.1と2.2に、ステップ）TITとTPTに侵害受容性値を測定ら）はモルヒネを評価する（5 mg / kg）を誘発鎮痛：
- 30分後に注射した後、TIT次いでTPTを用いて、「生理食塩水」と「モルヒネ」群の各マウスについて侵害受容応答（単一の判定）を測定する。
- 1-1.5-2-2.5-3および3.5、注射後：その後（時間単位）の時点で全てのマウスにおいて侵害受容応答値（東工大とTPT）を測定する。
4慢性モルヒネ治療 - モルヒネ誘発痛覚過敏（ステップD、D6にD1）
- D1：日に
- 前述したように（2.1および2.2ステップ）TITとTPTに侵害受容性応答値を測定します。慎重に引っ込め潜伏時間および各動物の圧力限界に注釈を付ける。
- ステップ3.2に詳述され、新鮮なモルヒネ溶液を調製する。
- 「生理食塩水」のグループ全体「モルヒネ」グループと、生理食塩水（25グラムのマウスの重量あたり0.25ミリリットル）に皮下モルヒネ（5 mg / kg体重）を注入。しましょう番目Eの動物は翌日まで休む。
- D2、D3、D4、D5、セクション4.1で説明した動作を繰り返すD6：日に
。鎮痛耐性のための5証拠（ステップE、D7）
- すでに第3節で詳述経時パラダイムに従ってモルヒネ誘発鎮痛を評価します。
6。データ収集と統計分析
- 基礎侵害受容応答値の評価（工程B）
- 「生理食塩水」と「モルヒネ」グループ内TITとTPTからもたらさとして基礎侵害受容応答の（D-1の期間にD-4上で）日ごとに計算したSEM値±平均値（N = 8）。
- プロットは、両方のグループのための時間の関数（日）などの基礎侵害受容性の値は、図2を意味する。
- 日間D0（工程c）でのモルヒネ鎮痛経時の分析とD7（工程e）
- モルヒネ後の各時点で、計算する注射は、侵害受容応答のSEM値（n = 8） の平均±各グループに東工大（秒）とTPT（g単位）から与えた。
- プロットは、0日目、図3および7日目の図5における「生理食塩水」と「モルヒネ」群について、時間の関数として侵害受容応答値を意味する。
- モルヒネ誘発痛覚過敏（ステップD）の開発
- （D0〜D7の治療期間）各日計算SEM値±平均値（n = 8） の '生理食塩水処理」と「モルヒネ処理された「グループ内TITとTPTからもたらさとして基礎侵害受容応答値のため。
- プロットは、「生理食塩水処理」と「モルヒネ処理された」グループが、図4の時間（日）の関数としての基礎侵害受容応答値を意味する。
- 鎮痛耐性の証拠（工程CとE）
- モルヒネ経時eから決定するxperimentは、最大鎮痛応答を誘導するために必要なモルヒネd0を図3時間値（または時間範囲）で実施。
- 急性モルヒネに痛覚のベースライン値（生理食塩水投与群）と実際の鎮痛応答（モルヒネ投与群）5 D7 図で推定するための基準時間としてこの値（通常は30分）を取る。
- ヒストグラムは図6のように生理食塩水を投与したとモルヒネ投与群のためにD0とD7で行っモルヒネ経時的実験から時点30分で撮影された侵害受容の値は、提示されています。
- 統計：一方向の反復測定分散分析を使用してデータを分析します。変化の要因は、（被験者間）処理と（被写体以内）の時間だった。各グループに別々に違いを確認するには、反復測定分散分析を行った。両群間の比較は、適切な場合に対応のないt検定又は対応のあるt検定を用いて行った。
- 有意性のレベルはP <0.05に設定される。すべての統計分析はスタットビューソフトウェアを用いて行われる。
Representative Results
ナイーブマウスの基底侵害値の評価（工程B）
TITおよびTPTを順次平均侵害受容応答値を提供し、全体のマウスのコホートた（n = 16）に適用した。動物の最良の組合せは、 図2。両グループの等価性は、有効なあらゆる侵害受容試験（2つの群の事後定義を許可た（n = 8）マウスに、生理食塩水およびモルヒネと呼ばれる類似した安定な基底侵害受容値を表示する東工大： 図2A、TPT：図2B）を選択した。
0日目モルヒネ鎮痛のため時間経過（ステップC）
モルヒネ鎮痛がTIT 図3Aと図3B TPTの両方を使用して、ナイーブマウスにおけるモルヒネの単回注射（SC）（5 mg / kg）を、以下の評 価を行った。 1ウェイ反復測定分散分析reveaと両方のテスト、統計解析においてTITの治療と時間との有意な相互作用があることリットル（F（5、98）72 はp <0.001 =）およびTPT（F（5、98）31 はp <0.001 =）。 TITおよびTPTデータは、反復測定のANOVAを用いて解析し、TITとTPTのそれぞれについて0.05> pを生理食塩水注射（F（7,49）= 0.49、P> 0.05）、F（7,49）= 1.85の効果がないことを示す試験）、モルヒネ注射）がTITとTPT試験のために、それぞれの強いマウスにおける鎮痛（F（7,49）= 92.46、p <0.001）およびF（7,49）= 34.37、p <0.001を誘導するのに対し。モルヒネの最大の鎮痛効果は、TITで30分後に生理食塩水を注射した対照た（p <0.001、対応のないt-検定）と比較して、TPTで60分後に到達した。
マウスで繰り返さモルヒネ行政を誘導痛覚過敏（工程d）
基礎侵害受容値は毎日測定した生理食塩水またはモルヒネ投与前（プロトコール参照）。および機械（F（; 図4に示すように、6日間の治療期間にわたって一日一回のモルヒネ投与は、有意かつ進行性の熱の低下（ 図4A F（7、56）= 11.6、p <0.001、反復測定ANOVA）が誘導される図4B）、基礎侵害受容値、7,56）15,55、P <0.001、反復測定分散分析を=。痛覚過敏は、（生理食塩水を注射した対照と比較してp <0.01、対応のないt検定）TITで1日目で有意であることを始めとして、急速に発展し、TPTで2日目の生理食塩水と比較した（p <0.05、対応のないt-検定、少なくとも）コントロールを注射した。
慢性モルヒネ治療（工程E）7日後にモルヒネ鎮痛のため時間経過は、
7日目に、（D6にD0）7日間にわたって毎日、モルヒネまたは生理食塩水の注射を受けたマウスは、Tで検討したITの図5AおよびTPT 図5B最初に基礎侵害受容値のため、その後、急性モルヒネに対する鎮痛応答のための（5 mg / kgを、SC。）。 図4に示される痛覚過敏の発症と一致して、慢性的に、モルヒネで処置したマウスの侵害受容基底値（時間0）は生理食塩水を注射した対照マウス（p <0.001、対応のないt検定）より有意に低かった。急性モルヒネ以下、慢性的なモルヒネ処置群の侵害受容応答が有意に上昇したが、わずかに30 TITで分およびTPT た（p <0.01およびp <0.05、対応のないtに測定された生理食塩水を注射した対照マウスの侵害受容基礎値を超え試験のそれぞれ）とTITで60分（p <0.05の時、対応のないt検定）。モルヒネ処置後2時間から実験終了まで、侵害刺激反応は、p（対照マウスのものよりも低い値に戻っ<0.001、対応のないt検定）。
モルヒネに対するマウスの最大鎮痛応答の比較（0日目）の前と後の慢性モルヒネ治療（第7日）。
図6に示さ侵害受容閾値はTIT（A）およびTPT（B）からのもので、図3（0日目）、5（7日目）に示すように、生理食塩水またはモルヒネ注射から30分後に行った。モルヒネの鎮痛作用の強い減少が両方の侵害受容試験における0日目にそれらの初期鎮痛応答した（p <0.001、対応のあるt検定）と比較して7日間慢性モルヒネ処置後のマウスにおいて観察された。これらのデータは、公差が痛み過敏の動物で発達たことを示している。
図1。5段階のプロモルヒネ誘発される痛覚過敏と寛容を監視するcedure。プロトコルは、15日間の全期間にわたって連続5工程（AE）に分割される。
図2は、基礎侵害受容応答値の定義（工程Bと、d-4のd-1）。尾浸漬（TIT）（A）及びテール圧力（TPT）は（B）の試験は、動物の全体の系列に適用されるその基礎侵害受容性値を評価するためである。それらは安定しており、同等の平均侵害受容値を示すように、この後、2匹のマウスの群（n = 8）、「生理食塩水」と「モルヒネ'基と称する、考えられるあらゆる侵害受容モダリティ、定義されている。
東工大（A）とTPT（B）中の0日目（工程c）でのモルヒネ鎮痛のための図3。時間コースが。マウスの基礎侵害受容応答値は、単一のモルヒネ（5 mg / kgを、SCの後に30分毎に測定した。 ）または生理食塩水の注射。データは、平均±SEMとして表し、群当たりn = 8匹のマウスされている。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、対応のないt-検定、対照群と比較して。
図4を繰り返しモルヒネ投与（ステップD、D1〜D6は）次の痛覚過敏の開発。マウスの基礎侵害受容値はTITにより決定した モルヒネ（5 mg / kgの前（A）およびTPT（B）一日一回、SC）または食塩水投与。データは平均値±SEMとして表され、各群n = 8マウスである。 * P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001対応のないt検定により、生理食塩水処置対照群と比較して。
図5。7日目の慢性モルヒネ処理されたマウスにおけるモルヒネ鎮痛のための時間的経過（ステップE）TIT（A）とTPT（B）であった。慢性モルヒネ（黒ドット）または生理食塩水（白三角）で処理したマウス0日目から6日目に、それぞれ、7日目に、単一のモルヒネの注射（5 mg / kgを、SC）または生理食塩水を受けた。マウスの侵害受容応答は、モルヒネまたは生理食塩水注射後30分毎に測定した。データ±SEMとして表され、各群n = 8マウスである。 * P <0.05、** P＆＃60;生理食塩水処置対照群と比較して、対応のないt検定により0.01。シンボルの大きさを超えないエラーバーは非表示になります。
図6ここで報告モルヒネ処置（7日目）。値は図3と図5に示した実験に由来する（0日目）前と後とモルヒネに対するマウスの最大鎮痛応答（5 mg / kgで、皮下）の比較 。侵害受容性の値は、TIT（A）およびTPT（B）モルヒネまたは生理食塩水注射後30分で測定した。データ±SEMとして表され、各群n = 8マウスである。 *** P <0.001、対応のあるt検定による。
Discussion
重要なステップ
痛覚測定のための動物モデルの選択
マウス系統間の侵害受容および鎮痛感度のばらつきはモダリティ（熱的、化学的、機械的）、期間（急性、トニック、、（レビュー14〜16）、その病因が異なる様々な疼痛モデルを使用してレビュー（侵害受容性、炎症性、神経障害性）を検討されている慢性）および投与部位（皮膚、皮下、内臓）。他の株と比較した場合、彼らは高い基礎侵害受容感度17,18およびアヘン剤14,19に適度な鎮痛反応を示すように、C57BL/6Jマウス（ジャクソン研究所のための「J」）は、痛みの研究のための人気の動物モデルとなりました。慢性的なモルヒネ処置後、それらはまた、有意な鎮痛耐性20,21、21,22痛覚過敏および依存20,23を発症する。
NT ">ここでは、実験はC57BL/6Nタックマウスに対して実施したB6系統の独立したブランチに所属する（「Taconicsファームのタック」「国民健康研究所のための「N）。C57BL / 6マウスは長い間されているが交換可能であると考え、最近の研究では、C57BL/6JとC57BL/6N 24株の中の重要な動作の違いを指摘した。具体的には、熱、痛みを急性する（TAC 1を含む）の3 C57BL/6Nの亜の低い感度は、とみなすことができるこの表現型をテストするための利点がある。雄マウスは、若年男性25上で実行され、動物モデルとしてマウスを用いて、疼痛の研究の大部分として選択した。ビューの鎮痛または痛覚過敏の点から検討するとき我々の手で、彼らは堅牢で再現性のあるデータを提供した。時折、我々はC57BL/6Nの女性がTITとTPTテストの両方で、より変動応答を提供する傾向に気づいた。この観察は、かもしれないが雌のホルモン状態にリンクされ、自然の変化を反映して、痛みや鎮痛における性差の基礎となる全体的なメカニズムはまだ論争の問題のまま。この熱い議論のいくつかの側面を簡単にセクションの次の「技術の限界」で提示されます。
動物の馴化
マウスは、最初の1週間の間に動物施設に慣れることができました。他の任意の行動の研究と同様に、試験は3日馴化期間（ 図1、ステップA）に従って実施した。侵害受容試験は、ストレスに敏感であるように、第一の対策は特に非馴化マウス26,27に、後続のものよりも長い待ち時間を与えることができる。馴化工程は、その日のうちに、より安定した侵害受容応答値の獲得を可能にし、日の間2〜4を示す 。侵害受容性および鎮痛に対するサーカディアン効果を減少させる感度28,29は 、全てのtestingsは午前10時と午後4時の間で行われた。
侵害受容性のテストの選択
侵害受容性のテストは、レビュー26,27,30（熱的、機械的、化学的または電気的刺激のいずれかを使用しています。異なる侵害受容モダリティが異なる侵害受容繊維18,31,32を通じて処理されることができるように彼らの選択が非常に重要です。
我々は、熱の例として、ランダルおよびセリット35から適応、尾部浸漬試験（TIT）33、D'のダムールおよびSmith 34によって開発された古典的なテイルフリック試験の修正バージョン、及びテール圧力試験（TPT）を選択し、マウスではモルヒネ誘発鎮痛、痛覚過敏と寛容を研究するための機械的様相。両方のテストは、広くラットで使用されている。カットオフ時間を体系的に組織損傷のリスクを回避または制限するために定義された。
モルヒネインダクタED鎮痛、痛覚過敏と寛容
それは強力な鎮痛およびOIH-誘導因子であるように、モルヒネ、プロトタイプのMU-アヘンアゴニストは、ヒトおよびマウス1,2,36の両方で、ここで選択した。モルヒネの鎮痛効力は、マウス系統、投与経路、および侵害受容様式に応じて変化することが知られている。 C57BL / 6マウスにおいて、信頼性の鎮痛は、通常、1〜20 mg / kgの用量範囲14,21内のモルヒネの皮下注射後に得られる。したがって、我々は、熱痛覚19,21から評価、そのED 50値（7月20日mg / kg）の近くに5 mg / kgで、モルヒネの単回投与（SC）後の急性鎮痛を勉強することにしました。
繰り返されるモルヒネ投与は、多くの場合、および痛覚過敏（痛みを伴うstimulに悪化感度（用量反応曲線の右方向へのシフトから、あるいは鎮痛応答振幅または持続時間の減少のいずれかから証明）鎮痛耐性を伴うi）は、基礎侵害受容価値の減少からも明らか。両方の不利な現象は治療期間におよび侵害受容モダリティ21にアヘン選択されている化合物およびその投与量の性質上、げっ歯類の系統に依存します。例えば、寛容と痛覚過敏を研究する実験的パラダイムが高く、定数（一日あたり20から40 mg / kg）を毎日投与することからなる22以上エスカレートするの（最大50あるいは200 mg / kg）の20,21モルヒネの投与量。 8日間にわたって、したがって、我々は日々のモルヒネ投与（SC 5 mg / kg）を通って、C57BL / 6マウスにおいて、痛覚過敏および耐性の発生を促進した。この適度なモルヒネ投与量は、より良い模倣診療所の使用に高いものよりも好まれた。
東工大運用ウィンドウのセットアップ
東工大で可能な落とし穴は、げっ歯類26,37の体温調節における尾の役割に関連している可能性があります。周囲温度がnociceptの重要な要因であるようにアイブ応答変動は、実験全体を通して38（ここでは21℃）で一定に保たれるべきである。熱強度は、通常は5から10秒27の中に侵害受容性応答を検出するように設定されている。短いものは、試験の差分電力を低減することができるのに対し、実際には、より大きな待ち時間は、侵害刺激とは無関係の動物の動きを監視するためのリスクを高めることができる。私たちは、48℃の一定温度TIT測定を実施し尾の引っ込め潜伏時間は9秒（基礎侵害受容値）に近く、25秒4秒（痛覚過敏）から変化させた（最大鎮痛;カットオフ）。実用的な理由に加えて、一定温度での侵害受容応答値の測定は、先験的ことにより、データの解釈を容易にする、侵害受容器および回路の同一のレパートリーを含むことができる。
可能な修正
鎮痛およびOIH measuremeため東工大運用ウィンドウの最適化NTS
鎮痛反応に着目すると、低いベースライン値（より高い熱強度）は応答遅れの検出に有利に働くことができる。次に、疼痛刺激の結果又はOIHの開発に対処するために、より高いベースライン値（より低い熱強度、ここで48°C）は図4より速い応答の検出を容易にすることができる。
モルヒネ誘発鎮痛、：私たちは5ミリグラム/堅牢な鎮痛応答図3を誘導し、（反復投与の際に）重要な痛覚過敏の図4を促進するための便利な投与量をキログラムでモルヒネを見つけたものの、（重要なステップの前に述べたように、その投与量は、適合させることができる痛覚過敏と寛容）。例えば、低用量、高用量は、痛覚過敏の発症を加速し、その振幅を増大させるように選択することができるのに対して（それによってカットオフ限界を回避する）鎮痛振幅を減少させるために使用されてもよい。
オベRALL、「侵害受容窓」の最適化が検討されたマウスの遺伝的背景に適応し、考慮に侵害受容器や回路の明確な配列の関与の可能性を取る必要があります。
代替アヘン作動薬（フェンタニル、レミフェンタニル）
最も臨床的に使用されるアヘンアゴニストとしては、μ-オピオイド受容体を標的とするが、それらはin vitroおよびin vivoの両方でそれらの薬理学的特性に関してかなり異なる。例えば、レミフェンタニルおよびフェンタニルは、モルヒネとは著しく対照的に、完全なアゴニストとして振る舞い、μ-オピオイド受容体39の内在化を推進しています。レミフェンタニルは数分41の超短半減期を有し、一方、モルヒネやフェンタニルなどの麻薬性鎮痛薬は、時間40の範囲で半減期を有する。ヒトでは、OIHのための最良の証拠は、短時間作用型Cを含む、手術中にアヘンを受けた患者からのものであるこのようなレミフェンタニル2,42などompounds。このように、フェンタニルとレミフェンタニルはTITとTPTパラダイムの下で、マウスでの痛覚過敏および耐性の発生を研究するためあまりに貴重なツールかもしれません。
OIHの誘導の代替モード（急性投与対慢性）
OIHは1,2非常に低いか、非常に高い用量であれ、アヘン剤の投与の結果として、人間と動物モデルで見られます。私たちは、モルヒネの中程度の用量でのマウスの慢性処置後のOIH開発にここに報告する。 C57BL/6Nマウスの処置の数日は明確で再現性の痛覚過敏状態の図4を証明する必要があった毎日のモルヒネの注射が適切に移植されたモルヒネペレットと置き換えることができる：それらの除去の際に、熱痛覚過敏および機械的異痛の両方が既にマウスにおいて報告されている43。微小浸透圧ポンプを通るアヘンの注入は別の可能性あり 44。げっ歯類では、長期的な痛覚過敏も達成可能人間手術36,45,46でこのμ-オピオイド作動薬の使用を模倣するプロトコルを使用してフェンタニルの急性投与に従っている。
技術の限界
痛みのための動物種とモデル
数々のマウス系統の比較研究は、4日間のモルヒネ治療22次の疼痛刺激17,31,47の侵害受容応答のとOIHレベルの大きな変動の証拠を提供した。動物モデル（マウスおよびラット）で痛みの処理および変調のメカニズムは、慢性疼痛患者に関連するかどうかは、基本的かつ開かれた質問のままです。このように、多くの注意が動物データの解釈にと人間16のための彼らの予測妥当性に留意する必要があります。
痛みと鎮痛における性差
ntent ">痛みのための動物モデルのほとんどの前臨床研究では、この選択バイアスにもかかわらず、新たなビューがオピオイドを開発するために麻薬性鎮痛薬49,50、少ない傾向へのよりよい応答として、男性を検討することであった。男性のげっ歯類16,25,48に行われているしかしながら、侵害受容および鎮痛薬の有効性に関する性差などで再開しない彼らの女性の対応（レビュー54）よりも誘発される痛覚過敏51,52とモルヒネ鎮痛53に対してより寛容はパラダイム'フリーサイズ'。実際、豊富なデータは、現在非常に多くの変数が、このようなオピオイド薬の有効性と選択性、侵害受容性分析、遺伝的背景、年齢、gonadoホルモン状態や社会的相互作用48,54など性差の大きさと方向に影響を与える可能性があることを示す。ヒトでは、臨床的な痛みを女性でより一般的ですが、この事実は、実際のセックスの違いを反映しているかどうか議論の48,55,56の問題のまま。Foをメタアナリシスは、女性57で有意に高いオピオイドの有効性を指摘した患者、制御されたサブジェクトに対して実行のに対してRたとえば、50の臨床試験のグローバルな分析は、男女間の鎮痛作用に有意差がないことを示した。著しくなっているものとは対照的である後者の観察を、げっ歯類で発見、再びこのような相違の16,48,55,57の原点に関するいくつかの問題を提起する。全体として、鎮痛における性差は存在しないとメリットがさらに根本的なメカニズムと臨床的意義に焦点を当てています。侵害受容性テストについて
尾の撤退テストは脊髄反射であるが、それは脊柱上の影響58を受ける可能性がある。東工大は、ラットに対して実行することは比較的容易であるが、マウスではより多くの専門知識が必要です。潜在的な難しさは、望ましくない応力を引き起こすことなく正しい姿勢でマウスを維持することである。提案されたプロトコルは、に応じて調整することができるコホートサイズ。 16匹（8コントロールと8治療）は簡単に限り、その基礎侵害受容応答値の測定などの管理されている（第一東工大を使用し、マウスの全シリーズのためのTPT）は懸念の下にあります。鎮痛時間経過のモニタリングは、付与の時間間隔（ここでは30分）以内に正確なタイムスケジュールの確立と（最初東工大、TPT）試験することができる動物の最大数を評価することが必要です。動物の全体のコホートは、このように実験者が運動の制限を尊重することができるようにサブグループに分割されてもよい。
オルタナティブ/既存の方法に関する技術の重要性
マウスに対するラットでOIH
ラットは広範囲に急性または慢性のアヘン政権46,59-61以下、オピオイド鎮痛、痛覚過敏と寛容を研究するために使用されてきた。実際に、いくつかの実用的な理由から、それらはより優れて考えることができる痛みの実験16,61のための動物モデルとしてのマウス。しかし、最近まで、遺伝子改変されたラットの世代は簡単手続きではなかった。数多くの遺伝子改変されたマウス系統がすでに利用可能であるように、我々のモデルは、マウスでのOIHと耐性発現の多数の個々の遺伝子の寄与を研究する機会を提供しています。
他の侵害受容性のテストと比較TITとTPT
東工大は、テールフリック試験の変形で、最も明らかな違いは、刺激の領域である。輻射熱とは対照的に、熱水への尾の浸漬は、その温度の迅速かつ均一な増加をもたらす。温痛覚試験（ホットプレートまたはハーグリーブス試験）の他の形態に比べて、乳を横切り、被験者の中に両方かなり再現性のある結果を提供します。
TPTはおそらく含ま機械的侵害受容26,27,35の研究のための非常に人気のあるテストですその後、明確な侵害受容性繊維と高分子トランスデューサTIT 32。それは、迅速かつ信頼性の高い測定59を提供しますが、実験者と大型動物のコホートからのいくつかの専門知識が必要です。本研究で使用した無痛覚の代替として、歪みゲージに頼る他の手順または装置は、（総説27）存在する。 TPTは、von Freyフィラメントは、通常、機械的異痛（レビュー27）を評価するものと解釈されるのに対し、機械的痛覚過敏を研究するために最も適しています。
このテクニックをマスターした後、将来のアプリケーションまたは方向
ここで提示した実験OIH /公差モデルは、同様に、疼痛の調節における個々の遺伝子の役割を評価するために、遺伝的に改変されたマウスに適合させることができる。それはまた、慢性の痛みを和らげるために潜在的治療薬の有効性を調べるためのモデル系を提供する。
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは、先生JLに感謝します。 Galzi（UMR7242 CNRS、ストラスブール、フランス）彼のサポートのため。
この作品は、CNRS、INSERM、大学デストラスブール、アルザスバイオバレーとCONECTUSからの補助金によって、通信社ナショナル·デ·ラ·ルシェルシュ（ANR 08 EBIO 014.02）Conseilの地域ダルザス（Pharmadol）、欧州共同体Urbaineデストラスブール（Pharmadol）によってサポートされていましたICFRC（Pharmadol）、OSEO（Pharmadol）、方向ジェネラル·デ·Entreprises（Pharmadol）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30 g) |
| Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS no. 52-26-6 | Delivered with special authorization |
| Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene, sterile, volume: 1 ml |
| Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | 26 G ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
| Mouse restrainer | Home-made | Two metallic grids (5 x 11 cm) assembled with adhesive tape and staples | |
| Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
| Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
| Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
| STATview software | Free download, statistics |
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