Abstract
Nous décrivons une méthode récemment développée pour mesurer les propriétés mécaniques des surfaces de tissus végétaux en utilisant microscopie à force atomique (AFM) micro / nano-indentations, pour un JPK AFM. Plus précisément, dans ce protocole, nous mesurons le module de parois cellulaires de Young apparent à des résolutions sub-cellulaires à travers les régions de jusqu'à 100 um x 100 um de méristèmes floraux, hypocotyles et les racines. Cela nécessite une préparation minutieuse de l'échantillon, la sélection correcte de micro-pénétrateurs et des profondeurs d'indentation. Pour tenir compte des propriétés de la paroi cellulaire seulement, les mesures sont effectuées dans des solutions fortement concentrées de mannitol en vue de plasmolyser les cellules et ainsi supprimer la contribution de la pression de turgescence des cellules.
Contrairement à d'autres techniques existantes, en utilisant différents pénétrateurs et les profondeurs d'indentation, cette méthode permet la mesure simultanée de plusieurs échelles, Toutefois, plusieurs limitations persistent: le procédé ne peut être utilisé sur des échantillons relativement petits (autour de 100 um de diamètre) et seulement sur des tissus externes; la méthode est sensible à la topographie de tissu; il ne mesure que certains aspects des propriétés mécaniques complexes du tissu. La technique se développe rapidement et il est probable que la plupart de ces limitations seront résolus dans un proche avenir.
Introduction
La croissance des plantes est obtenue par l'expansion coordonnée des parois cellulaires rigides qui entourent chacune des cellules de l'organisme. L'accumulation de preuves indique que c'est grâce à la modification de la chimie de la paroi cellulaire des plantes qui contrôlent localement cette expansion. L'expansion est pensée pour être entraînée principalement par pression sur les parois des cellules, provoquée par la haute pression de turgescence de la cellule; cette réponse en déformation à la pression de turgescence est régie par les propriétés mécaniques des parois cellulaires 1. On sait peu de ces propriétés mécaniques et comment ils changent au cours du développement. Par ailleurs on sait peu de la façon dont ces propriétés mécaniques sont contrôlés et si des évaluations contribuent à modifier la chimie de la paroi cellulaire d'une manière qui est apparemment coordonné à travers un tissu. Si nous voulons comprendre le lien entre les changements chimiques et mécaniques dans les parois cellulaires de la plante au cours du développement, et, finalement, comment ces interactions microscopiques régissent une planteDe croissance macroscopique, une méthode qui peut surveiller les propriétés mécaniques des parois cellulaires dans le développement des organes à l'échelle cellulaire ou tissulaire est nécessaire.
La méthode microscopie à force atomique (AFM) décrit ici, qui est basé sur micromètre ou du nanomètre compressions de tissus ou entailles, a été développé précisément pour mesurer les propriétés mécaniques des parois cellulaires dans le développement des organes simultanément à des résolutions sub-cellulaires et dans des régions entières du tissu. D'autres méthodes ont soit une résolution qui est trop bas ou trop élevé: l'extensomètre est seulement capable de mesurer les propriétés mécaniques moyennes d'un tissu tout à l'échelle du millimètre 2-4, une échelle qui est par exemple trop grande pour mesurer les événements précoces l'organogenèse; la microindenter peut prendre des mesures à la résolution subcellulaire à l'échelle du nanomètre, mais il est limité à la mesure des cellules isolées et non des groupes de cellules ou d'organes 5-7. Avec l'AFM, le besoind tissulaire, cellulaire et subcellulaire des résolutions peuvent être atteints 8-10. Récemment, plusieurs protocoles ont été développés spécifiquement pour mesurer la mécanique de plantes tissus qui pourraient également être utilisés 11, 12.
Nous allons présenter ici comment évaluer l'élasticité des tissus grâce à la mesure du module de Young apparent 13.
Le module d'Young est couramment utilisé pour décrire la rigidité du matériau. Pendant petite déformation de la force requise pour déformer un matériau est proportionnelle à la surface de l'indentation. Le module d'Young est ce coefficient. Dans le cas d'un matériau homogène continu le même coefficient sera mesuré, indépendamment du type d'indentation (de taille et la forme) mais va changer avec la vitesse de la mesure. Dans le cas de la structure complexe de tissus végétaux, nous avons observé que la mesure de la force est proportionnelle à la déformation permettant la détermination deun coefficient de proportionnalité que l'on nomme «module de Young apparent». En contraste à partir de supports continus dans les plantes, ce module de Young apparent est sensible à la taille de l'indentation. Elle ne correspond pas à la jeune modules d'une paroi cellulaire pure. Il décrit le mieux l'élasticité de l'échafaudage de la paroi cellulaire du tissu.
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Protocol
1. Préparer lames de verre pour l'échantillon de montage
- Préparer plongement médias agarose: 0,7% d'agarose à faible point de fusion dans 10% de mannitol (dans l'eau).
- L'utilisation d'un instrument de métal solide (par exemple pointe de forage, de la chaux), graver un cm x 0,5 0,5 zone dans le centre d'une lame de verre de microscope. Ou plutôt, coller un petit morceau de lamelle de verre (environ 20 x 200 um) à la lame de verre avec de la colle Araldite. REMARQUE: Cette rugosité de la surface, afin de faciliter l'adhérence de l'agarose afin de s'assurer que les bâtonnets de médias d'agarose ou des corrections à la diapositive. Cette glissière peut être réutilisé.
- Positionner une gouttelette d'environ 20 pi d'agarose à insérer de support sur la région gravée de la lame de verre. On obtient ainsi un film mince d'agarose.
- Conservez la lame de verre dans une boîte humide et attendre que les médias d'agarose à solidifier.
2. Dissection et montage échantillons méristèmes
- Microdissect méristèmes pour imagination confocaleng: supprimer les boutons floraux, un par un à partir de la tige en les tirant vers le bas avec des pincettes ultra-fines. Il est important d'enlever tous les bourgeons floraux à les bourgeons qui ne présentent pas de sépales (c'est à dire les ébauches de P1 14).
- En utilisant une lame de rasoir ou la pointe de la pince à épiler, couper le méristème loin de la tige. La coupe doit être parallèle à la région de la surface du méristème qui doit être mesurée à l'aide de l'AFM. Le sommet obtenu doit être comprise entre 300 um et 600 um haute pour passer sous la pointe de l'AFM.
- Poussez le sommet dans le film de médias agarose préparés à l'étape 1.1.4. Choisir un emplacement sur la lame de verre / agarose et pousser doucement de telle sorte que le méristème est à la fois directement en contact avec la lame de verre et fait saillie hors de l'agarose. Il est essentiel de positionner le méristème dans la gélose dans les quelques secondes qui suivent sa coupe de la tige. NOTE: Ceci est pour éviter le méristème de séchage. A ce stade, le méristème sera debout dans un crack parce que l'agarose fracturé lors de l'application de la pression.
- Préparer plusieurs méristèmes de cette manière pour l'imagerie par lots, à condition qu'ils soient de la même hauteur et sont placées à moins de 500 pm les unes des autres sur la diapositive. Gardez les méristèmes préparés dans la zone humide tandis que la dissection des échantillons supplémentaires.
NOTE: Il limite la variation venant de l'étalonnage. Idéalement 2 échantillons de chaque état peuvent être préparés et mesurés de façon aléatoire. Jusqu'à présent, il est sans effet observé de l'imagerie de lot sur la mesure (stress induit une réponse). Cela pourrait être, grâce à la dilution de molécules de signalisation de stress dans l'agar-agar et / ou de la solution de montage. En variante, la réaction de stress est la même quelle que soit la quantité de l'échantillon préparé. - Avant de passer à l'étape suivante, assurez-vous que la frontière entre le méristème et les boutons floraux est sec. Sinon, retirez délicatement l'excès d'eau avec un papier filtre. Cela devrait éviter dans l'étape suivante que le fonduagarose inonde l'échantillon en raison de forces de capillarité.
- Avec une pipette 20 ul, ajouter suffisamment fondu de montage agarose à remplir la fissure créée à l'étape 1.2.3. et à entourer chaque méristème. L'agarose devrait atteindre le niveau de la cicatrice de bourgeon de fleur enlevé (de primordium). Pour ce faire, il peut être nécessaire d'ajouter d'agarose à chaque extrémité de la fissure.
- Lorsque la gélose est ajouté, il va rapidement inonder dans la fissure; à l'aide de la pipette, aspirer une partie de l'agarose fondu de montage afin de s'assurer que le méristème est le point le plus haut sur le coulisseau. Cela corrige le méristème de sorte qu'il ne peut pas se déplacer au cours de l'imagerie.
3. Montage des racines ou hypocotyle échantillons
- Pour les racines et les hypocotyles, aucune dissection est nécessaire. Dans le film mince d'agarose sur la lame de verre préparées, faire une rainure, soit directement au-dessus d'une gravure dans le verre ou le long d'une lamelle de verre. Positionner la racine ou de l'hypocotyle dans cette rainure en s'assurant qu'il est en contact avec leverre sur toute sa longueur.
- Avant de passer à l'étape suivante, assurez-vous que l'échantillon est sec à sa surface. Sinon, retirez délicatement l'excès d'eau avec un papier filtre.
- Ajouter fondu de montage agarose autour de l'échantillon comme dans l'étape 1.2.6.
4. AFM Préparation et Calibrage de la sensibilité (pour un JPK Nanowizard AFM)
- Monter un porte à faux sur l'AFM. Le cantilever doit être monté avec pénétrateur de forme ronde. Le rayon détermine les coordonnées x, y, z de résolution et la profondeur de pénétration au cours de laquelle une mesure précise puisse être archivée.
- Pour prendre des mesures méso-échelle nanométrique à la surface de l'épiderme, utiliser un pénétrateur ronde rayon de 50 nm; de prendre des mesures méso-échelle, utiliser un rayon um pénétrateur ronde 0,5; de prendre des mesures micrométriques (dans 2-3 cellules), utiliser un pénétrateur ronde 2,5 um de rayon.
- Positionner le laser à la pointe de la poutre. Aligner le laser au milieudu capteur à l'aide du miroir.
- Placez un verre propre sous l'AFM.
Remarque: le texte suivant est réglé pour transformer le signal de la position du laser sur le récepteur AFM en une déformation de la poutre et, par l'évaluation de la constante de rappel du levier, pour la traduire en une force. - Approche avec une force de cible "consigne" de 1 V.
- Sélectionnez «spectroscopie de force". Faites une entaille en réglant le maximum "point de consigne par rapport" à 2 V, la "étendre vitesse" à 40 um / s, et le "z longueur" à 5 um.
- Dans le menu "calibrage gestionnaire", sélectionnez la partie linéaire de la courbe vers l'avant pour s'adapter à la sensibilité à l'aide du bouton «sélectionner gamme ajustement". Le "point de consigne par rapport" devrait être transformé de "V" pour "mètre".
- Dans le menu «gestionnaire d'étalonnage", sélectionnez "constante de rappel» pour évaluer l'elasticity du cantilever, avec des fluctuations thermiques. Appuyez sur "Exécuter" pour obtenir le tracé de la densité spectrale de la poutre. Trouver le pic de résonance à la fréquence la plus basse. Monter à l'aide de la touche «select gamme ajustement".
NOTE 1: Pour plus de détails sur le réglage des fluctuations thermiques, lu Cook et al 15.
NOTE 2: Il est préférable d'utiliser une méthode directe pour évaluer l'élasticité de la poutre à l'aide d'une console de référence (ou matériau de raideur connue). Celle utilisée ici a été gracieusement offert par Atef Asnacios 16. - Ajouter 200 pi de solution de mannitol à 10% sous la pointe du cantilever. Réaligner le laser au moyen du capteur à l'aide du miroir.
- Recalibrer la sensibilité: à partir du menu "calibrage gestionnaire", cliquez sur le bouton «inconnu»; répétez les étapes 2.3 à 2.5.
. 5 Acquisition de données: module de Young apparent de Cartographie
6. Analyse des données: calculs de l'apparente module d'Young
- Ouvrir le fichier de données dans le logiciel d'analyse de données.
- Sélectionnez "traitement par lots" pour appliquer la même analyse à toutes les courbes d'une seule carte.
- Sélectionner "corriger la hauteur de la flexion de la poutre" afin d'extraire la profondeur de pénétration.
- Sélectionnez "module fonction d'ajustement de Young» qui suppose la force est proportionnelle à la surface de l'indentation. Réglez la "forme de pointe" pour paraboliques de supposer que la forme d'indentation est une parabole.
- Indiquez le rayon de la pointe.
- Sélectionner préférentiellement le "retract" courbe de l'analyse, car il est moins sensible à la topographie de la courbe "étendre". Cependant, si il ya adhérence importante de la sonde au cours de la "rentrée", utilisez la courbe «prolonger», qui est insensible à coller.
- Setle coefficient de Poisson de 0,5. Appuyez sur analyser et enregistrer la sortie.
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Representative Results
Dans la figure 1, nous présentons des cartes de modules jeunes typiques de méristèmes floraux (Figures 1A et 1B), jeunes et vieux hypocotyles (figures 1C-F), et méristème de la racine (figure 1G et 1H). Dans toutes les expériences, le pénétrateur est hémisphérique, mais son rayon est différent de sorte que différentes résolutions spatiales peuvent être atteints figures 1C et 1D montrent des résultats typiques pour les pénétrateurs méso-échelle nanométrique (rayon nm 50) avec des indentations méso-échelle nanométrique (50 nm de profondeur).; . les cartographies révèlent des hétérogénéités microscopique dans les murs de cellules hypocotyle épidermiques cellulaires de surface Figures 1A, 1E et 1G montrent des résultats typiques pour pénétrateurs à méso-échelle (500 NM de rayon) avec des empreintes de méso-échelle (500 nm de profondeur) pour méristème floral, hypocotyle et la racine; noter que, parce que le rayon de pénétrateur est supérieur au diamètre de la paroi de cette cellule méso-indentation évalueJeunes modules «apparentes» de parois cellulaires anticlinal (voir Peaucelle et al. 9,17 et Braybrook et al. 10 pour plus de détails). Enfin, la figure 1B montre un cartographe pour pénétrateurs microscopique (2,5 um de rayon) avec des empreintes de méso-échelle (500 nm de profondeur); intéressant, l'imagerie à cette résolution a révélé ramollissement des tissus lors de l'initiation d'un organe qui a précédé une croissance visible 9.
Nous soulignons aujourd'hui et proposons des solutions partielles à quatre difficultés techniques qui se posent fréquemment lors de l'utilisation de l'AFM pour mesurer les propriétés de développement des organes végétaux. Tout d'abord, les échantillons peuvent être mal ancrées dans l'agarose: les régions qui sont couverts avec de l'agarose ne peuvent être correctement évalués (voir les bords de la figure 1E flèche). Pour résoudre ce problème, essayez l'étape 1.2.6 répéter. Deuxièmement, les échantillons qui sont mal résolus à la lame de verre peuvent se déplacer au cours de l'expérience; alors rayures aberrantes apparaissent dans les images dûà décorrélation entre le droit progresser analyses (figure 1F) et gauche. Pour résoudre ce problème, essayez soin de répéter la préparation de l'échantillon. Troisièmement, le z-gamme de la taille de l'échantillon doit être inférieure à un certain seuil. Il n'ya aucune restriction sur la taille moyenne de l'échantillon dans la direction z vertical, mais la gamme de hauteur dans la direction z (distance entre les points les plus élevés et les plus bas) doit être inférieure à 15 um, sinon la recherche sera annulée (voir Figure 1B; paramètres sont dans la Nanowizard AFM). C'est parce que, pendant le balayage, l'AFM permet de régler automatiquement la hauteur de la poutre en fonction de la hauteur de l'échantillon, mais en un seul balayage la hauteur de la poutre peut varier que de 15 pm. Pour résoudre ce problème, utilisez le module de CellHesion JPK, ce qui augmente le z-gamme à 100 um, comme le montre la figure 1E-G. Quatrièmement, la méthode est sensible aux topographies de surface: plus la surface de l'échantillon est oriented parallèle à la direction du poinçonnement, le moins fiable des mesures. Dans l'échantillon de racine présenté sur la figure 1G-H, les parois des cellules parallèles à l'axe long de la racine ne sont pas visibles au niveau des bords supérieur et inférieur de l'analyse: ici la surface de la racine est loin d'être perpendiculaire à l'indentation. Dans le méristème, de même, les parois des cellules au niveau des bords de bourgeons à fleurs n'ont pas été correctement mesurées (Figure 1A). Pour méso-échelle nanométrique indentations (Figure 1C), à nouveau cet effet topographique est observé: les tranches de cellules sont mesurées de manière incorrecte comme étant doux précisément là où la courbe de cellules à une distance à partir du plan de la poutre. Un outil d'analyse de données qui est en mesure de tenir compte de ces effets topographiques pourrait résoudre ce artefact dans l'avenir, mais un tel outil n'est pas encore disponible.
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Discussion
Chez les plantes, la modification des propriétés mécaniques jouent un rôle majeur dans la direction de la croissance et de la morphogenèse. À ce jour, il ya eu de grands progrès dans le décryptage des réseaux génétiques et chimiques qui contrôlent la croissance des plantes, mais notre connaissance de la façon dont ces réseaux contribuent à et sont affectés par les changements des propriétés mécaniques est rudimentaire. Cette méthode devrait nous permettre de combler cette lacune, et il devrait donc être de grand intérêt pour les scientifiques qui étudient un aspect quelconque de la croissance des plantes ou la morphogenèse. Nous résumons maintenant les défis et les limites de la méthode, et les perspectives d'avenir.
L'étape la plus difficile dans le protocole est la préparation des échantillons. L'échantillon doit être solidement fixé à la lame de verre avec de l'agarose mais ce gélose doit pas couvrir toutes les zones de l'échantillon qui sont à mesurer. En outre, la préparation doit être achevée assez rapidement (en quelques minutes) de manière à empêcher le séchage et la délicatesse de manière à empêcher les lésions tissulaires: blesser une la sécheresse sont prévus pour entraîner des changements irréversibles dans les propriétés mécaniques de la paroi de la cellule 18. Une autre étape difficile est de choisir les bons paramètres micro-indentation AFM: en fonction de la question scientifique, tissu, cellulaire, ou la résolution subcellulaire peuvent être obtenus avec différents pénétrateurs et des profondeurs d'indentation. Pour plus d'informations, voir 9,10.
Le procédé a plusieurs limitations. Tout d'abord, le procédé est limité à la mesure des propriétés mécaniques au niveau des surfaces des organes; une tentative d'élaborer un protocole de mesure de régions de l'intérieur des organes de résection est en cours dans notre laboratoire. Deuxièmement, tissus différenciés avec une topographie très variable sont très difficiles à mesurer; par exemple, les trichomes bloquent l'accès à l'épiderme des feuilles de la pointe de l'AFM et les tiges, et de même, les poils absorbants bloquent l'accès à l'épiderme de la racine de la pointe de l'AFM. Troisièmement, le procédé est préférable de l'appliquer à des échantillons d'une longueur de 100 um ou less; il peut être utilisé sur des échantillons plus grands allant jusqu'à 1 mm, mais cela nécessite beaucoup de temps des mesures successives cartographiques (comme représenté sur la figure 1D et 1E). Enfin, les mesures AFM seulement d'une partie de la complexité mécanique de la paroi cellulaire: elle est limitée à des expériences de mise en retrait de compression, tandis que les parois des cellules sont des gels complexes qui peuvent présenter des propriétés mécaniques différentes selon le type de déformation (par exemple, la tension vs compression). Dans un premier temps, ce procédé limité à la compression semble être non ou à distance capable de renseigner sur la croissance, qui est un dérivé de paroi cellulaire de turgescence processus d'étirement. Pourtant, à notre propre mesure de supersize sur le méristème 9, 19 ou sur l'hypocotyle (données non publiées) indique une corrélation étonnante entre l'élasticité mesurée par le module de Young et la croissance apparente. Nous espérons que dans l'avenir, le développement de cette technique permettra de comprendre cette énigme.
Laméthode présentée ici seulement mesurée certains aspects des propriétés mécaniques élastiques des tissus de plantes, comme expliqué ci-dessus. Mais les tissus vivants se comportent visqueuse, et la visco-élastique et comportement combiné est prédite important pour la croissance et le développement 16,20. Jusque-là sous silence, nous avons observé des réponses des parois cellulaires de l'AFM micro-indentations qui étaient en fonction du temps sur des dizaines de secondes - cette réponse a été caractérisé comme viscoélastique. Dans nos travaux précédents, nous avons présenté une méthode de l'AFM pour évaluer cette réponse viscoélastique 9. Une autre propriété importante de la croissance d'un tissu de médiateur est la pression de turgescence des cellules locales. Pour mesurer la pression de turgescence, nous sommes confrontés à des défis semblables: il n'existe pas encore une technique qui mesure à la résolution de méso-échelle à travers les tissus. Les microsondes de pression utilisés dans les usines étaient, jusqu'à récemment, limitée par le rayon de la pointe du verre, ce qui est la taille des cellules du méristème (5 um) 12, 21. Autreavenue très prometteuse de la recherche est de développer cette méthode de l'AFM pour une utilisation sur les tissus non-plasmolysées; nous l'espérons, de cette façon, révéler la relation entre la pression de turgescence de la cellule unique et la croissance des tissus. Cette méthode s'applique essentiellement à la mesure de turgescence AFM déjà développé par retrait à l'aide d'autres appareils et utilisé sur des cellules individuelles de 22 à 24.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Un merci tout spécial à Yves Couder pour de nombreuses discussions utiles. Nous remercions Atef Asnacios pour l'étalonnage des consoles et des discussions. Nous remercions Lisa Willis, Elliot Meyerowitz, et Oliver Hamant pour la lecture critique. Ce travail a été financé en partie par Human Frontier Science Program RGP0062/2005-C de subvention; Projets de l'Agence Nationale de la Recherche'' Growpec,'' et'' Mechastem''.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are able to do the work with the same preferment. |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope. |
| Stereo microscope | Leica | M125 | Any type of stereo microscope could do. |
| 150 nm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use. |
| 1 µm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis. |
| Tipless cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | TL-NCH-20 | To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever. |
| 5 µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Araldite | Bartik S.A. 77170 Coubet, France | Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever. | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 °C gelation temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland | 951199 |
References
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