In vivo imaging di Optic Nerve Fiber Integrity by MRI Contrast-Enhanced nei topi

Summary

Questo video illustra un metodo, utilizzando un clinico 3 scanner T, per contrasto-enhanced RM del mouse ingenua proiezione visiva e per studi ripetitivi e longitudinali in vivo di degenerazione del nervo ottico associati a lesioni acute ottico schiacciamento del nervo e la degenerazione del nervo ottico cronica topi knock-out (p50 ^KO).

Abstract

Il sistema visivo roditore comprende cellule gangliari della retina e dei loro assoni che formano il nervo ottico per entrare nei centri talamo e mesencefalo, e proiezioni postsinaptici alla corteccia visiva. Sulla base della sua struttura anatomica distinta e comoda accessibilità, è diventato la struttura preferita per gli studi sulla sopravvivenza neuronale, rigenerazione assonale, e la plasticità sinaptica. Recenti progressi in RM hanno permesso la visualizzazione in vivo della parte retino-tectal di questa proiezione utilizzando manganese mediata aumento del contrasto (MEMRI). Qui vi presentiamo un protocollo MEMRI per l'illustrazione della proiezione visiva nei topi, da cui risoluzioni (200 micron) ³ possono essere raggiunti utilizzando comuni 3 scanner Tesla. Dimostriamo come l'iniezione intravitreale di una singola dose di 15 nmol MnCl ₂ porta ad un miglioramento saturo della proiezione intatto entro 24 ore. Con eccezione della retina, cambiamenti di intensità del segnale sono indisidente della coincisa stimolazione visiva o invecchiamento fisiologico. Applichiamo ulteriormente questa tecnica per monitorare longitudinalmente degenerazione assonale in risposta al danno del nervo ottico acuto, un paradigma con il quale Mn ^{2 +} trasporto completamente arresti presso il sito di lesione. Al contrario, attivo Mn ^{2 +} trasporto è quantitativamente proporzionale alla vitalità, il numero e l'attività elettrica delle fibre assoni. Per tale analisi, rappresentiamo Mn ^{2 +} cinetiche di trasporto lungo il percorso visivo in un modello di topo transgenico (NF-kB p50 ^KO) visualizzando atrofia spontanea di sensoriali, tra cui visivi, proiezioni. In questi topi, MEMRI indica ridotta ma non ritardato Mn ^{2 +} trasporto rispetto ai topi wild type, rivelando così segni di alterazioni strutturali e / o funzionali da mutazioni NF-KB.

In sintesi, MEMRI ponti comodamente in vivo e post mortem istologia per il characterizatisu integrità e l'attività delle fibre nervose. E 'molto utile per studi longitudinali sulla degenerazione assonale e rigenerazione, e ricerche di topi mutanti per fenotipi originali o inducibili.

Introduction

Sulla base della sua struttura neuro-anatomica favorevole il sistema visivo roditore offre possibilità uniche per valutare composti farmacologici e la loro capacità di mediare neuroprotezione ¹ o effetti pro-rigenerativi ^2,3. Inoltre, per studi sulle caratteristiche funzionali e neuro-anatomica di mutanti di topo, come recentemente esemplificato per topi privi della proteina ponteggio presinaptica Bassoon ^4. Inoltre, un ampio spettro di strumenti supplementari permette supplementare con delle cellule gangliari retiniche (RGC) e numeri assoni RGC nonché attività RGC, ad esempio, da elettroretinografia e test comportamentali, e la determinazione di riarrangiamenti corticali mediante imaging ottico di segnali intrinseci. Gli ultimi sviluppi tecnici in microscopia laser consentono di visualizzazione situ di RGC rigenerazione profonda dei tessuti imaging di fluorescenza in interi esemplari di montaggio delle nervo ottico (ON) e il cervello. In questo histologapproccio iCal, tetraidrofurano basato radura del tessuto in combinazione con foglio leggero microscopia a fluorescenza permette la risoluzione delle singole fibre che ri-entrare nel deafferented ON e tratto ottico ^5. Mentre tali tecniche possono essere superiori in risoluzione e determinazione della curva di crescita, non consentono analisi ripetitive e longitudinali di eventi di crescita individuali, particolarmente desiderati per valutare il processo di rigenerazione lungo termine.

Contrasto-enhanced MRI è stata impiegata per la visualizzazione minima invasività della proiezione retino-tectal in topi e ratti ^6,7. Ciò può essere ottenuto mediante consegna intraoculare diretta di ioni paramagnetici (ad esempio, Mn ^{2 +)} di cellule retiniche. Come un analogo calcio, Mn ^{2 +} è incorporato in RGC somata tramite i canali del calcio voltaggio-dipendenti e attivamente trasportati lungo il citoscheletro assonale della ON intatta e tratto ottico. Mentre si accumula nei nuclei cerebralidella proiezione visiva, cioè il nucleo genicolato laterale (LGN) e collicolo superiore (SC), la propagazione transsynaptic nella corteccia visiva primaria appare trascurabile ^8,9, anche se può verificarsi ^10,11. Sotto MR sequenziamento, paramagnetica Mn ^{2 +} Potenziati MR contrasto principalmente accorciando T ₁ spin-reticolo tempo di rilassamento ^12. Tale Mn ^{2 +} migliorato MRI (MEMRI) è stato applicato con successo in diversi studi neuro-anatomici e funzionali di ratti, compresa la valutazione della rigenerazione assonale e la degenerazione dopo sul pregiudizio ^13,14, la precisa mappatura anatomica della proiezione ¹⁵ retino-tectal , nonché la determinazione delle caratteristiche trasporto assonale dopo il trattamento farmacologico ^16. Recenti ricerche nel dosaggio, tossicità, e la cinetica dei protocolli MRI neuronali Mn ^{2 +} assorbimento e il trasporto, nonché il miglioramento hanno esteso la sua applicazione agli studi sui transgenicitopi ⁹ con 3 scanner Tesla comunemente utilizzati nella pratica clinica ^17.

Qui vi presentiamo un protocollo MEMRI adatto longitudinale imaging in vivo del mouse retino-tectal proiezione ed esemplificare la sua applicabilità valutando Mn ^{2 +} dipendente potenziamento del segnale in condizioni di neurodegenerazione ingenue e vari. Il nostro protocollo pone particolare enfasi sulla acquisizione dati MR in un moderato 3 T campo magnetico che è generalmente più accessibile rispetto agli scanner di animali dedicati. Nei topi naive, illustriamo come intensità di segnale specifico tratto può essere sostanzialmente e riproducibile diventare aumentata dopo intravitreale (ivit) Mn ^{2 +} applicazione. Quantitativamente, Mn ^{2 +} propagazione lungo la proiezione visiva si verifica indipendentemente dal normale processo di invecchiamento (misurata tra 3 e 26 mesi di età topi) e aumento è refrattario alla stimolazione visiva e l'adattamento all'oscurità. Al contrario, Mn 18, così come in NFKB1 topi knock-out (p50 ^KO) affetti da spontanea morte apoptotica RGC e sulla degenerazione ^19. Così, in espansione per analisi istologica convenzionale, longitudinale analisi MEMRI singoli animali ha la profilatura della cinetica uniche di processi neurodegenerativi. Questo dovrebbe rivelarsi utile per gli studi sulla neuroprotezione e rigenerazione assonale associati a interventi farmacologici o genetici.

Protocol

Tutti gli interventi di animali vengono eseguite in conformità con la Convenzione europea per la cura degli animali ed uso di animali da laboratorio e la Dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research. Tutti gli esperimenti sono approvate dal comitato etico locale. La procedura di lesioni ON nei topi è descritto altrove ^9.

1. Intravitreali Manganese Injection

1. Eseguire la Mn ^{2 +} iniezione di 24 ore prima della MR scansione con l'aiuto di un assistente. Anestetizzare gli animali mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione di cloralio idrato 5% (420-450 mg / kg di peso corporeo in PBS sterile). Per ulteriori anestesia topica, applicare una goccia di liquido conjuncain (0,4% ossibuprocaina cloridrato) alla cornea prima puntura occhio. Per iniettare 15 nmol Mn ^{2 +} per occhio preparare una MnCl mM soluzione 7.5 _2, ad esempio, diluendo 1 L di 1 M MnCl ₂ stock soluzione in 132 LH _{2 <}/ Sub> O. Carico 5 microlitri della soluzione finale in una siringa da 5 microlitri Hamilton collegato ad un piccolo mozzo dell'ago rimovibile 34 G (RN ago).
2. Quando si avvia con l'occhio destro, posizionare il mouse a sinistra lati sotto un microscopio binoculare e delicatamente aperto e fissare l'occhio destro tra il pollice e l'indice della mano sinistra. Raccogliete la siringa con la mano destra e prendere in mano l'ago vicino alla punta. Per puntura atraumatica del bulbo oculare, inserire con attenzione l'ago nel corpo vitreo alla circonferenza infero-temporale di circa 1 mm distale al limbus, risparmiando quindi i vasi sclerali.
3. Successivamente, l'assistente applica lentamente il volume totale di 2 ml controllando la scala della siringa Hamilton. Durante questa procedura, controllare il posizionamento dell'ago ottimale sotto il microscopio ed evitare la puntura della lente o fuoriuscita del liquido. Tenere l'ago staticamente inserito, per altri 30 sec, quindi estrarre lentamente per minimizzare liquidofuoriuscite dal sito di iniezione.
4. Durante tutta la procedura, particolare attenzione deve essere presa per evitare la pressione per l'occhio. Allo stesso modo, evitare i tentativi aggressivi o numerosi per bucare il bulbo oculare. Dal Mn ^{2 +} assorbimento in RGC e di trasporto lungo l'ON è già saturo a 15 nmol MnCl _2, questo riduce al minimo le variazioni di segnale da volumi di iniezione leggermente imprecisi. Per il potenziamento del segnale bilaterale della proiezione visiva, ripetere la procedura di iniezione per l'occhio sinistro.
5. Applicare ofloxacina contenenti (3 mg / ml) collirio e pomata-pantenolo contenente una volta dopo la procedura per prevenire le infezioni oculari e asciugatura dell'occhio. Restituire i topi nelle loro gabbie ma in condizioni normali fino all'inizio della scansione MR.

2. Preparazione degli animali MRI

1. Anestetizzare il mouse mediante somministrazione di una miscela di gas isoflurano / ossigeno 2% / 98%. Montare il mouse su un supporto per mouse in una posizione torti quasi orizzontale. Insert in bobina MR, e viene modificata all'interno dello scanner MR. Monitorare la respirazione e la frequenza cardiaca da sistemi adeguati. Per i dettagli tecnici, consultare Herrmann et al ^20.
2. Durante MRI, deposito di anestesia mediante insufflazione continua di un 1,5% / 98,5% miscela di gas inizialmente isoflurano / ossigeno tramite un evaporatore collegato al supporto della testina di topo da un tubo integrato. Durante la scansione, regolare la profondità di anestesia in base ai parametri vitali registrati (cioè puntare ad una frequenza respiratoria stabile di circa 40 respiri al minuto). Utilizzando un dispositivo di riscaldamento a mantenere la temperatura della superficie corporea stabile tra 35 e 37 ° C, come misurato da un sensore termico posizionato al sito addominale del mouse. Per i dettagli tecnici, consultare Herrmann et al ^17.
3. Dopo la scansione, di liberare il mouse dal supporto e la fornitura di ossigeno puro per accelerare il recupero dall'anestesia. Inoltre, mantenere la temperatura corporea stabile utilizzandouna fonte di calore luce rossa.

3. MRI protocollo

1. Il protocollo è validato per un Tesla scanner 3, dotata di una SNR-efficiente, piccola bobina animale dedicato (bobina Litz linearmente polarizzata) con un campo efficace di vista di 35 mm × 38 mm di diametro. Azionare la bobina in modalità di trasmissione-ricezione.
2. Con l'animale nella sua posizione finale, regolare la sintonia e corrispondenza della bobina con l'ausilio di un analizzatore di frequenza. Regolare manualmente la tensione di riferimento del trasmettitore e le correnti spessori per ottimizzare l'omogeneità di immagine e qualità.
3. Acquisire T ₁ pesate immagini 2D TSE con una risoluzione di 0,5 mm × 0,5 millimetri × 2 mm di vista sagittale e trasversale per la pianificazione. Utilizzando i pianificazione esami di risonanza magnetica, acquisire le immagini MEMR in direzione di misura coronale, ruotato di essere parallela alla testa dell'animale con la codifica di fase lungo la direzione sinistra-destra. Per minimizzare il tempo di acquisizione, utilizzare un campo rettangolare di vista adeguato allaDimensioni della testina reali. Impiegare una sequenza FLASH 3D viziato (VIBE 3D) utilizzando i seguenti parametri: matrice di base 256, campo visivo 54 millimetri × 50,65 millimetri x 14,08 millimetri, con il 93,8% del campo rettangolare di vista in fase di direzione codificare, e 128 fette di 0,11 mm spessore della fetta con una risoluzione fetta impostata a 61%.
4. Attivare l'interpolazione nel piano per creare immagini finali con 512 × 480 × 128, fornendo una risoluzione effettiva di 0,21 mm x 0,21 millimetri × 0,18 millimetri (0.1 mm × 0,1 millimetri × 0,09 millimetri interpolati), tempo di eco T _E = 6.51 msec, tempo di ripetizione T _R = 16 msec, larghezza di banda = 160 Hz / px, flip angle = 22 °. Applicare due medie e tre ripetizioni per ottenere un tempo totale di acquisizione (T _A) di circa 30 min.

4. MRI Analisi dei dati

1. Analizzare i dati utilizzando il software fastView syngo. Per il potenziamento del segnale quantitativa, selezionare le regioni definite of interesse in 2D planari registrazioni MRI e determinare intensità di segnale (SI) della struttura migliorata (SI _MEMRI), sfondo di tessuto (SI _Priorità), e la deviazione standard del rumore (SD _N). Se necessario, utilizzare un atlante del cervello mouse per facilitare l'orientamento neuro-anatomico per LGN e le strutture SC. Calcolare il rapporto di contrasto-rumore (CNR) mediante la formula:
2. CNR = (SI _MEMRI - SI _Priorità) / SD _N
3. Quantificare tre immagini consecutive per il calcolo della media CNR per ogni campione. Negli animali bilateralmente iniettati, analizzare ogni emisfero indipendente.
4. Per la rappresentazione di immagini orizzontali, coronali e sagittali, calcolare ricostruzioni multiplanari dal set di dati 3D MRI originale. Queste immagini elaborate non sono raccomandati per l'analisi quantitativa. Per creare ricostruzioni 3D animati (proiezioni di massima intensità, MIPS) del retino-Tectal proiezione, utilizzare un modulo software di post-elaborazione angiografia.

5. Mn ^{2 +} Autometallography (TIMM colorazione)

1. Per TIMM colorazione di Mn ² strutture cerebrali ⁺ tracciate seguendo MEMRI, iniettare una dose di 15-150 nmol Mn ^{2 +} ivit 24 ore prima di imaging.
2. Dopo la scansione del MR, profumato gli animali con 30 ml ghiacciata 0,325% Na ₂ S in PBS (pH 7,4). Sezionare retine e congelare i campioni nella sezione congelata.
3. Tagliare sequenziali, sezioni equatoriali di spessore 15 micron su un cryotome.
4. Eseguire TIMM colorazione ²¹ in assenza di fissativo e crioprotezione secondo Angenstein et al ^22.

6. Analisi statistica

Effettuare analisi statistiche utilizzando il test t di Student per singoli confronti, seguita da post hoc ANOVA. I dati sono presentati come media ± errore standard. Numeri individuali N sonoindicati separatamente per ciascun esperimento. Risultati raggiungendo P ≤ 0,05 sono considerati statisticamente significativi (P ≤ 0.05, *; P ≤ 0.01, **; P ≤ 0,001, ***).

Representative Results

La capacità di questa tecnica di imaging per valutare con precisione la vitalità e la funzionalità della proiezione visiva si basa su una precisa applicazione di un tossico Mn ^{2 +} dosaggio al corpo vitreo e il suo assorbimento da RGC. Questo importante assunzione viene testato in Figura 1, dove strato specifico Mn ^{2 +} assorbimento è dimostrato dal autometallography (TIMM colorazione) ^21. Sezioni retina sono state analizzate a 24 ore dopo l'applicazione di una ivit 15 nmol o 150 nmol Mn ^{2 +,} o PBS come controllo. A questo punto nel tempo, le Mn ^{2 +} retine iniettati mostrano la massima amplificazione dei segnali in T ₁ pesate (N = 3; linee tratteggiate), mentre il PBS iniettato retina non è aumentata in segnale (N = 3; linea tratteggiata) (Figura 1 , pannello di sinistra). Notare il potenziamento del segnale hyperintensive negli occhi iniettati 150 nmol. Al contrario, le aree del cervello nonenhanced (asterischi) mostrano analoghe intensità di segnale di fondo per tutti i conditions (colore verde). Ivit Mn aumenti ^{2 +} applicazione Colorazione generale TIMM soprattutto nello strato RGC e strato delle fibre nervose (NFL) (Figura 1, inserti ingranditi nel pannello centrale), che sono confermate dalle indagini dei singoli somata RGC seguente H & E co-etichettatura (pannello di destra).

Per l'imaging in vivo del mouse retino-tectal proiezione, è fondamentale selezionare uno speciale protocollo MEMRI topo dove i parametri operativi insieme alle attrezzature, secondo quanto illustrato nella figura 2, sono atti ad analizzare topi in un campo 3 T. L'applicazione di una tale impostazione scanner, il nostro precedente lavoro ha rivelato che per la risoluzione delle immagini CNS una bobina testa di topo è superiore ad un topo intero bobina per il corpo dedicato ^17. Per fissare la testa murino e per regolare correttamente la sua posizione all'interno della bobina di ratto, si usa una culla e un tubo conico con bar morso di plastica, che sono entrambi ridimensionato per soddisfare le dimensioni del corpodi topi (figure 2A, B). Quando le immagini vengono acquisite su una matrice ponderata trasversale T ₁ attuazione gradiente sequenze eco 3D, la generazione di immagini ad alta risoluzione di (200 micron) ³ entro 35 min di tempo di acquisizione può essere previsto. Si consiglia vivamente il costante monitoraggio delle funzioni vitali durante la scansione. Adeguamento di anestesia con postimaging ossigenazione e il controllo della temperatura corporea accelera notevolmente i tempi di recupero e garantisce tassi di sopravvivenza di circa il 100%. Tali precauzioni tecniche sono essenziali per garantire che tutta la coorte sosterrà MRI longitudinale e ripetitivo.

In ogni studio, solo un Mn ^{2 +} dosaggio tossico di 15 nmol deve essere usato per applicazioni ivit ^9, che è sufficiente a migliorare prominente CNRS nella retina, ON, e tratto ottico fino al LGN intracerebrale presinaptica e SC. I valori CNR sono più calcolate a partire da 200 micron di spessore trasversalefettine ottenute da originali insiemi di dati di risonanza magnetica reslicing il volume 3D isotropo originale. Figura 3A mostra un esempio di determinazione CNR preciso per la maggiore LGN, dove vengono selezionati tre regioni di interesse in ogni immagine per (1) zona segnale avanzata (SI _MEMRI ), (2) tessuto non affine cervello (SI _Priorità), e (3) il rumore di fondo (SD _N). La prevedibile miglioramento del segnale spaziale quantificato lungo la totalità di una singola proiezione visiva è presentato in Figura 3B. Si noti il ​​forte aumento graduale di miglioramento del segnale in sezioni retiniche lungo il piano dorsoventral, con un picco di testa del nervo ottico. Inoltre, nota la mancanza di un rilevante transsynaptic Mn ^{2 +} propagazione in strati corticali nelle condizioni sperimentali applicate (caduta del segnale nella corteccia visiva). MIP sono altamente illustrativo di visualizzare il posizionamento 3D della proiezione retino-tectal in toto (Movie 1). Laccumulation di Mn ^{2 +} lungo la proiezione visiva è determinato dalla cinetica di captazione intracellulare in RGC in tensione dipendenti Ca ^{2 +} canali e la sua veloce trasporto assonale, così come dal livello relativamente bassa clearance dal tessuto bersaglio ^13. Secondo i nostri studi cinetici precedenti, Mn ^{2 +} dipendente potenziamento del segnale può essere rilevato già dal 6 ore dopo l'iniezione. E ulteriori picchi a 24 ore e diminuisce torna ai livelli basali entro 120 ore dopo l'iniezione ^9. Pertanto, per ottenere risultati ottimali, MEMRI deve essere eseguita 24 ore dopo l'iniezione, che rappresenta la metà del tempo richiesto di supporto per i ratti ^13.

Dopo aver delineato il principio per migliorare il contrasto della proiezione visiva da MEMRI, comunichiamo ulteriormente le influenze di due parametri - condizioni di luce e di animali di età - che possono influire sulle misurazioni quantitative:

(1) Per testare fo accumulo stimolo-dipendente di Mn ^{2 +} nei centri mesencefalo, i topi sono stati tenuti a condizioni stimolati luci ottenuto tramite torcia esposizione di una frequenza definita (5 Hz) e intensità luminosa (LED 3 W) o al buio completo prima della scansione e durante 24 ore di Mn ^{2 +} esposizione. L'analisi quantitativa del CNR 24 ore dopo ivit Mn ^{2 +} applicazione rivela un significativo aumento dell'intensità di retine adattata al buio segnale rispetto a condizioni di luce stimolata (66.29 ± 3.07 vs 54.56 ± 3.08, P ≤ 0,05, N = 7 / 8; Figura 3C). Dato il gradiente nel miglioramento del segnale tra la retina periferica e la testa del nervo ottico (vedere Figura 3B), abbiamo assicurato analizzare sempre corrispondenti sezioni retiniche entro tutti i gruppi sperimentali. Analisi di immagine secondo il piano ventrodorsale rivelato, come previsto, che i valori assoluti CNR sono in discesa in entrambe le condizioni. È importante sottolineare che la reldifferenza di segnale ative tra il buio e la luce retine adattato rimane persistente (dati non riportati). Tuttavia, il miglioramento del segnale nelle aree di proiezione di LGN (26,97 ± 1,78 vs 26,58 ± 1,05, p = 0.9, N = 7-2) e SC (25,09 ± 1,24 vs 26,81 ± 1,55, p = 0.4, N = 7 / 8) è indistinguibile tra gli ambienti di condizionamento chiari e scuri (Figura 3C). Questo test dimostra che l'assorbimento di Mn ^{2 +} in strati retinici è sensibile all'esposizione alla luce, mentre la sua propagazione lungo la proiezione retino-tectal e l'accumulo in aree bersaglio non è influenzata dalla stimolazione visiva coincidenti. In alternativa, la sensibilità dello scanner 3 T segnale potrebbe essere inferiore alla soglia di rilevamento di variazione del segnale nel LGN o SC.

(2) Per esplorare le implicazioni di età dell'animale sul potenziamento del segnale MEMRI correlata della proiezione visiva, abbiamo analizzato i topi tra i 3 ei 26 mesi ol'età f. I valori CNR nel LGN di 3 mesi topi (23,49 ± 1,36, N = 12) non differisce da l'intensità del segnale misurata in topi di età compresa tra 7 mesi (23,90 ± 0,81, p = 0,79, N = 16), 13 mesi (23.35 ± 1.29, p = 0.94, n = 10) o 26 mesi (25.10 ± 2.29, p = 0.53, n = 6; Figura 3D). Allo stesso modo, l'intensità del segnale in SC è invariato tra i 3 mesi (19,01 ± 1,20) e 26 mesi di età (16.92 ± 2.18, p = 0.37; Figura 3D). Nonostante un leggero aumento è evidente nei valori CNR di 26 mesi di età retine (38,49 ± 3,25), tale aumento non raggiungeva la significatività rispetto in tutti i gruppi (P> 0.05). Questi esperimenti indicano che il miglioramento del segnale in aree cerebrali bersaglio della proiezione visiva è influenzata dalla stimolazione visiva e invecchiamento fisiologico.

Successivamente, dimostriamo la sensibilità del MEMRI per rilevare alterazioni strutturali of la proiezione visiva causata da axonopathy acuta e cronica. Per esplorare questo, un modello di degenerazione Walleriana indotta da lesione traumatica ON ^18, nonché un modello animale visualizzazione precoce, degenerazione spontanea di proiezioni sensoriali tra cui la via visiva ¹⁹ sono stati impiegati:

(1) axonopathy traumatico indotta da ON lesione da schiacciamento provoca la rottura di Axona fascicoli. Di conseguenza, trasporto retino-tectal di Mn ^{2 +} lungo il citoscheletro assonale sarà completamente bloccato e sostenibile, come visualizzato mediante completa perdita di Mn ^{2 +} segnale migliorata nel LGN e SC analizzato una giornata (non illustrata), una settimana (Figura 4A , linee tratteggiate), e 4 settimane (non mostrati) inserisci lesioni. Per dimostrare chiaramente le caratteristiche MR neuroanatomici e consecutivi di lesioni ON e sezionare loro dallo stato ingenuo, la lesione è stata inflitta solo unilateralmente. Ciò si traduce in inalterato Mn ^{2 +} trasporto su tegli controlla lato in contrasto con interruzione tracciante sul lato dell'intervento. Analisi dei valori CNR nelle aree deafferented conferma la completa assenza di amplificazione dei segnali (non mostrato). Questo esperimento dimostra ulteriormente che MEMRI è altamente sensibile nel rilevare la posizione e la gravità di un sito di lesione da valutazione longitudinale dell'intensità del segnale lungo la proiezione prima e dopo la lesione (Figura 4B). Mentre l'intensità del segnale lungo il ON prima lesione rimane costantemente sopra il segnale di fondo, vi è un calo temporospaziale dell'intensità del segnale al livello di fondo un giorno dopo lesione ON.

(2) Il nostro lavoro precedente ha dimostrato che Mn ^{2 +} potenziamento del segnale dipendenti nel LGN è ridotta in 10 mesi topi privi della subunità p50 NF-kB, misurata 24 ore dopo l'iniezione ^9. Rilevare questo con un alto consistenza, abbiamo assunto un deterioramento generale retino-tectal Mn ^{2 +} transporto, forse causata da un numero ridotto di RGCs e legate ON neuropatia nell'invecchiamento p50 ^KO topi ^19. In alternativa, l'amplificazione dei segnali ridotta potrebbe essere associato con un assorbimento neuronale ritardato e propagazione di Mn ^{2 +} dal corpo vitreo e lungo la proiezione patologica. Quest'ultima possibilità può essere esplorata eseguendo scansioni MR ripetitivi dopo una singola applicazione di 15 nmol Mn ^{2 +} e studiare la cinetica di miglioramento del segnale nella retina e LGN a presto (8 e 24 ore) e tardiva (48 e 72 ore) tempo punti. In wild type e P50 topi ^KO, retiniche picchi di aumento del segnale a 8 ore tassi quasi identici aumento (43,52 ± 3,24 e 40,72 ± 2,79, p = 0,6, N = 3-6; la figura 4C, a sinistra). Mentre il miglioramento del segnale rimane alto nei tipi selvatici a 24 ore dopo l'iniezione, si declina in p50 topi ^KO (43.38 ± 2.18 vs 32.89 ± 1.54; P ≤ 0,01, N = 5-8). Durante le fasi successive (48 e 72 ore), il miglioramento del segnale diminuisce in entrambi i gruppi (con i valori CNR costantemente più bassi nei topi knock-out), escludendo così un ritardo della retina Mn ^{2 +} captazione e la propagazione di p50 topi ^KO. I corrispondenti risultati nella LGN di p50 topi ^KO confermano questa idea. Sebbene il CNR è significativamente più basso tra 8 e 48 ore post-iniezione (P ≤ 0,05, N = 5-9), la cinetica di attenuazione del segnale in p50 ^KO topi corrisponde a quello in topi wild type (Figura 4C, destra). Così, la riduzione potenziamento del segnale temporo-spaziale della proiezione retino-tectal è dovuto al numero ridotto degli assoni provenienti da una popolazione limitata RGC piuttosto che la cinetica di trasporto deteriorate. Proponiamo MEMRI ad essere un valido strumento per lo screening di mutanti genetici del mouse per perdite di valore proiettivo nel SNC.

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Figura 1. TIMM colorazione di Mn ^{2 +} assorbimento in RGCs. Calore sugli rappresentative immagini di T ₁ ponderata risonanza magnetica (MRI T ₁₎ mostrano il miglioramento del segnale della lente e tutta la circonferenza della retina (linea tratteggiata) 24 ore dopo l'applicazione ivit di 15 nmol, e la valorizzazione del segnale ad alta intensità di iper dopo l'applicazione di 150 nmol Mn ^{2 +} (a sinistra). I colori caldi rappresentano i valori dei segnali più elevati rispetto colori freddi. Scala bar: 1 mm. Middle / destra: Mn ^{2 +} assorbimento da parte RGC dopo l'iniezione ivit di MnCl _2, come rilevato da precipitazione argento utilizzando TIMM colorazione (colore nero). Sezioni retina di controllo trattati con PBS dimostrano colorazione piuttosto debole e differenziazione diffusa dello strato RGC (RGC) (top; N = 3). Alto ingrandimento non permette d. iscriminazione di singole cellule (inserti ingrandita) Ivit MnCl ₂ applicazione aumenta differenziale colorazione argento complessiva di tutti gli strati della retina, con un importante precipitazioni argento soprattutto nello strato delle fibre nervose (NFL), RGC strato e strato nucleare interno (INL, centro e in basso , inserti ingrandita; N = 3). Colabeling di TIMM con colorazione H & E conferma ulteriormente tale strato specifico Mn ^{2 +} accumulo (pannello di destra). Bar Scala, panoramica: 50 micron, ingrandimento: 25 micron. IPL, strato plessiforme interno; OPL, strato plessiforme esterno; ONL, strato nucleare esterno; RPE, dell'epitelio pigmentato retinico.

Figura 2. Fotografie che mostrano apparecchiature MRI specificamente per il mouse MEMR acquisizione di immagini su uno scanner 3T clinico. A) mostra la culla del mouse su misura con bite fissazione testa bar e il sensore per il monitoraggio delle vie respiratorie (tampone bianco, tubo blu). B) mostra il mouse posizionato e fissato nella culla. I tubi per l'alimentazione sinistra. C gas anestetico) esemplifica il posizionamento della testa del mouse e culla all'interno della bobina Litz polarizzata linearmente operante in trasmissione e ricezione. D) indica il basamento bobina di fronte al tubo di schermatura e la clinica 3 T scanner. Il tubo rivestito di rame fornisce una schermatura aggiuntiva dal rumore e blocca il segnale MRI dal tappetino riscaldamento ad acqua calda a base (involucro nero intorno al tubo). E) visualizza il set-up completo della bobina animali all'interno del poro dello scanner 3 T solo prima del posizionamento della testa di animale proprio all'isocentro all'interno dello scanner.

Figura 3. MEMRI della proiezione retino-tectal naïve in varie condizioni di luce e di età. A) Illustrazione della regione di interesse (ROI) mappatura in maggiore LGN e del tessuto sfondo a una risonanza magnetica trasversale registrazione (a sinistra). LGN specifico potenziamento del segnale è illustrato da mappa di calore presentazione (a destra). 1 e 1 ', a sinistra ea destra LGN; 2 e 2 ', tessuto di fondo; 3, il rumore; P, posteriore; R, a destra. Scala bar:. 100 micron B) mappatura spaziale di miglioramento del segnale lungo una singola proiezione retino-tectal come determinato dalla originariamente acquisiti trasversale MR fette di immagine da MEMRI. Piazze piene, Mn ^{2 +} dipendente amplificazione dei segnali; triangoli aperti, segnale di fondo. R, retina; ON, nervo ottico; OT, tratto ottico; LGN, nucleo genicolato laterale; SC, collicolo superiore; VC, corteccia visiva. Spessore della fetta, 200 micron. C) la stimolazione della luce riduce significativamente retina miglioramento del segnale. Enhancement nel LGN e SC è indipendente dalla stimolazione visiva. Cerchi pieni, adattamento al buio; cerchi aperti, adattamento alla luce. D) potenziamento del segnale è indipendente l'aumentare dell'età tra i 3 ei 26 mesi.

Figura 4. MEMRI della proiezione retino-tectal in condizioni neurodegenerative. A) MEMRI di topi iniettati bilateralmente ivit effettuata una settimana dopo la lesione da schiacciamento unilaterale del diritto ON. Ricostruzioni multiplanari di vedute orizzontali, coronali e laterali raffigurano completa assenza di enhancement del segnale nel LGN e SC per l'emisfero feriti (linee tratteggiate). c, emisfero controlaterale; i, emisfero ipsilaterale. Barra della scala: 1. Mm B) immagini MIP e analisi MRI longitudinale del potenziamento del segnale spaziale lungo la prima eun giorno dopo lesione. R, retina; ON, nervo ottico; freccia, luogo della lesione. Barra della scala:.. 0,5 millimetri C) Cinetica di miglioramento del segnale sotto neurodegenerazione cronica della proiezione visiva di p50 topi ^KO anticipata (8 ore) assorbimento di Mn ^{2 +} in cellule retiniche non è interessato, ma è già ridotta nel LGN di p50 topi ^KO. Repetitive RM a 24, 48, e (solo per retina) a 72 ore mostra riduzione del segnale sostenuta, ma cinetica simili di Mn ^{2 +} trasporto e l'accumulo nella retina e LGN di p50 topi ^KO.

Movie 1: Animated, calore-map presentazione 3D in situ con mdc retino-tectal proiezione RM è stata eseguita 24 ore dopo l'iniezione ivit bilaterale del 15 nmol MnCl _2.. I dati sono presentati nella modalità MIP. Spessore della fetta, 200 micron. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4" target = "_blank"> Cliccare qui per visualizzare questo video.

Discussion

MEMRI del sistema visivo si estende tecniche neurobiologiche convenzionali per valutare la funzionalità in condizioni ingenue e patologiche. Oltre ad una visione unica l'integrità di un isolato fibra tratto CNS, MEMRI può essere facilmente integrato con test comportamentali, per esempio, optometria e compiti a base di acqua visivamente, di indagare le conseguenze immediate di un dato paradigma per la percezione visiva. Si collega anche elettrofisiologici e le indagini istologiche con caratterizzazione visiva funzionale in vivo. La tecnica è altamente affidabile e riproducibile con variazioni minori interindividuale all'interno dei gruppi identici (vedi barre di errore in figure 3, 4). Curiosamente, alla dose di 15 nmol, Mn ^{2 +} assorbimento e il trasporto assonale sono processi saturo, in modo che il miglioramento del segnale raggiunge un plateau che non può essere elevata mediante ulteriori Mn ^{2 +} alimentazione ^9. Da un punto divisualizzare, la risposta alla dose minimizza tali caratteristiche, almeno in una certa misura, iniezione variazioni associate in aumento del segnale. In particolare, i dati presentati della posologia e della cinetica di Mn ^{2 +} amplificazione dei segnali sono specifici per i topi e distinti da quelli dei ratti, che richiedono un approssimativamente 10-20x superiore Mn ^{2 +} dosaggio e aumento della latenza (36 hr) per raggiungere il miglioramento ottimale contrasto ^13,23. Inoltre, il miglioramento lungo la proiezione visiva rimane costante tra un'età animale di 3 e 26 mesi. Questo risultato è in linea con i test della vista effettuati su topi anziani e il fatto che i topi C57/B6 mantenere la normale attività visiva fino a 2 anni di ²⁴ anni. Anche se non abbiamo analizziamo i singoli topi longitudinalmente nello studio dell'invecchiamento, precedenti risultati dimostrano chiaramente la sicurezza dei ripetutamente somministrati Mn ^{2 +} dosaggi di 15 nmol per la manutenzione visivo ^9, che potrebbe desiderare in studi longitudinali di invecchiamento.

In conformità con la nozione che Mn ^{2 +} è incorporato RGC, mostriamo Mn ^{2 +} assorbimento nel loro somata da TIMM colorazione che si basa sulla precipitazione argento di ioni metallici liberi, come applicato dal Angenstein et al. Intracerebrale di Mn ^{2 +} rilevamento seguente sua applicazione sistemica ^22. In precedenza, intracerebrale Mn ^{2 +} distribuzione è stata rilevata mediante autoradiografia di ⁵⁴ Mn ^{2 +} isotopo delineare circuiti neuronali del ratto CNS ^25, ma non a livello cellulare. Qui, TIMM colorazione permette l'attribuzione di Mn ^{2 +} assorbimento di distinte popolazioni cellulari all'interno della retina a vista, dove troviamo prominente precipitazioni argento nel RGC e strati di fibre nervose. Va osservato che il protocollo applicativo mostra rilevamento migliorato di TIMM colorazione dopo l'applicazione di una dose di 150 nmol rispetto al 15 nmol Mn ^{2 +.} Anche se Mn ^{2 +} captazione e la sua assonale transporto sono già saturo a 15 nmol, quindi, conferisce nessun ulteriore aumento CNR lungo la proiezione retino-tectal a dosaggi più alti, eccessiva supplementazione potrebbe aumentare la disponibilità di libero, la proteina non legata Mn ^{2 +} e quindi rendere accessibile per la precipitazione di argento. Filtri futuri nella sensibilità colorazione permetterà la correlazione dei valori CNR-based MEMRI di specifiche proiezioni SNC con la localizzazione cellulare di Mn ^{2 +} arricchimento all'interno di una regione istologico definito. Tale capacità potrebbe anche essere utile per la caratterizzazione e la quantificazione di Mn ^{2 +} distribuzione in altre regioni del SNC fuori della proiezione visiva. Allo stesso modo, Mn ^{2 +} è stato impiegato in un modello di tossicità kainate per visualizzarne la degenerazione e rigenerazione delle fibre muschiose dell'ippocampo ^26.

Mn ^{2 +} è occupato da canali del calcio voltaggio dipendenti ed è intracellulare distribuito da trasporto assonale attivo, che can essere bloccato da trattamento con la colchicina ^25,27. Esperimenti visivi stimolazione su ratti trattati con una dose intraperitoneale di MnCl ₂ hanno rivelato una maggiore amplificazione dei segnali nel interno e, in particolare, retina esterna ^28. In tal modo, l'adattamento al buio aumenta ulteriormente intensità di segnale negli strati retinici esterni rispetto ai ratti esposti solo a condizioni di luce ambiente, indicando così la sensibilità della retina Mn ^{2 +} assorbimento di stimolazione visiva ^28. Analogamente, troviamo intensità del segnale maggiore nella retina di topi adattate scuri rispetto ai topi esposti alla stimolazione visiva dopo ivit Mn ^{2 +} applicazione. Questo potrebbe essere correlato alle specifiche proprietà elettrofisiologiche della retina e la generazione di una corrente continua scuro in cellule fotorecettrici. Da Ca ^{2 +} afflusso in segmenti esterni dei fotorecettori contribuisce in modo significativo alla costituzione della corrente di buio, la loro generazione potrebbe essere accompagnatada una maggiore co-uptake di Mn ^{2 +} nello strato di cellule fotorecettori nelle tenebre. Al contrario, la stimolazione luce riduce la corrente di buio e provoca iperpolarizzazione delle cellule fotorecettrici ^29. In tal modo, il grado di Mn ^{2 +} assorbimento potrebbero essere diminuita in condizioni di luce.

Per uso affidabile di MEMRI, è importante chiarire se il più pronunciato Mn ^{2 +} assorbimento nella retina adattata al buio altera amplificazione dei segnali lungo altre parti della proiezione visiva o anche la sua intera estensione. Cambiamenti stimolazione-dipendenti intensità segnale MEMRI di reti cerebrali sono state dimostrate per il sistema acustico dopo intraperitoneale Mn ^{2 +} applicazione ^30. In questo studio da Yu et al., I ratti sono stati esposti a frequenze di rumore variabile prima le scansioni MR e T ₁ pesata valorizzazione del collicolo inferiore segnale è stato successivamente studiato. Stimolazione acustica è risultata RILIEVOtemente aumentare intensità di segnale MEMRI in una rappresentazione tonotopic, esemplificando così il carattere fMRI-come attività-dipendente Mn ^{2 +} accumulo ^30. Al contrario, nel nostro sperimentale costituito Mn ^{2 +} accumulo nel LGN e SC appare indipendente dalla stimolazione visiva. Tuttavia, tali differenze sensoriali tentativi mappatura cervello potrebbero derivare dal campo magnetico inferiore e la soglia limitato di rilevamento della nostra scanner 3 T rispetto al alto campo 7 scanner T utilizzato da Yu et al ^30.

Ad oggi, non si sa in quale misura i parametri biofisici influenzano anterograda trasporto assonale di Mn ^{2 +} e come MEMRI può servire come indicatore di attività elettrica. Tuttavia, sembra che Mn ^{2 +} trasmissione RGC avviene, almeno in parte, indipendentemente dalla stimolazione specifica luce e ingresso elettrico ricevuto da cellule bipolari. In alternativa, l'effetto netto di una elettricactivity all'interno della proiezione retino-tectal potrebbe essere il risultato di stimolazione elettrica del dark-reattivo 'OFF-RGCs' e leggero-reattivo 'ON-RGCs'. Tale interpretazione è sostenuta dalla constatazione che Mn ^{2 +} trasporto lungo la proiezione retino-tectal non è ridotto in ceppi di topi con problemi di vista, come i topi CBA che portano la RD1 mutazione del gene PDE6B che causa degenerazione retinica ^11. In uno studio cinetico sulla wild type topi vedenti e CBA, sono stati osservati tassi di trasporto comparabili durante la fase di afflusso iniziale (a 2,5 ore dopo l'iniezione) e per il miglioramento del segnale finale (a 24 ore) in LGN e SC ^11.

Nel loro insieme, queste osservazioni supportano l'idea che MEMRI, ad esempio, del sistema visivo, come esemplificato qui, rappresenta una misura importante per l'integrità strutturale e la stabilità metabolica piuttosto che per attività elettrica. In pratica, l'apparentemente sTavolo indipendenza del potenziamento del segnale in LGN cerebrale e SC da esposizione alla luce consente una gestione solida e custodia di animali senza particolare attenzione per quanto riguarda l'illuminazione. D'altra parte, per studi MEMRI che cercano di retinica intensificazione del segnale, è necessario tenere gli animali in condizioni di luce strettamente controllate prima della scansione.

Tra i parametri fisiologici che influenzano Mn ^{2 +} il prezzo del trasporto assonale e la conseguente intensificazione del segnale MEMRI, stabilità della temperatura corporea potrebbe essere di particolare importanza. Questo è indicato da studi su intranasale Mn ^{2 +} per la valorizzazione di obiettivi primari proiezione olfattivi nel cervello, dove è stato trovato arricchimento essere significativamente diminuita ad una riduzione temporanea della temperatura corporea di 30 ° C rispetto a segnalare enhancement alla temperatura normale del corpo ^27. Pertanto, la temperatura corporea deve essere monitorato e regolato prima e durante il MR scansioni non solo di protect salute degli animali, ma anche per normalizzare i parametri fisiologici di Mn ^{2 +} propagazione.

Poiché alterazioni fisiopatologiche e disturbi metabolici influenzano l'efficacia trasporto assonale di Mn ^{2 +,} miglioramento del segnale in centri di proiezione, per esempio, LGN e SC, possono servire come misura per l'integrità strutturale ed attività funzionale di questa via. Qui, presentiamo due diverse condizioni di ON degenerazione e illustrare che Mn ^{2 +} propagazione e l'arricchimento in centri talamiche e mesencefalo varia in funzione dell'integrità assonale. Acuta su risultati di pregiudizio in una perdita totale del segnale subito dopo l'infortunio, che non si risolva entro quattro settimane a causa della mancanza di rilevante rigenerazione assonale, mentre lenta degenerazione assonale nel p50 ^KO mutante si riflette da una riduzione dei valori del CNR nel LGN. Data la possibilità dell'imaging longitudinale, questa applicazione di MEMRI potrebbe essere prezioso fo il monitoraggio risposte di crescita postlesional di ON e consentire la ricerca di interventi genetici o farmacologici proregenerative a RGCs.

Inoltre, presentiamo MEMRI come un metodo altamente sensibile per rilevare menomazioni graduali amplificazione dei segnali che sono associati con i processi di degenerazione assonale croniche. Il fattore di trascrizione NF-kB è coinvolto nella manutenzione neuronale e topi con delezione della subunità p50 di NF-kB visualizzazione dipendente dall'età perdita neuronale e degenerazione assonale nel sistema visivo ^19. Oltre a istologica e analisi al microscopio elettronico, MEMRI della proiezione retino-tectal è in grado di identificare alterazioni fenotipiche in questi topi. Con l'acquisizione di T seriale ₁ immagini RM ponderata dei seguenti ivit Mn ^{2 +} applicazione, abbiamo distinto un complessivo ridotto da un Mn ^{2 +} trasporto semplicemente in ritardo lungo il percorso visivo in questi p50Topi KO. In tal modo, l'acquisizione dei dati ripetitivi da MEMRI dopo una singola Mn ^{2 +} applicazione consente la definizione della cinetica di trasporto assonale e alterazioni neurofisiologiche nel prezioso pool di disposizione topi geneticamente modificati. Attualmente, diverse modifiche di MEMRI sono sotto indagine mira a rendere questa tecnica sicura per applicazioni diagnostiche nell'uomo. Un approccio promettente di grande rilevanza clinica, che costituisce un'alternativa alla ivit iniezione, è la consegna di Mn ^{2 +} come collirio. In tal modo, la somministrazione topica di 1 M MnCl ₂ ha prodotto un significativo miglioramento del segnale del 20% nel SC quando le immagini sono state acquisite su un animale T scanner ³¹ 4.7. Il metodo è in grado di rilevare una vasta ON degenerazione seguente ischemia retinica ^31, e la concentrazione applicata dimostrato sicuro quando applicato ripetutamente in intervalli mensili ^32. Data la relativamente elevata neurotossicità di Mn ^{2 +} ad esempio, per la diagnosi di sclerosi multipla e altre neuropatie.

In sintesi, il nostro studio dimostra che MEMRI è un approccio sperimentale potente per studiare circuiterie retino-tectal nei topi, estendendo così compiti optometria per valutare la funzionalità del sistema visivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908