Vi beskriver en protokoll for å undersøke utviklingen av opioid-indusert hyperalgesi og toleranse hos mus. Basert på måling av termiske og mekaniske nociceptive svar av naive og morfin-behandlede dyr, gjør det mulig å tallfeste økningen i smertefølsomhet (hyperalgesi) og reduksjon i smertebehandling (toleranse) forbundet med kronisk opiat administrasjon.
Opioidindusert hyperalgesi og toleranse sterkt påvirke den kliniske effekten av opiater som smertestillende midler i dyr og mennesker. De molekylære mekanismene bak begge fenomener er ikke godt forstått, og deres forklaring skal ha nytte av studiet av dyremodeller og fra utforming av egnede eksperimentelle protokoller.
Vi beskriver her en metodisk tilnærming for å fremkalle, innspilling og kvantifisering av morfin-indusert hyperalgesi samt for godgjøre analgetisk toleranse, ved hjelp av halen-immersion og hale trykktester i villtype mus. Som vist i videoen, blir protokollen delt inn i fem etterfølgende trinn. Håndtering og tilvenning faser tillate en sikker bestemmelse av basal nociceptive responsen av dyrene. Kronisk administrering av morfin induserer signifikant hyperalgesi, som vist ved en økning i både termisk og mekanisk følsomhet, mens sammenligning av analgesi tid-baner etter akutt eller repflere ganger for morfinbehandling indikerer tydelig utvikling av toleranse manifestert av en nedgang i smertestillende respons amplitude. Denne protokollen kan tilpasses på lignende måte til genetisk modifiserte mus for å evaluere betydningen av individuelle gener i modulering av nocicepsjon og morfin analgesi. Det gir også et modellsystem for å undersøke effektiviteten av potensielle terapeutiske midler for å forbedre opiat analgetisk effekt.
Opioidindusert hyperalgesi (OIH) og smertestillende toleranse begrenser den kliniske effekten av opiater i dyr og mennesker 1-3. Involvering av pro-inflammatorisk 4,5 eller av pro-nociceptive (anti-opioid) 6,7 systemene er for tiden utforsket hypoteser. Den forklaring av mekanismene som ligger til grunn OIH og toleranse nødvendiggjør en kombinasjon av in vivo-og in vitro-metoder, ved hjelp av egnede dyremodeller, eksperimentelle protokoller og molekylære verktøy.
Behavioral farmakologi er det dominerende paradigmet for å overvåke og kvantifisere smertestillende og hyperalgesibestemmelsen stater i forsøksdyr (rotter, mus). Anvendelsen av et skadelig stimulus (termisk, mekanisk eller kjemisk) til et passende kroppsdelen (hindpaw, hale) til dyret fører til en nocifensive uttak som lett kan skåres.
Vi foreslår her en metodisk tilnærming for å fremkalle, innspilling og kvantifisere OIH ogtoleranse i villtype mus, ved hjelp av halen-immersion og hale trykktester. Fremgangsmåten tillater en enkel, følsom og reproduserbar bestemmelse av termiske og mekaniske nociceptive responsverdiene i mus. Som vist i videoen protokollen, C57BL / 6 mus opplever betydelig hyperalgesia etter kronisk morfin administrasjon og opprettholde dette i flere dager. Både termiske og mekaniske nociceptive verdier er betydelig redusert, sammenlignet med grunnlinjemålinger på naive dyr. Videre tillater vårt eksperimentelle oppsett for å overvåke, i tillegg til utvikling av OIH, nedgangen av den analgetiske respons til morfin (toleranse). Presentert data støtter det syn at hyperalgesia og toleranse kan innebære felles cellulære og molekylære mekanismer 8,9, selv om dette er omstridt i litteraturen 1,10-12. Endelig kan denne protokoll tilpasses på lignende måte til genetisk modifiserte mus for å evaluere betydningen av individuelle gener i modulasjon av smerte. Det gir også et modellsystem for å evaluere effekten av potensielle terapeutiske midler for å forbedre opiat smertestillende effekter.
Kritiske Steps
Valg av en dyremodell for nociception målinger
Variasjon i nociseptive og smertestillende følsomhet blant muse stammer har blitt undersøkt (anmeldelser 14-16) vurderinger ved hjelp av ulike smertemodeller med ulik deres etiologi (nociceptive, provoserende, nevropatisk), modalitet (termisk, kjemisk, mekanisk), varighet (akutt, tonic, kronisk) og administrasjonsstedet (cutaneous, subkutan, visceral). Sammenlignet med andre stammer, C57BL/6J ("J" for Jackson Laboratory) mus ble et populært dyremodell for smerte studier som viser de en høy basal nociceptiv følsomhet 17,18 og en moderat smertestillende respons på opiater 14,19. Etter kronisk morfinbehandling, de også utvikle betydelige smertestillende toleranse 20,21, hyperalgesia 21,22 og avhengighet 20,23.
nt "> Her eksperimenter ble utført på C57BL/6N Tac mus (" N "for National Institute of Health og" Tac "for Taconics gård) som tilhører en egen gren av B6 avstamning. Selv C57BL / 6 mus har vært lang ansett som utskiftbare, nyere studier pekt på betydelige atferdsforskjeller mellom C57BL/6J og C57BL/6N stammer 24. Spesielt lavere følsomhet av de tre C57BL/6N substrains (inkludert Tac ett) til akutt termisk smerte kan betraktes som en fordel for å teste dette fenotype.Hannmus ble valgt som de aller fleste av smerte studier ved bruk av mus som dyremodell, blir utført på juvenile hanner 25. I våre hender, forutsatt at de robuste og reproduserbare data når undersøkt fra smertelindring eller hyperalgesia synspunkter. Av og til, vi la merke til en tendens til at C57BL/6N kvinner å gi flere variable responser, både i TIT og TPT tester. Selv om denne observasjonen kanreflektere naturlige variasjoner knyttet til hormonelle status for kvinner, generelle mekanismene bak kjønnsforskjeller i smerte og smertelindring fortsatt et spørsmål om kontrovers. Noen aspekter av denne varme debatten vil bli kort presentert i den neste "Begrensninger av teknikken"-delen.
Animal tilvenning
Mus ble først tillatt å venne seg til dyrefasilitet i løpet av en uke. I likhet med en hvilken som helst annen atferdsstudie, testing ble utført etter en 3-dagers-akklimatiseringsperiode (fig. 1, trinn A). Som nociceptive tester er følsomme for stress, kan første tiltak gi lengre ventetider enn etterfølgende hendelsene, spesielt i ikke-tilvent mus 26,27. Den tilvenning trinn tillater også oppnåelse av mer stabile nociceptive responsverdier innenfor samme dag, og mellom dagene Figurene 2 og 4. For å redusere døgnrytmen effekter på nociseptive og smertestillendefølsomhet 28,29, ble alle prøvelser gjennomført 10:00-04:00.
Valg av nociceptive tester
Nociceptive tester bruker enten termisk, mekanisk, kjemisk eller elektrisk stimuli (gjennomgang 26,27,30. Deres valg er kritisk som ulike nociceptive modaliteter kan bli behandlet gjennom ulike nociceptors og fiber 18,31,32.
Vi valgte hale nedsenking test (TIT) 33, en modifisert versjon av den klassiske hale flick test utviklet av D'Amour og Smith 34, og haletrykktest (TPT), tilpasset etter Randall og Selitto 35, som eksempler på termisk og mekaniske modaliteter å studere morfin-indusert analgesi, hyperalgesi og toleranse hos mus. Begge testene har vært mye brukt i rotter. Et avskåret tid ble systematisk definert for å unngå eller begrense vesentlig skade på vev.
Morfin-induksjoned analgesi, hyperalgesi og toleranse
Morfin, den prototypiske mu-opiat agonist, ble valgt her som det er en potent analgetikum og OIH-induser, både hos mennesker og mus 1,2,36. Morfin analgetisk potens er kjent for å variere med muse stammer, administrasjonsveier og nociceptive modaliteter. I C57BL / 6 mus, er pålitelig analgesi vanligvis oppnås etter subkutane injeksjoner av morfin i 1-20 mg / kg doseområdet 14,21. Følgelig, valgte vi å studere akutt smertelindring etter en enkelt administrasjon (sc) av morfin på 5 mg / kg, nær sin ED 50 verdi (7-20 mg / kg) vurdert fra termisk nociception 19,21.
Gjentatt administrering av morfin er ofte ledsaget av smertestillende toleranse (påvist enten fra en høyrerettet forskyvning av dose-responskurve eller fra en reduksjon i analgetisk respons amplitude eller varighet) og hyperalgesi (en forsterket følsomhet for smerte stimuli dokumentert fra en reduksjon i basal nociceptive verdi). Begge uønskede fenomener er avhengig av gnager-stammer, av arten av opiat forbindelse som er valgt, og doseringen, behandlingsvarighet, og på nociceptive modaliteter 21. For eksempel eksperimentelle paradigmer å studere toleranse og hyperalgesi består i daglig administrasjon av høye og konstante (20 til 40 mg / kg per dag) 22 eller av økende (opp til 50 eller til og med 200 mg / kg) 20,21 morfin doser. Følgelig fremmes vi utvikling av hyperalgesi og toleranse i C57BL / 6 mus ved daglig administrering av morfin (5 mg / kg; sc) i løpet av en 8-dagers periode. Dette moderat morfindose ble foretrukket framfor høyere seg til bedre etterligner klinikk bruk.
Sett opp av TIT operativ vindu
En mulig fallgruve i TIT kan være relatert til rollen av halen i termoregulering av gnagere 26,37. Som omgivelsestemperatur er en nøkkelfaktor i nociceptive responsvariasjoner, bør det holdes konstant (her ved 21 ° C) gjennom eksperimenter 38. Varme intensitet er vanligvis satt opp til å oppdage en nociceptiv svar innen 5 til 10 sek 27. Faktisk kan større latencies øke risikoen for overvåkning av dyr bevegelser som ikke er relatert til den nociceptive stimuli, mens kortere kan redusere differensialstrøm av testen. Vi utførte TIT målinger ved en fast temperatur på 48 ° C. Tail abstinensventetider var nær 9 sek (basal nociceptiv verdi) og varierte fra 4 sek (hyperalgesi) til 25 sek (maksimal analgesi; avskåret). I tillegg til praktiske grunner målinger av nociceptive responsverdier ved en fast temperatur, kan a priori bære samme repertoaret av nociceptors og kretser, og derved tilrettelegge for tolking.
Mulige Modifikasjoner
Optimalisering av TIT operative vinduet for analgesi og OIH measurements
Ved å fokusere på en smertestillende respons, kan lave utgangsverdier (høyere varmeintensitet) favoriserer påvisning av en forsinkelse i responsen. I sin tur, å ta konsekvensen av en smertefull stimulus eller utvikling av OIH, høyere utgangsverdiene (lavere varme intensitet, her 48 ° C) kan legge til rette for påvisning av raskere svar Figur 4.
Selv om vi har funnet morfin ved 5 mg / kg en enkel dose til å indusere en sterk analgetisk respons figur 3, og for å fremme (ved gjentatt administrering) signifikant hyperalgesi figur 4, kan doseringen være tilpasset som nevnt tidligere (kritisk trinn: morfin-indusert analgesi, hyperalgesia og toleranse). Eksempelvis kan lavere doser anvendes for å redusere analgesi amplitude (for derved å unngå Tids begrensninger), mens kan velges høyere doser for å akselerere hyperalgesi utbruddet og øke dens amplitude.
OveRall, optimalisering av "nociceptiv vinduet 'bør tilpasses den genetiske bakgrunnen til mus under studien og ta hensyn til muligheten for involvering av ulike sammensetninger av nociceptors og kretser.
Alternative opiat agonister (fentanyl, remifentanyl)
Selv om de fleste klinisk brukte opiater målrette det mu-opioid-reseptoren som agonister, de skiller seg vesentlig med hensyn til deres farmakologiske egenskaper både in vitro og in vivo. For eksempel, remifentanyl og fentanyl, i markert kontrast med morfin, oppfører seg som fulle agonister og fremme internalisering av mu-opioidreseptorer 39. Opiat-smertestillende midler som morfin og fentanyl har halveringstider i størrelsesorden 40 timer, mens remifentanyl har en ultra-korte halveringstid på flere minutter 41. Hos mennesker er beste bevis for OIH fra pasienter som fikk opiater under operasjonen, inkludert korttidsvirkende compounds som remifentanyl 2,42. Dermed kan fentanyl og remifentanyl være verdifulle verktøy for å studere utviklingen av hyperalgesi og toleranse i mus under TIT og TPT paradigmer.
Alternative moduser av induksjon av OIH (kronisk vs akutt administrasjon)
OIH er sett hos mennesker og dyremodeller som en konsekvens av opiat administrering, enten ved svært lave eller svært høye doser 1,2. Vi rapporterer her på OIH utvikling etter kronisk behandling av mus med moderate doser av morfin. Flere dager med behandling av C57BL/6N mus var nødvendig å bevis en klar og reproduserbar hyperalgesibestemmelsen stat Figur 4 Daglig morfininjeksjoner kan være tilstrekkelig erstattet med implanterte morfin pellets:. Ved fjerning sin, har både termisk hyperalgesi og mekanisk allodyni er allerede rapportert hos mus 43. Infusjon av opiater gjennom en mikro-osmotisk pumpe er en annen mulighet 44.. Hos gnagere, langvarig hyperalgesi er også oppnåelig ved akutt administrering av fentanyl ved hjelp av en protokoll ligne bruken av denne mu-opioid-agonist i human kirurgi 36,45,46.
Begrensninger av teknikken
Dyrearter og modeller for smerte
Komparative studier av en rekke musestammer gitt bevis for store variasjoner i nociceptive responser på smertefulle stimuli 17,31,47 og i OIH nivåer etter 4-dager morfinbehandling 22. Enten mekanismene bak smertebehandling og modulasjon i dyremodeller (mus og rotter) er relevant for kroniske smertepasienter er fortsatt en grunnleggende og åpnet spørsmål. Derfor bør mye forsiktighet skal betales til tolkning av data fra dyreforsøk og prediktiv validitet for mennesker 16.
Kjønnsforskjeller i smerte og smertelindring
ntent "> De fleste prekliniske studier på dyremodeller for smerte har blitt utført på mannlige gnagere 16,25,48. Til tross for dette valget bias, den nye utsikten var å vurdere menn som bedre respondere til opiat smertestillende 49,50, mindre utsatt for å utvikle opioid -indusert hyperalgesi 51,52 og mer tolerant til morfin analgesi 53 enn sine kvinnelige kolleger (54). Men kjønnsforskjeller med hensyn til nociception og smertestillende legemidler effekt ikke fortsette i en slik "en one size fits all" paradigme. Faktisk, en mengde data indikerer nå at en rekke variable kan påvirke størrelsen og retningen av kjønnsforskjeller som opioid medikament-effektivitet og selektivitet, nociceptive assay, genetisk bakgrunn, alder, gonado-hormonell status eller sosial interaksjon 48,54. Hos mennesker kliniske smerte er mer utbredt hos kvinner, men om dette faktum gjenspeiler faktiske kjønnsforskjeller er fortsatt et spørsmål om debatt 48,55,56. For eksempel global analyse av femti kliniske studier indikerte ingen signifikante forskjeller i smertestillende egenskaper mellom kjønnene, mens meta-analyser utført på pasienter-kontrollerte fag pekte på et betydelig større opioid effekt hos kvinner 57. Sistnevnte observasjon, som markert kontrast til hva som har vært funnet hos gnagere, reiser igjen flere spørsmål om opprinnelsen for slike avvik 16,48,55,57. Til sammen kjønnsforskjeller i smertelindring finnes og fortjener ytterligere fokus på underliggende mekanismer og kliniske implikasjoner.Om nociceptive tester
Halen tilbaketrekning test er en spinal refleks, men det kan være gjenstand for supra påvirkninger 58. TIT er relativt lett å utføre på rotter, men krever mer kompetanse hos mus. Et potensielt problem er å holde musen i en riktig stilling uten å indusere uønsket stress. Den foreslåtte protokoll kan bli justert i henhold tilkohort størrelse. 16 dyr (8 kontroll og åtte behandlet) er enkel å håndtere så langt som måling av sine basale nociceptive grenseverdier (ved hjelp av TIT først, deretter TPT for hele serien av mus) er under bekymring. Overvåking analgesi tid kurs krever opprettelse av et nøyaktig tidsskjemaet og evalueringen av den maksimale antall dyr som kan bli testet (TIT først, deretter TPT) innen meddelt tidsintervall (her 30 min). Hele kullet av dyr kan dermed deles inn i undergrupper for å tillate eksperimentator å respektere kinetiske begrensninger.
Betydningen av teknikken med hensyn til eksisterende / Alternative metoder
OIH i rotter versus mus
Rotter har vært mye brukt for å studere opioid analgesi, hyperalgesi og toleranse, ved akutt eller kronisk opiat administrasjon 46,59-61. Faktisk, av flere praktiske grunner, at de kan betraktes som overlegenmus som en dyremodell for smerte eksperimenter 16,61. Men inntil nylig, generering av genmodifiserte rotter var ikke en enkel prosedyre. Som mange genmodifiserte musestammer er allerede tilgjengelig, tilbyr vår modell muligheten til å studere bidrag av mange individuelle gener i OIH og toleranseutvikling hos mus.
TIT og TPT versus andre nociceptive tester
TIT er en variant av halen flick test, den mest åpenbare forskjell er området for stimulering. I kontrast med strålevarme, nedsenking av halen i varmt vann fører til en rask og ensartet økning i temperaturen. Sammenlignet med andre former for termisk nociception testing (hot-plate eller Hargreaves tester), gir TIT ganske reproduserbare resultater både på tvers av og innenfor fag.
TPT er en svært populær test for studiet av mekanisk nociception 26,27,35 som trolig innebærerdistinkte nociceptive fiber og molekylære transdusere deretter TIT 32. Det gir raske og pålitelige målinger 59, men krever litt kompetanse fra eksperimentator og store dyre kohorter. Som et alternativ til den analgesimeter anvendt i foreliggende studie, andre fremgangsmåter eller apparater avhengig av strekklappene finnes (gjennomgang 27). TPT er best egnet for å studere mekanisk hyperalgesi mens von Frey filamenter er vanligvis tatt for å evaluere mekanisk allodyni (review 27).
Fremtidige Applications eller Veibeskrivelse Etter å mestre denne teknikken
Den eksperimentelle OIH / toleranse modellen vi presenterer her kan være like tilpasset genmodifiserte mus for å vurdere rollen til enkelte gener i modulering av smerte. Det gir også et modellsystem for å undersøke effektiviteten av potensielle terapeutiske midler for å lindre kronisk smerte.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. JL. Galzi (UMR7242 CNRS, Illkirch, Frankrike) for hans støtte.
Dette arbeidet ble støttet av CNRS, INSERM, Université de Strasbourg, Alsace BioValley og med tilskudd fra Conectus, Agence National de la Recherche (ANR 08 EBIO 014,02) Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol), Communauté Urbaine de Strasbourg (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Direction Générale des Entreprises (Pharmadol).
Name | Company | Catalog Number | Comments/description |
C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30g) |
Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS n° 52-26-6 | Delivered with special authorization |
Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene; Sterile; Volume : 1 ml |
Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | G26 ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
Mouse restrainer | Home-made | – | Two metallic grids (5x11cm) assembled with adhesive tape and staples. |
Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
STATview software | Free download; Statistics |