Summary
RNA-polymeras II syntetiserar en prekursor RNA, som sträcker sig förbi 3'-änden av det mogna mRNA. Änden av den mogna RNA genereras cotranscriptionally, vid ett ställe som dikteras av RNA-sekvenser, via endonukleasaktiviteten av klyvningskomplex. Här har vi detaljerat förfarandet för att studera klyvningsreaktioner in vitro.
Abstract
Den 3 '-änden av däggdjurs-mRNA bildas inte genom abrupt avbrytande av transkription genom RNA-polymeras II (RNPII). Istället RNPII syntetiserar gångaren mRNA längre än till slutet av mogna RNA, och en aktiv process av endonukleasaktivitet krävs vid en viss plats. Klyvning av prekursor-RNA sker normalt 10-30 nt nedströms från konsensus polyA webbplats (AAUAAA) efter CA dinukleotiderna. Proteiner från klyvningskomplex, en multifaktoriell proteinkomplex av ungefär 800 kDa, utföra denna specifika nukleasaktivitet. Specifika RNA-sekvenser uppströms och nedströms om polyA-stället styra rekrytering av klyvningskomplex. Omedelbart efter klyvning, är pre-mRNA polyadenyleras av polyA polymeras (PAP) för att producera mogna stabila RNA-meddelanden.
Bearbetning av 3'-änden av en RNA-transkript kan studeras med användning av cellkärnextrakt med specifika radiomärkta RNA-substrat. Sammanfattningsvis, en lång 32 </ Sup> P-märkt ej kluven prekursor RNA inkuberas med nukleära extrakt in vitro, och klyvning bedöms genom gelelektrofores och autoradiografi. När korrekt klyvning sker, en kortare 5 'kluvna produkt upptäcks och kvantifieras. Här beskriver vi klyvningsanalys i detalj med hjälp av, som ett exempel, 3'-änden behandling av HIV-1-mRNA.
Introduction
Biosyntesen av de flesta mogna eukaryota meddelande RNA (mRNA) kräver flera post-transkriptionella modifieringar såsom tak, splitsning och polyadenylering. Dessa modifieringar är i allmänhet kopplad för att säkerställa korrekt bearbetning 1 och starkt öka stabiliteten hos mRNA.
Den 3 '-änden bildande av däggdjurs pre-mRNA-molekyler genereras genom endonukleolytisk klyvning av begynnande RNA följt av tillsats av adenylat rester till 5'spaltas genom poly (A) polymeras (PAP) 2-4. Hos däggdjur är klyvning uppnås genom en flerproteinkomplex, på cirka 800 kDa, som monterar på specifika pre-RNA-sekvenser. Poly (A)-signalsekvens, en mycket konserverad kanoniska hexanukleotid sekvens AAUAAA, riktar klyvningsstället vid ungefär 10 till 30 nt nedströms. Denna webbplats är uttryckligen erkänts av klyvning och polyadenylering specificitet faktor (CPSF) och 73 kD subenheten avCSPF innehåller endonukleasaktiviteten. Klyvningen stimulering faktor (CstF) binder en mer degenererad GU-eller U-rika elementet sekvens nedströms om poly (A)-ställe. Dessutom behövs för klyvning är däggdjurs klyvning faktor I (CFIm) och däggdjurs klyvning faktor II (CFII). CFIm binder de specifika UGUA (N) platser i uppströmssekvenselement (användningar) som har definierats för ett antal gener och verkar vara involverade i viktiga fysiologiska processer 5-8.
In vitro, är RNA-bearbetningsreaktioner vanligen analyseras genom användning av radiomärkta RNA-substrat 9-12. Dessa kan syntetiseras genom avrinning transkription från bakteriofag promotor T7 eller SP6. När man studerar ett polyadenyleringsställe som inte har karakteriserats tidigare, är det nödvändigt att använda genomiskt DNA i stället för cDNA för att generera RNA-substrat, såsom viktiga nedströms sekvenser som inte kan förekomma i cDNA. Design substrat för att omfatta minst 150 nt upstream och 50 nt nedströms från klyvningsstället / slutet på den mogna mRNA. Klyvningsprodukten migrerar snabbare än substratet; men eftersom andra fragment kan genereras genom icke-specifik nukleas åtgärd, har specificitet reaktionen som kontrolleras av dess beroende av rätt behandling signalsekvenserna. Därför RNA-substrat med en punktmutation i AAUAAA-sekvens (t.ex. AAGAAA) tjänar som en negativ kontroll för klyvningsreaktionen.
Med tanke på att en liten mängd av radioaktivt märkt RNA som används för klyvningsreaktioner kan RNaser som förekommer rikligt i de flesta nukleära extrakt vara problematiskt, och begränsa valet av utgångsmaterial för extraktpreparat. HeLa-celler som tenderar att innehålla låga nivåer av endogena RNaser och sålunda fungera väl i dessa analyser.
Den endonukleolytisk klyvning av RNA-substrat in vivo och in vitro omedelbart följs av poly (A)-addition, torser det kluvna intermediär inte är närvarande i detekterbara mängder. Därför, för att studera antingen en specifik RNA-sekvens eller proteiner involverade i en klyvningsreaktion, är experiment utförs under förhållanden som förhindrar polyadenylation uppstår. Det finns inget beroende av klyvning på polyadenylering, eller vice versa, så att en kan stoppa polyadenylering utan att skada klyvningsreaktionen. Således är ATP ersattes med en kedjeterminerande analog som saknar 3'-hydroxylgruppen så att endast en enda nukleotid kan inkorporeras vid den poly (A)-ställe och bara spjälkas RNA kan detekteras.
Med tanke på komplexiteten och hög grad av speciella med denna typ av analys, beskriver vi en detaljerad video-protokoll för att studera endonukleolytisk klyvning av klyvning / Poly (A) maskiner av mRNA-prekursorer in vitro. Vi beskriver hur man förbereder kompetenta kärnextrakt, genererar radiomärkta RNA-substrat, utföra klyvningsreaktionen, och analysera och tolka resultateting produkter. Figur 1 visar ett exempel på substrat-RNA som kodar för 3'-änden av HIV-1 pre-mRNA: n som skall användas för ett klyvningsanalys. Den 3 '-änden av HIV-RNA-genomet är sammansatt av många viktiga reglerande sekvenser, såsom poly (A)-ställe, ett G+ U rik region, och användningen elementet, som alla är nödvändiga för effektiv mognad av de virala mRNA-transkript 13 . I det här exemplet skulle vi förvänta oss den ingående RNA-substrat att vara 338 nt och vid klyvning 237 nt. Om polyadenylering fick ske, skulle observeras ett utstryk av produkter mellan 237 och 437 nt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Anpassning av Vidhäftande Cells in Suspension
(Detta är ett valfritt steg. Suspensionsceller göra generellt bättre nukleära extrakt emellertid celler odlade i plattor kan också användas.)
- Adapt adherenta celler för tillväxt i suspension med användning Joklik modifierade MEM kompletterat med 5 till 10% serum från nyfödd kalv eller fetalt bovint serum och 1% L-glutamin: penicillin-streptomycin. Sprid-celler i spinnerflaskor med ett filterlock vid 37 ° C med 8% CO2.
- Vid anpassning av celler, börja med 100 ml i en 500 ml spinnerkolv. Upprätthålla ett minimum 0,3 x 10 6 celler / ml och ersätta mediet var 1-2 dagar tills den rätta tillväxttakten uppnås (normalt 2-6 veckor). Väl anpassad bör HeLa-celler i suspension fördubblas ungefär var 24 timme OBS:. Under adaptionsfasen, kommer det att ta lite tid för cellerna att återgå till sin normala fördubbling takt.
- Bibehålla cellerna vid en hålasitet av 0,5 till 0,8 x 10 6 celler / ml i den önskade slutliga volymen (vanligtvis 1-10 V)
- Celler skördas typiskt vid mitten av log-fasen (cirka 0,5 till 0,65 x 10 6 celler / ml och> 90% viabla). Använd lämplig storlek spinnerflaska för den önskade mängden av odlingsmediet.
2. Nukleära extrakt
- Buffert och Reagensberedning
OBS: Extraktioner utförs efter en modifierad Dignam et al (1983) 14 kärnextrakt förfarandet..- Bered 1X fosfatbuffrad saltlösning, buffert A, buffert C, och buffert D (tabell 1) dagen innan du fortsätter med extraktioner och förvara vid 4 ° C.
OBS: Högre avkastning vanligen uppnås med nygjord buffert; emellertid är bufferten stabil under flera veckor. Det är viktigt att alla buffertar, apparater och utrustning är förkyld och förvaras kallt för helheten av de extraktioner.Använd en kall plats för så många steg möjligt och / eller hålla allt på is. Lägg DTT och PMSF omedelbart före användning.
- Bered 1X fosfatbuffrad saltlösning, buffert A, buffert C, och buffert D (tabell 1) dagen innan du fortsätter med extraktioner och förvara vid 4 ° C.
- Insamling och tvätta celler
- Häll cellerna till fyra 250 ml koniska flaskor och spinn vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C i en centrifug med en svängande eller en fixerad vinkelrotor. Dekantera supernatanterna och lägga till ytterligare 250 ml cellodlingsmedium till varje flaska. Upprepa snurrar tills alla celler har pellete.
- Resuspendera kombinerad slut pellets i totalt 250 ml iskall PBS och pool i en 250 ml konisk flaska. Centrifugera cellerna vid 400 x g under 10 min vid 4 ° C i en svängande hink centrifug.
- Häll av supernatanten och suspendera cellpelleten i iskall PBS så den totala volymen inte överstiger 50 ml. Lossa pelleten genom pipettering och överföring till ett 50 ml koniskt centrifugrör.
- Centrifugera cellerna igen vid 500 x g under 6 min vid 4 ° C i en svängande hink centrifug. Häll av supernatant och uppskattning och notera cellpelleten volym (CPV) så exakt som möjligt. Använd vatten i en separat matchande rör, som jämförelse, om pellets är lägre än volymmarkeringar på röret.
- Cellys
- Lägg DTT till buffert A. Återsuspendera pelleten i buffert A med användning av 5 volymer av det uppskattade CPV. Pipett för att bryta upp pelleten och inkubera på is under 10 min.
- Centrifugera cellerna vid 931 x g under 10 min vid 4 ° C i en svängande hink centrifug.
- Försiktigt aspirera supernatanten istället för dekantering. Pelletsvolymen bör ha ökat ungefär två gånger i storlek på grund av svullnad i cellerna.
- Lägg ett CPV av buffert A till cellerna. Bryta försiktigt upp pelleten och avlägsna en liten portion (ca 50 l) till ett mikrofugrör på is. Överför resuspenderade celler till en lämplig storlek Dounce homogenisator (vanligtvis 15 ml storlek) kyld på is.
- Lysera cellerna med 12-15 långsamma men stadiga slag av en typ B (tigHT)-mortelstöt. Ta en liten delmängd av lysat och undersöka i mikroskop för fullständig lys (intakta små mörka kärnor jämfört med svullna celler) genom trypanblå färgning. Intakta celler kommer att vara klar). Fortsätt homogenisering till 90% lys uppnås och stanna här, över douncing kan negativt påverka kvaliteten på kärnextrakt.
- Överför lysat i Ultraclear ultracentrifugrör och notera den totala volymen. Balansera genom vägning av rör och snurra vid 1069 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
OBS: Den ultracentrifug användes i detta steg, trots det låga centrifugeringshastighet på grund av att samma rör kan spinnas vid högre hastighet i nästa steg. Denna dragning kommer att ge en ganska tät pellet som täcker botten av röret med grumligare supernatant ovan, som kan samlas in och användas för cytosoliska S100 extrakt. Om det finns en synlig lipidskikt på toppen av röret, kan den avlägsnas. - Ta försiktigt bort supernatanten med en pipett och överför den till anoth.. er röret Undvik att störa kärnpellets OBS: Det är viktigt att känna till den slutliga volymen av supernatant för att bestämma packad kärn volym (PNV).
- Beredning av Nuclear Extract
- När supernatanten noggrant har avlägsnats, respin rå nuclear extract pellet vid 25.453 xg under 15 minuter vid 4 ° C i samma rör.
- Avlägsna återstående supernatanten (det ska vara en liten mängd klar vätska) och lägg till den tidigare överstående samlingen. Mät den slutliga volymen av supernatanten. Beräkna PNV genom att subtrahera denna volym från den totala volymen av det ursprungliga lysatet tidigare noterats. Alternativt, om pelleten är tillräckligt stor, dess volym kan uppskattas genom jämförelse med liknande volym vatten på ett identiskt rör.
- Lägg 1 PNV volym buffert C (ca 1 ml / ml av celler). Försiktigt loss pelleten med en pipett och överför till en lämpligt siZed Dounce homogenisator. Om du använder samma sator som tidigare, försköljning homogeniseringsanordningen med sterilt avjoniserat vatten.
- Suspendera pelleten med ~ 5-10 slag via en Dounce homogenisator med hjälp av en stram mortelstöt.
- Överför den homogeniserade nukleära lysat i ett kylt rör och blanda genom inversion under 30 minuter vid 4 ° C. Om volymen är tillräckligt stor, agitera användning av en magnetisk omrörningsplatta och spinn bar.
- Överför lysatet till en ny Ultraclear centrifugrör och centrifugera vid 25.453 xg under 30 minuter vid 4 ° C. Den pellets ska vara kompakt. Ca 5 minuter innan spin är klar, återfukta dialyskassetter eller slangar som har en lämplig molekylvikt avskurna (MWCO) (t.ex. 7000 kDa).
- Avlägsna supernatanten (kärnextrakt) från röret i ett kylt koniska rör med hjälp av en pipett fortsätt sedan med dialys.
- Dialys
- Injicera extrakten i hydratiserade dialyskassetter enligt tillverkarenss instruktioner och dialysera de nukleära extrakt i 500 ml av buffert D 50 för en timme vid 4 ° C under omrörning.
- Byt bufferten med 500 ml färsk, iskall buffert D 50 och dialysera under ytterligare 4 h vid 4 ° C. Detta 4 tim steg kan delas upp i två 2 tim förändringar istället.
- Ta ut utdrag från dialyskassetten och överföra till kylda rör. Snurra extrakt för 5 min vid 1500 xg vid 4 ° C.
- Alikvotera av extrakten i kylda, Eppendorf-rör och snap frysa i flytande kväve (50-100 l per portion). Lagra vid -80 ° C för framtida användning.
3. RNA Probe Synthesis
- Mall Framställning
NOTERA: Mallar som används för transkription kan vara PCR-fragment eller plasmider som innehåller en T7-eller SP6-promotorn uppströms och i omedelbar anslutning till den önskade sondsekvensen. Plasmid mallar måste linjäriseras nedströms om mallsekvensen för interest. Vi noterade högre avkastning från PCR-mallar.- Den T7/SP6 promotor kan införas under PCR-reaktionen. Utforma sensprimer med T7/SP6 promotor uppströms om målsekvensen.
- Förstärk den önskade sekvensen i 2-3 reaktioner per mall via PCR per tillverkarens anvisningar med hjälp av en hifi-polymeras.
- Kombinera likvärdiga reaktioner och rena genom gel-extraktion.
- Sekvens PCR-produkterna för att kontrollera mall noggrannhet. (Tillval)
- RNA-transkription med 32 P Labeling
- Utför in vitro transkription från 1 mikrogram av mall med ett kommersiellt tillgängligt kit som är kompatibel med promotorn (SP6 eller T7) med följande modifieringar. Använd ett pl av färsk 3000 Ci / mmol [α-32p] UTP, 0,5 pl av 10 mM kall UTP, 0,1 | il av 10 mM GTP och 0,9 | il av 10 mM m7G (5 ') ppp (5') G-RNA lock i en total slutlig volym av 20 | il.
OBS: Den G-cap förbättrar stabiliteten av RNA-transkript i kärnextrakt (cap: GTP) 10:1. Den kalla UTP tillsätts för att förhindra att 32 P-UTP från att vara det begränsande reagenset. - Syntetisera en RNA-storleksstege såsom betecknas ovan utan G cap. Kommersiella finns tillgängliga för att generera RNA storleksmarkör.
- Inkubera transkriptionsreaktioner vid 37 ° C under en timme (för SP6 användning 40 ° C). När de är färdiga, utföra DNas matsmältningen av mallen i 15 min vid 37 ° C.
- Efter digerering, tillsätt 1 pl av 0,5 M EDTA och 5 pl laddningsbuffert II till RNA-substrat. Tillsätt 20 ^ il laddningsbuffert II till markör.
- Värm RNA-markör och sonder vid 95 ° C i 3 min sedan placera på is.
- Utför in vitro transkription från 1 mikrogram av mall med ett kommersiellt tillgängligt kit som är kompatibel med promotorn (SP6 eller T7) med följande modifieringar. Använd ett pl av färsk 3000 Ci / mmol [α-32p] UTP, 0,5 pl av 10 mM kall UTP, 0,1 | il av 10 mM GTP och 0,9 | il av 10 mM m7G (5 ') ppp (5') G-RNA lock i en total slutlig volym av 20 | il.
- Polyacrylamide Gel Casting / Probe Elektrofores
- Förbered ett L av 6% polyakrylamidgel (PAGE) blandning och 400 ml av 10% PAGE. För att göra 6%, blanda 150 ml 40% 19:01 akrylamid: bis-acrylamide med 100 ml 10X Tris / Borat / EDTA (TBE) och 460 g urea. Ta upp till 800 ml med sterilt avjoniserat vatten och rör om på en värmeplatta under applicering av svag värme (ca 50 till 80 ° C). Komplettera till 1 L med avjoniserat vatten.
OBS: Reaktionen är endoterm. Värme främjar solubilisering av urea. Ta bort från värmen så snart urean löses och bringa lösningen till 1 L med avjoniserat vatten. Alternativt rör om vid rumstemperatur över natten; för mycket värme kan initiera polymerisation. - Skydda PAGE mixen från ljus med aluminiumfolie och förvara i rumstemperatur. SIDAN mixar kan förberedas i förväg och är stabila under flera månader.
- Bered 400 ml av 10% PAGE blandning genom att kombinera 100 ml av 40% 19:01 akrylamid: bis-akrylamid, 40 ml 10x TBE och 184 g karbamid. Efter urea löses, fyll på till 400 ml med avjoniserat vatten.
Alternativt, förbereda en 20% 19:1 akrylamid lösning och en 0% akrylamidlösning with buffert och urea endast; Dessa kan sedan blandas i alla proportioner för att ge någon procentsats mellan 0 och 20%; urea är alltid långsamt lösa upp. - Förbered 10-50 ml av 10% ammoniumpersulfat (APS) lösning i sterilt avjoniserat vatten, beroende på antalet av geler som skall gjutas.
- Tvätta 20 cm x 22 cm glas gelplattor med 70% etanol (EtOH). Torka med stora luddfria våtservetter.
- Tvätta den vanliga plattan med 1 ml av 5 N natriumhydroxid (NaOH) och därefter rewash med 70% EtOH. Coat den skårade plattan med gel avvärja silikonisering lösning genom att torka av plattan med en mättad liten Kimwipe.
- Montera plattorna genom att placera den vanliga plattan på en tom pipettspetsen låda eller en bit frigolit för att lyfta den från bordet med den rengjorda sidan uppåt. Lay 0.4 mm distanser på kanten av vardera långsidan.
- Placera försiktigt den skårade plattan över distanserna så att den belagda sidan kommer att vara på insidan av gelen. Använd ett rakblad eller annat tunt instrument för att skiftadistansstyckena för en flush uppriktning vid botten och sidorna av gelplattorna säkra sedan med bindemedels klämmor på varje sida av gelplattorna över distansorganen.
- Bered 30 ml av 8% PAGE blandning per gel genom att blanda 15 ml av 10% och 6% blandar var och en i ett 50 ml rör. Snabbt lägga till 300 | il av 10% APS följt av 30 | il av N, N, N ', N'-tetra-metyletylendiamin (TEMED) till gelén mix 8%.
OBS: Lämpliga gel procentsatser för enskilda probstorlekar bör väljas av försöksledaren. - Cap och vänd 2x och häll lösningen i den skårade området gelplattorna. Se till att något höja plattorna för hand och hålla en jämn häll tills SIDA mixen börjar droppa ut från botten.
- Sänk plattorna tillbaka till nivå och omedelbart sätta in den stora 8-väl rektangel kam för 0,4 mm x 20 cm gel. Små bubblor nära botten kommer inte att påverka driften, men det bör finnas några bubblor i brunnarna.
OBS: </ Strong> Placera pappershanddukar på bordet under botten och toppen av gelen för att fånga spill under gjutning. - Låt PAGE mix polymerisera under åtminstone 30 min.
- Överför den polymeriserade gelén till kylrummet och montera elektroforesapparaten. Lägg kall TBE-buffert till maxstrecken på de övre och nedre kammaren.
- Ta kammen och använder en rakhyvel för att ta bort eventuellt skräp. Ställ gelén i apparaten och använda ett bindemedel klämma för att hålla plattan i tätningen. Lägg kallt TBE till den övre kammaren tills den rinner ut plattorna.
- Tvätta brunnarna med en 30 ml syringe/21 G 1-1/2 "nål fylld med kallt TBE strax före lastning de märkta RNA-substrat. Placera en aluminiumplåt på baksidan av glaset för att hjälpa till med distribution av värme medan du kör.
- Belastning 3 pl av markören och hela 25 pl transkriptionsreaktion för varje RNA-substrat i separata brunnar. Lämna en väl mellan lika stora utskrifter till pRevents korskontamination. Bromfenolblått och xylencyanol färgämnen i laddningsbufferten kan användas för att uppskatta storleken migration på gelén.
- Kör gelen vid en konstant effekt är lämplig för storleken på RNA-prober (t.ex. 25 watt i 2 h för sonderna enligt 600 nt).
- Förbered ett L av 6% polyakrylamidgel (PAGE) blandning och 400 ml av 10% PAGE. För att göra 6%, blanda 150 ml 40% 19:01 akrylamid: bis-acrylamide med 100 ml 10X Tris / Borat / EDTA (TBE) och 460 g urea. Ta upp till 800 ml med sterilt avjoniserat vatten och rör om på en värmeplatta under applicering av svag värme (ca 50 till 80 ° C). Komplettera till 1 L med avjoniserat vatten.
- Märkt RNA-extraktion och rening
- Efter elektrofores, försiktigt tömma den övre kammaren av gelen apparaten. Den största delen av radioaktiviteten kommer att vara i gelén och den nedre kammaren; emellertid kan den övre buffert innehålla några radioaktivt material.
- Använd en bricka för att transportera gelen om att flytta till ett annat radioaktivt material arbetsområde. Ta försiktigt bort distanserna genom att dra den utskjutande stycke i sidled bort från gelén.
- Försiktigt separera plattorna. Gelen bör hålla sig till plattan som inte silikon. Lägg en bit plastfolie över gel och glasplatta.
- Placera en glogos autorad markör klistermärke på plastfolie över en ären av gel som är fri från varje prov.
- I ett mörkt rum, placera en bit av autoradiografifilm över hela plattan och exponera under minst 1 min. Framkalla filmen.
- Placera den framkallade filmen på en ljus yta. Placera sedan plast sidan av gelen nedåt på filmen och justera autorad markör från gelen till den exponerade markören på filmen. När linje, använd en svart markering för att markera platsen för de önskade banden på glaset.
OBS: Du kan också rikta geler / film på följande sätt för att klippa ut RNA-band. I det mörka rummet, placera inslagna gelén på ett bord, placera filmen ovanpå den och placera en kassett (eller bok, etc.) på toppen av den bit av filmen. Flick på strömbrytaren i rummet en kort stund och slå sedan om off. Detta kommer att "förblixt" filmen generera en kontur av alla brunnar på filmen på grund av trycket / skydd från ljus att kassetten på toppen ger. Detta gör det enkelt att anpassa filmen på gelén och skarsut bandet utan att använda fluorescerande markörer. - Ta försiktigt bort plastfolie och använda en ny skalpell eller rakhyvel för varje RNA-substrat och skära banden från gelen och placera i separata 1,7 ml mikrofugrör. Använd en nutator för milda agitationer under eluering.
- Tillsätt 500 | il av RNA-elueringsbuffert (0,5 M ammoniumacetat, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,2% SDS) till varje rör. Centrifugera kort att dränka gelen fragmentet. Inkubera vid rumstemperatur i mörker under 3-16 h beroende på sondens storlek.
- Överföra hela 500 ul av eluerat material in i ett nytt rör. Undvik att överföra eventuella gelpartierna eftersom de kommer att interferera med rening. Lägg ett pl av glykogen (20 mg / ml) tillsammans med 500 | il av kall, sur fenol-kloroform (för RNA).
- Kortfattat virvel bör lösningen verkar grumlig. Spin i rumstemperatur i full fart (~ 16.000 xg) i 5-6 min.
- Noggrant tränsfer toppen (vattenhaltig) skikt till nya rör samla så mycket som möjligt samtidigt som man undviker eventuellt skräp från interfasen. Tillsätt en lika mängd kloroform till den överförda vattenskiktet. Upprepa steg 3.4.10 och överföra den övre (vattenhaltiga) skiktet till ett nytt rör. Tillsätt 1 ml iskall 95-100% EtOH till det insamlade materialet. Inkubera vid -80 ° C under 10 min. OBSERVERA: RNA kan förvaras över natten, om så önskas.
- Pelle RNA under 30 min vid 16000 xg vid 4 ° C. Häll försiktigt av supernatanten i ett radioaktivt avfallsbehållare och tillsätt 1 ml iskall 70% av molekylärbiologisk kvalitet EtOH till varje pellet.
- Pellets RNA vid 16.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C, häll bort supernatanten, snurra igen i 1 min och ta bort eventuella EtOH via pipett och låt stå i rumstemperatur med locken öppna för att tillåta förångning av resterande EtOH.
- Resuspendera pellets i 20 till 30 pl RNase-fritt vatten. Märkt RNA kan förvaras vid -80 ° C.
OBS: En radioaktiv undersökning mätare bör användas under hela extraktionsmetod för att kontrollera att de märkta RNA inte har gått förlorad under alla steg.
- Kvantifiering av märkt RNA för en pre-mRNA-3 '-mRNA Cleavage Reaction
- Ungefärlig molariteten av klyvnings substrat med användning av följande förfarande.
- Ta till exempel en fil av 3000 Ci / mmol [α-32 P]-UTP och 10 mCi / ml. (På etiketten referensdatum, kommer den kemiska koncentrationen av denna stamlösning vara 3,3 iM UTP. Före detta datum den är högre och en halveringstid (~ 13 dagar) efter den dag det är ~ 1,6 mM, etc.) Den märkta UTP bidrag till den slutliga reaktionskoncentrationen normalt försumbar när en slutlig kall UTP koncentration över UTP-K ^ används. T7 RNAP K m för UTP är 114 mM 15.
- Späd 1 il i 39 | il vatten. Tillsätt sedan 1 l av utspädd [α-
- Späd 1 | il av varje märkt RNA-substrat i separata vialer med en lika stor mängd scintillationsvätska användes i det föregående steget. Se till att ha en flaska med bara scintillationsvätska att beräkna bakgrund. Kvantifiera radioaktivitet i en scintillationsräknare.
- Multiplicera pulser per minut (cpm) för [α-32p] UTP prov med 40 faktor i den initiala utspädningen och subtrahera bakgrunden erhålls genom enbart den scintillationsvätska. Multiplicera räknas för var och en RNA-prob med beloppet av RNas-fritt vatten (20 till 30 | il) användes för att resuspendera RNA prober. Detta ger den totala cpm av det renade RNA.
Exempel:. Max cpm = (cpm [α-32p] UTP - bakgrund) x 40 märkt RNA Prov 1 = 20.000 cpm x 20 = 400 tusen kopior per minut (om 20 fil som används för återsuspension) - Om en annan än 1 l av [α-32p] UTP belopp användes för att göra avskrifter, sedan arbeta in denna volym i den slutliga cpm [α-32p] UTP genom att multiplicera cpm för [α-32p] UTP prov av den mängd som används.
Exempel: 2 | il av [α-32p] UTP används för att göra de transkript. Den beräknade cpm för 1 | il [α-32 P] UTP är 500000 cpm. Multiplicera 500.000 * 2 = 1.000.000 cpm - Dividera den beräknade märkt RNA cpm med beräknat cpm för [α-32 P] UTP ensam. Detta kommer att grovt uppskatta andelen märkt UTP införlivas.
Exempel: 400.000 / 1.000.000 = 0,40 eller 40%införlivas - Sedan ett enzym inte kan skilja mellan isotoperna är samma procentandel av märkt och omärkt UTP införlivas med RNA under transkription. Beräkna mängden kall UTP i mol som sättes till transkriptionsreaktion (0,5 | il av en 10 mM lösning = 5,0 x 10 -9 mol av UTP).
- Multiplicera mol UTP i reaktionen med den införlivade procent (känd från den heta UTP räknar ovan), sedan dividera det med antalet uridines i RNA-sekvensen.
Exempel: 5,0 x 10 -9 mol UTP x 0,40 = 2 x 10 -9 mol UTP
2 x 10 -9 mol UTP / 73 U per utskrift = 2,7 x 10 -11 mol RNA - Konvertera moler RNA till molaritet genom att dividera volymen av det utvunna RNA resuspension lösning.
Exempel: 2,7 x 10 -11 mol RNA / 20 ^ = 1,370 nM-RNA. För T7-RNAP-transkript som gjorts från ca 1 | ig linjärized plasmid och återsuspenderades i 20 | il vatten, värden på 200 till 1400 nM är typiska.
OBSERVERA: Den molära koncentrationen av RNA användes för att säkerställa att den slutliga pre-mRNA substratkoncentration i in vitro-klyvningsreaktion är mindre än 5 nM per klyvningsreaktionen. Cleavage effektivitet kan minska om RNA-koncentrationen höjs betydligt över 5 nM.
- Ungefärlig molariteten av klyvnings substrat med användning av följande förfarande.
4. 3 'mRNA Cleavage Reaction
- Klyvningsreaktionen Reagensberedning
- Förbered alla reagenser som behövs för klyvningsreaktionen. Gör 10% polyvinylalkohol (PVA) med kokande vatten och tillsätt långsamt den korrekta mängden av PVA-pulver. 10% PVA blir trögflytande och tar tid att lösa upp. Förvara vid rumstemperatur eller -20 ° C.
- Bered 1 M kreatinfosfat (CP) och förvara vid -80 ° C. Det är viktigt att använda en M CP som är mindre än 4 månader gammal.
- Bered en M DTT och lagravid -20 ° C. Gör en färsk 0,2 M DTT utspädning från 1 M DTT omedelbart före göra klyvningsreaktionen.
- Förbered ETS (klyvning stopplösning): 10 mM Tris pH 7,8, 10 mM EDTA, 0,5% SDS. Förvara i rumstemperatur.
- Cleavage Reaction
- Värm det märkta RNA till 80 ° C under 2 min och placera sedan på is.
- Vortexa försiktigt och sedan snurra 10% PVA i full fart i 2-3 minuter för att avlägsna bubblor.
- Mästaren mix 1: För en enda reaktion, kombinera 3,125 l 10% PVA, 0,625 l 1 M CP, 0,25 l 0,5 M tRNA, 0,125 l 100 mM dATP, 0,13 pl 40 U / l RNas hämmare, 0,25 l 0,1 M EDTA pH 8 , 0,1 | il 0,2 M DTT och 0,645 | il RNas-fritt vatten. Fördela 5,25 l Master Mix 1 per rör på is.
- Master Mix 2: Använd 6,25 l / reaktion av kärnextrakt vid koncentrationer högre än 2 mg / ml. Kärnextrakt kan spädas med buffert D 50 om needed.
- Kombinera 6.25 l av nukleära extrakt med det tidigare dispens 5.25 l av Master Mix 1. Tillsätt 1 l av märkt RNA-substrat som späds till 50 nM. Alternativt kan RNA ingå i mastermixen 1 förutsatt att det läggs till efter den RNas-hämmare, DTT och tRNA. OBS: Använd <5 nM av de märkta RNA-substrat.
- Vortexa försiktigt och snabb spinn varje prov för att ta bort bubblor. Inkubera vid 30 ° C i upp till 2 timmar, men ett tidsförlopp bör utföras för optimala resultat. Längre inkubationer kan öka bakgrunds nedbrytning.
- Proteinas K Digestion och rening
- Ta prover från värmen och till 182.5 l av ETS stopplösning till varje reaktion. Tillsätt 5 | il av 20 mg / ml proteinas K och inkubera proverna vid 37 ° C under 10 min.
- Extrahera RNA genom tillsats av en volym (200 | al) av syra-fenol-kloroform, 1/10 volym (20 | il) av 3 M natrium-acetat och 1 l av 20 mg / ml glykogen. Fortsätt med extraktioner som beskrivs i avsnitten 3.4.9-3.4.14.
- När RNA-extraktion är klar, se till att ta bort alla kvarvarande EtOH. Återsuspendera pelleten i 8 ^ il laddningsbuffert (90% formamid, 10 mM EDTA, med bromfenolblått (BFB) (med eller xylencyanol blått)). Proverna kan förvaras vid -80 ° C eller fortsätta med gelelektrofores.
- Cleavage Reaction Elektrofores
- Förbered en akrylamidgel 6% som tidigare nämnts i avsnitten 3.3.1-3.3.17 med några modifikationer. Använd 20 cm x 42 cm sekvense gelplattor med 2 bindemedel klipp på varje långsida. Använd en 32-brunnars kam och framställa 40 ml av gelén blanda.
- Fyll på gelén med 3 | il av markör och 5 | il av varje prov. Optimera elektrofores inställningarna enligt pre-klyvnings och klyvs produktstorlekar.
- När elektrofores är klar, följ avsnitten 3.4.1-3.4.3 </ Strong> för att ta isär gelen. I stället för plastfolie, skära en bit filterpapper med storleken på gelplattan och försiktigt placera den på en sida av den exponerade gelén.
- Tryck på filterpapper ordentligt på gelen, sedan vända över plattan så att filterpapper är på botten och glaset är på topp. Tryck fast glas på bordet för att säkerställa att gelén grip filtrerpapperet jämnt.
- Dra långsamt filterpapper, vilket borde ha gelen fäst vid den, från en av kortsidorna tills alla filterpapper med gel fastsatt tas bort från glasplattan.
- Täck den exponerade gel sida med plastfolie. Tape plastfolie till filterpapper.
- Placera gelén på en gel-tork med filtersidan är vänd mot vakuumsidan. Torr under 15 minuter eller tills gelén är helt torr.
OBS: Om en gel torktumlare inte är tillgänglig, kan röntgenfilm användas för att visualisera de RNA-banden. Exponering bör utföras i en belyst-tight kassett med intensifiering skärm vid -80 ° C. Exponeringstid bestäms empiriskt. Varning: geler låg procent akrylamid kan spricka vid frysning. - Gelén kan nu användas för att exponera filmen eller användas tillsammans med en fosfo-imager. Exponeringstiden beror på styrkan hos det märkta RNA. Inledningsvis en 24 tim exponering kan användas. Vid användning av film, exponeras vid -80 ° C med en intensifiering skärmen och låt värmas till rumstemperatur innan den utvecklas.
- Mät förhållandet mellan kluvna och un-klyvd RNA i varje prov för att kvantifiera klyvning effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat av en klyvningsanalys av RNA-poly (A) områden av HIV-1 (figur 2). Vi kan observera det okluvna RNA-substrat, som är långsammast vandrande band på toppen av gelén. Den specifika avskiljda produkten är den mest intensiva kortare fragmentet band som går snabbare i gelén vid den förväntade storleken, och är specifikt frånvarande från klyvning analysen enligt mutpoly (A) kontroll som innehåller en punktmutation i polyA-sekvens (mutPolyA)-RNA substrat. Nedbrytningsprodukter av inmatnings Underlaget kan ibland observeras. Kvantifiering av klyvningsaktivitet kan bestämmas genom densitometrisk kurva över förhållandet mellan ospaltade att spjälkas RNA normaliserades till 100% av ej kluven RNA.
Figur 1. Schematisk återgivning av HIV-pre-mRNA 3 'end bearbetning substrat, och förväntade produkter av in vitro-klyvning och polyadenylerings reaktioner. klyvningsstället, det dinukleotid-CA-, ligger 25 nt nedströms från polyA webbplatsen AAUAAA. LTR-regioner: U3 (unik 3-sekvens), R (upprepad sekvens), och U5 (unik 5-sekvens).
Figur 2. (A) Poly (A)-ställe klyvning. 32 P-märkta RNA innehållande poly (A) av HIV-1 och en punkt mutation av poly (A)-signal som upphäver klyvning (mutPolyA) inkuberades i nukleära extrakt av HeLa-S3-celler eller BSA som negativ kontroll. Fetstil pil indikerar 5 'kluvna produkten. Den 3-fragmentet rinner ofta ut gelen eller är förstörd och inte alltid synliga. (B) Densitometrisk tomt på klyvnings aktivitetertet, uttryckt som ett förhållande av ej kluven att spjälkas RNA normaliserades till 100% av ej kluven RNA.
| Buffert A (100 ml) | 10 mM Tris (pH 7,9), 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM ditiotreitol (DTT). | Lägg DTT strax innan du använder buffert A vid utvinning. Lägg 1 ul av 1 M DTT per 1 ml av buffert A. |
| Buffert C (50 ml) | 20 mM Tris (pH 7,9), 25% (v / v) glycerol, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 0,5 mM DTT, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF). | Lägg en proteashämmare cocktail tablett på morgonen av extraktioner. |
| Buffert D 50 (2-4 liter) | 20 mM Tris (pH 7,9), 20% (volym / volym) glycerol, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 50 mM ammoniumsulfat. | HEPES-KOH kan användas istället för Tris i buffert A, C och D. |
| 0,5 M amonium-acetat, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,2% natriumdodecylsulfat (SDS) | Förvara i rumstemperatur. | |
| Stop Buffer (ETS) | 10 mM Tris (pH 8,0), 10 mM EDTA, 0,5% SDS | Förvara i rumstemperatur. |
| Klyvning laddningsbuffert | 90% formamid, 5 mM EDTA pH 8, 0,025% bromfenolblått | Förvara vid -20 ° C. |
Tabell 1. Sammansättning av buffertar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro-pre-mRNA 3 'klyvningsreaktion, genomförs i HeLa cellkärnextrakt eller med klyvningsfaktorer fraktione från dessa extrakt, har möjliggjort identifiering av kärnklyvnings faktorer och deras huvudkomplex 16-21. Många fler proteiner associerade med dessa faktorer har nyligen identifierats 22, och in vitro-reaktion kan fortsätta att belysa hur dessa proteiner bidrar till reaktionen. Kanske för att reaktionen in vivo förefaller vara cotranscriptional 23, eller att vissa bidragande faktorer kan gå förlorade vid utvinning och dialys, är effektiviteten ofta dålig, och sällan är mer än 30% klyvning uppnås. Dessutom kan reaktionseffektiviteten plötsligt sjunka från dag till dag utan någon uppenbar anledning. Därför är det viktigt att inse vilka åtgärder som är de mest kritiska, i synnerhet när man försöker anpassa reaktionen till modifierade eller viralt infekterade HeLa-cells, till andra celltyper eller till nya substrat.
Utan tvekan, kvaliteten av extraktet och färskhet in vitro transkriberade RNA är av största vikt, liksom behovet av att arbeta under noggrant betalt RNas-fria förhållanden. Hälsan hos cellerna vid den tidpunkt de skördas för utvinning är också viktigt. Cellerna bör visas friska, bör de fördubbling på mindre än 24 timmar, ska de vara i eller närmar sig mitten log fas, och det bör finnas några döda celler eller andra oförklarliga skräp. Självklart bör cellerna inte förorenas av mykoplasma eller andra bakterier. Underlaget bör inte göras med en för hög specifik aktivitet, eftersom detta kan leda till uppenbar försämring.
När en tillräckligt stor sekvens på endera sidan av klyvningsstället bedöms, och alternativa polyadenylerings redovisas, antalet olika poly (A) sekvenssignaler i det mänskliga genomet otvivelaktigt överstiger antalet gener 24 25. Kombinationen av en svag poly (A)-signalsekvensen med andra än standard HeLa-celler celler kan bevisa frustrerande, och det är bättre att först använda ett starkt substrat med nya celler, eller omodifierade HeLa-celler med en potentiellt svag polyA substrat.
Även efter så många år av framgångsrik användning, finns det fortfarande mindre hemligheter som är förknippade med in vitro-3 'klyvningsreaktionen. Till exempel, varför är kreatin fosfat behövs? Det har visats att den ursprungliga orsaken till bland annat det - att regenerera ATP poolen - är inte giltig 26. Intressant nog kan det utelämnas med endast partiell förlust av aktivitet, när nukleära extrakt äranvänds, men blir successivt mer nödvändigt eftersom extraktet fraktioneras i delvis renade klyvningsfaktorer som används för att rekonstruera reaktionen. Faktum fosfokolin, en annan liten molekyl med en fosfatgrupp och en positivt laddad amin, men sannolikt inte har någon in vivo roll i reaktionen, har har visat sig vara effektivare än kreatinfosfat, åtminstone i den rekonstituerade reaktion 27. PVA är en annan ingrediens, vars krav är inte helt förklaras. Det antas vara en trängsel agent, vilket leder till en faktisk ökning klyvningsfaktor koncentration, men andra trängs medel, som polyetylenglykol, inte fungerar så bra. Att förstå dessa faktorer kan leda till ökad effektivitet, vilket möjliggör en utvidgning av metoden för att mindre effektiva celltyper och RNA-substrat, och kan ge ledtrådar till hur de olika faktorerna fungerar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
SV är tacksam för finansiering stöd från NIH K22AI077353 och Landenberger Foundation. KR tacksam finansiering från NIH (5SC1GM083754).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Celstir flask | Wheaton | 356884 | Different sizes available |
| 4 position slow speed stirrer | VWR | 12621-076 | |
| Swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | Allegra x-15R with SX4500 Rotor | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor | |
| Table top centrifuge 5417R | Eppendorf | Refridgerated | |
| Thermomixer incubator | Eppendorf | ||
| 250 ml conical tubes | Corning | 430776 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Ultraclear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| JOKLIK modified MEM | Lonza | 04-719Q | |
| Fetal bovine serum | Atlas | F-0500-A | Heat inactivated |
| L-glut:pen:strep | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Potassium chloride | MP Biomedicals | 194844 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| DTT | Alexis Biomedicals | 280-001-G-010 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | |
| 5 M sodium chloride solution | Mediatech | 46-032-CV | |
| EDTA 0.5 M solution | Sigma-Aldrich | E7889-100ml | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ammonium sulfate | Fisher | A702-500 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit | Thermo Scientific | 66372 | MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml |
| 15 ml Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D9938-1SET | Different sizes available |
| Expand high fidelity PCR kit | Roche | 11 732 650 001 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | Y02256 | 10 mM each nucleotide |
| MaxiScript SP6/T7 kit | Ambion | AM1322 | |
| m7G(5')ppp(5') G RNA cap | New England Biolabs | S1404S | |
| Century Marker Template Plus | Ambion | AM7782 | |
| Easytides UTP [α-32P] 250 μCi | Perkin Elmer | BLU507H250UC | |
| Gel loading buffer II | Ambion | 8546G | |
| DEPC treated water | Ambion | AM9906 | |
| 10x TAE | Fisher | BP13354 | |
| 10x TBE | Ameresco Life Sciences | 0658-4L | |
| 10x PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Urea | Fisher | BP169-212 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED | Fisher | BP150-20 | |
| Ammonium acetate | Fisher | A637-500 | |
| 40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | |
| 100% absolute ethanol 200 proof | Acros | 61509-0040 | |
| Acid phenol:chloroform | Ambion | 9720 | For RNA |
| Scintilation fluid | Fisher | SX18-4 | |
| Rnase inhibitor | Promega | N261B | |
| Polyvinyl alcohol- PVA | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Creatine phosphate | Calbiochem | 2380 | |
| 100 mM dATP | Fisher | BP2560-4 | |
| SDS | Acros | 23042-5000 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| Adjustable sequencing unit | Sigma-Aldrich | Z351881-1EA | |
| Binder clips | Office Depot | 838-056 | |
| 20 cm x 42 cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z352543 | 1 SET |
| 20 cm x 22 cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z35252-7 | 1 SET |
| 20 cm x 42 cm aluminum cooling plates | Sigma-Aldrich | Z352667 | 1 EA |
| 0.4 mm x 22 cm spacers | Sigma-Aldrich | Z35230-6 | 1 SET |
| 0.4 mm x 42 cm spacers | Sigma-Aldrich | Z352314-1 | 1 SET |
| 8-well comb | Sigma-Aldrich | Z35195-4 | 1 EA |
| 16-well comb | Sigma-Aldrich | Z351962 | 1 EA |
| 32-well comb | Sigma-Aldrich | Z351970 | 1 EA |
| Gel repel coating | C.B.S. Scientific | SGR-0401 | or SGR-0101 for individual bottle |
| Gel loading tips | Rainin | GT-10-4 | 0.1-10 μl |
| Sequencing PowerPac HV | Bio-Rad | PowerPac HV | 5,000 V/500 mA/400 W |
| Gel Dryer Model 583 | Bio-Rad | Model 583 | |
| Hydrotech vacuum pump for gel dryer | Bio-Rad | ||
| Glogos II Glow-in-the-dark markers | Agilent | 420201 | |
| Film 8 x 10 | Midsci | BX810 | |
| Film 14 x 17 | Phenix | F-BX1417 | |
| Autoradiography cassette | Fisher | FBCA 1417 | 8 x 10 size available |
References
- Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
- Wahle, E., Ruegsegger, U.
- Colgan, D. F., Manley, J. L. Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation. Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA biology. 9, 563-576 (2012).
- Danckwardt, S., et al. The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations. Blood. 104, 428-435 (2004).
- Moreira, A., et al. The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms. Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).
- Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S.
- Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal. Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).
- Moore, C. L., Sharp, P. A. Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate. Cell. 41, 845-855 (1985).
- Gilmartin, G. M. mRNA formation and function. , Academic Press. New York. 79-98 (1997).
- Wahle, E., Keller, W. RNA Processing. Vol. II. , Oxford University Press. 1-34 (1994).
- Chabot, B. RNA Processing Vol I. 1, Oxford University Press. 1-29 (1994).
- Valente, S. T., et al. HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8. Mol Cell. 36, 279-289 (2009).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
- Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. 2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase. Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).
- Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA. EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).
- Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs. Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).
- Takagaki, Y., et al. A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs. Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).
- Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits. Mol Cell. 1, 243-253 (1998).
- Vries, H., et al. Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors. EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).
- Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing. Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Mol Cell. 33, 365-376 (2009).
- Bentley, D. L. Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors. Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).
- Tian, B., Manley, J. L. Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it. Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).
- Ryner, L. C., Manley, J. L. Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro. Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).
- Hirose, Y., Manley, J. L. Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro. J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).
- Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage. RNA. 15, 483-492 (2009).
