Abstract
我々は、JPK AFMのために、原子間力顕微鏡（AFM）マイクロ/ナノくぼみを用いて植物組織の表面の機械的特性を測定するために、最近開発された方法を記載している。具体的には、このプロトコルでは、我々は花の分裂組織、胚軸および根×100ミクロンまで100μmの地域間で細胞内の解像度で細胞壁の見かけのヤング率を測定します。これは、サンプルの慎重な準備、マイクロ圧子とインデントの深さを正確に選択する必要があります。唯一の細胞壁の特性を考慮して、測定は、細胞を原形質分離を起こさせる、従って、細胞膨圧の寄与を除去するために、マンニトールの高濃度溶液中で行われる。
他の現存の技術とは対照的に、別の圧子の押し込み深さとを用いて、この方法は、マルチスケール同時測定を可能にする しかし、いくつかの制限が残っているこの方法はかなり小さな試料（直径100ミクロン程度）にして、外部の組織にのみ使用することができます。方法は、組織地形の影響を受けやすいです。それは、組織の複雑な機械的特性のみ特定の側面を測定します。技術が急速に開発されており、これらの制限のほとんどは、近い将来に解決される可能性がある。
Introduction
植物における成長は、各々を取り囲む硬質細胞壁の協調膨張および生物のあらゆる細胞によって達成される。証拠が蓄積することは、植物が局所的にこの膨張を制御すること、細胞壁の化学的性質の改変によるものであることを示している。膨張は、細胞の高い膨圧によって引き起こされる、セル壁に株によって主に駆動されると考えられている;膨圧この歪み応答は、細胞壁1の機械的特性によって支配される。少しは、これらの機械的特性が知られており、それらは開発中にどのように変化するか。さらには、これらの小さな機械的特性を制御する方法で明らかにし、この組織を横切って調整されるようにして細胞壁の化学的性質を変化させるために貢献するかどうかは知られている。我々は、開発中に、植物細胞壁中の化学的および機械的変化との間の接続を理解することであり、これらの微視的な相互作用は、プラントを管理する場合には、最終的にどのようにの巨視的成長、細胞または組織スケールでの臓器の開発における細胞壁の機械的特性を監視することができる方法が必要とされる。
原子間力顕微鏡（AFM）マイクロメートルまたはナノメートルの組織の圧迫又はくぼみに基づいてここで説明する方法は、正確に細胞下解像度で同時に臓器の開発に組織の全領域にわたって細胞壁の機械的特性を測定するために開発された。伸びは、ミリメートルスケール2-4における全組織の平均的な機械的特性を測定することができるだけであり、例えばにおける初期事象を測定するには大きすぎる規模：他の方法が低すぎたり高すぎる解像度のいずれかを有する器官形成; microindenterは、ナノメートルスケールでの細胞内の分解能で測定を行うことができますが、単離した細胞ではない細胞または器官5-7のグループの測定に限定されている。 AFMで、必要とするdは、組織、細胞、および細胞下解像度は8-10達成することができる。最近、いくつかのプロトコルはまた、11、12を用いることができる植物組織の力学を測定するために特別に開発されてきた。
私たちは、見かけのヤング率13の測定により組織の弾力性を評価する方法をここに紹介します。
ヤング率は、一般に材料の剛性を説明するために使用される。微小変形中に材料を変形させるのに必要な力は、くぼみの面積に比例する。ヤング率は、この係数である。連続均質な材料の場合には同一の係数に関係なくインデントの種類（サイズと形状）の測定されますが、測定の速度で変化します。植物組織の複雑な構造の場合、我々はこれまで力判定を可能にする変形に比例することを観察した我々は「見かけヤング "という名前を比例係数。植物中の連続メディアからこれとは対照的に、この見かけヤング率は、インデントの大きさに敏感である。それは、純粋な細胞壁の若いモジュラスに対応していない。それは最高の組織の細胞壁の足場の弾力性を説明しています。
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Protocol
1。試料載用ガラススライドを準備
- アガロースメディアを埋め込む準備：10％マンニトール（水中）での0.7％低融点アガロースを。
- 強力な金属器具（ 例えばドリル先端、ライム）を使用して、顕微鏡スライドガラスの中央にある0.5×0.5センチメートルの領域をエッチングする。またはその代わりに、アラルダイト接着剤を使用してスライドガラスにガラスラメラ（約20×200ミクロン）の小片を接着します。注：これはスライドにアガロースメディアスティックまたは修正のことを確認するためにアガロースの付着を容易にするために、表面を粗くする。このスライドは、再利用することができます。
- スライドガラスのエッチングされた領域の上にアガロースメディアを埋め込む約20μlの液滴を配置します。これは、アガロースの薄膜を提供します。
- 湿度の高いボックス内のガラススライドを保存し、アガロースメディアが固化するのを待ちます。
2。分裂組織のサンプルを解剖し、取付
- 共焦点想像力のための顕微解剖分裂組織NG：超微細ピンセットでそれらを引いて、茎から花芽を一つずつ削除してください。それは、がく片（ すなわち 、P1の原基14）を示さない芽までのすべての花芽を除去することが重要である。
- かみそりの刃やピンセットの先端を使って、離れて茎から分裂組織をカット。カットはAFMを用いて測定される分裂組織表面の領域に平行であるべきである。得られた頂点は300ミクロンとAFMチップの下に収まるように高さ600μmの間であるべきである。
- ステップ1.1.4で調製したアガロースメディアのフィルムに頂点を押し込みます。ガラススライド/アガロース上の位置を選択し、分裂組織は、スライドガラスに接触して、直接的であり、アガロースから突出するようなゆっくりと押し込みます。これは、茎からのカットに従って数秒以内にアガロース中分裂組織を配置することが重要である。注：これは、分裂組織からの乾燥を防止するためである。この段階では、分裂組織は、CRACに立ってされますアガロースは、圧力を加えると破断のでkである。
- 彼らは同じ高さのものであり、スライドに互いに500μm未満に位置していることを条件に、バッチ画像化のために、いくつかの分裂組織をこのように準備します。さらにサンプルを解剖しながら、湿度の高いボックスで作成分裂組織を維持する。
注：キャリブレーションからの変化を制限します。各条件の理想的に2サンプルを調製し、無作為に測定することができる。これまでの測定（ストレス誘発性応答）上のバッチ·イメージングの無影響はありません。これは、寒天および/または取り付け、溶液中のストレスシグナル伝達分子の希釈のおかげである可能性があります。代わりにストレス応答に関係なく、用意されたサンプルの量に同じです。 - 次のステップに移る前に、分裂組織及び花芽の境界が乾燥していることを確認してください。そうでない場合、穏やかに濾紙を用いて余分な水分を除去する。これは溶け、次のステージに防ぐ必要がありますアガロース毛管力によるサンプルをフラッディングします。
- 20μlのピペットを用いて、ステップ1.2.3で作成した亀裂を埋めるために、アガロース取り付け溶融十分を追加します。各分裂組織を取り囲むように。アガロースは、削除された花芽（原基）の瘢痕のレベルに達する必要があります。これを達成するためには、亀裂の各端部にアガロースを添加する必要があり得る。
- アガロースを添加する場合、それはすぐにクラック内にフラッディングし;ピペットを用いて、溶融分裂組織がスライド上の最高点であることを保証するために、アガロースマウントの一部を吸う。それは撮像中に移動できないようにするためには、成長点が修正されています。
3。取付ルートまたは胚軸サンプル
- 根と胚軸の場合は、何解剖は必要ありません。準備されたスライドガラス上のアガロースの薄膜では、直接ガラスエッチングの上やガラスラメラに沿っていずれかの溝を作る。それが接触していることを保証する、この溝のルートや胚軸を置きその全長に沿ってガラス。
- 次のステップに進む前に、サンプルがその表面に乾燥していることを確認してください。そうでない場合は、ゆっくりと、ろ紙を用いて水の過剰を取り除く。
- 追加ステップ1.2.6のように、試料周辺のアガロース取り付け溶融。
4。原子間力顕微鏡の準備と感度校正（JPK Nanowizard AFM用）
- AFMにカンチレバーをマウントします。カンチレバーは丸い形の圧子を装着しなければならない。半径のx、y、zの分解能と正確な測定をアーカイブすることができた時の押し込み深さを決定する。
- 表皮の表面にメソスケールの測定を行うために、半径50nmの丸い圧子を使用します。メソスケールの測定値を取るために、0.5μmの半径ラウンド圧子を使用します。 （2-3セル間）マイクロスケールの測定値を取るために、2.5μmの半径ラウンド圧子を使用しています。
- カンチレバーの先端にレーザーを配置します。中央にレーザーの位置を合わせますミラーを用いキャプターの。
- 原子間力顕微鏡の下にきれいなガラスを配置します。
注：以下は、カンチレバーの変形に原子間力顕微鏡の受容体上のレーザー位置の信号を変換するように設定して、カンチレバーのバネ定数を評価することによって、力に翻訳することです。 - 1 Vの目標力」セットポイント」とアプローチ
- 「力分光法」を選択します。 2 Vまで最大「相対セットポイント」を設定することで、インデントを行い、40ミクロン/秒に「スピードを引き出す」、および5μmで「Z長」。
- 「キャリブレーションマネージャ」メニューから、「フィット範囲を選択」ボタンを使用して感度に合わせて前進曲線の直線部分を選択します。 「相対セットポイント」は、「メートル」に「ボルト」から変換する必要があります。
- 「キャリブレーションマネージャ」メニューから、ELを評価するために、「ばね定数」を選択熱揺らぎを利用しカンチレバーのasticity。カンチレバーのスペクトル密度プロットを取得するために押して「ファイル名を指定して実行」。最も低い周波数で共振ピークを見つける。 「フィット範囲を選択」ボタンを使用して、それに合う。
注1：熱変動のチューニングの詳細については、Cook ら 15を読む
注2：これは、（既知の剛性を有する材料または）基準カンチレバーを用いてカンチレバーの弾力性を評価するために直接法を用いることが好ましい。ここで使用する1は親切にアテフAsnacios 16から寄贈された。 - カンチレバー先端の下で10％マンニトール溶液200μlを加える。ミラーを用いた捕獲の中央にレーザーを再調整。
- 「キャリブレーションマネージャ」メニューから、「不明」ボタンをクリックしてください。：感度を再調整繰り返します2.5に至るまで2.3を繰り返します。
5データ収集：見かけのヤング率地図作成
6データ解析：見かけのヤング率の計算
- データ解析ソフトウェアにデータファイルを開きます。
- 単一のマップのすべての曲線に同じ分析を適用するために、「バッチ処理」を選択します。
- その押し込み深さを抽出する "カンチレバーの曲げのための高さを修正する」を選択します。
- 力はインデントの面積に比例すると仮定します "ヤングフィット関数」を選択します。インデントの形状が放物線であることを前提とする放物線する「先端形状」を設定します。
- 先端の半径を示している。
- それは、 "拡張"曲線よりも地形の影響を受けにくいため、優先的に分析するため、「後退」曲線を選択します。プローブの重要な固着が中に存在する場合は、「後退、「固着の影響を受けない「延長」曲線を使用しています。
- セット0.5ポアソン比。出力を分析し、保存を押します。
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Representative Results
図1において、我々は花の分裂組織（ 図1Aおよび1B）、老いも若きも胚軸（ 図1C-F）、および根分裂組織（ 図1G及び1H）の代表的なヤングモジュラスマップを提示する。全ての実験において圧子は、半球状であるが、異なる空間解像度が達成できるように、その半径が異なり1Cおよび1Dは、メソスケール-ナノスケールのくぼみ（50 nmの深さ）を有するメソスケール-ナノスケール圧子（50 nmの半径）の典型的な結果を示す。 cartographsは胚軸の表皮細胞の表面細胞壁中のマイクロスケールの不均一性を明らかに図1A、1E、および1Gは花の分裂組織、胚軸、根のためのメソスケールのくぼみ（500 nmの深さ）とメソスケール圧子（500 nmの半径）の典型的な結果を示している。;圧子半径がこのメソ評価さ押込み細胞壁の直径を超えるため、ことに注意背斜細胞壁の「見かけ」ヤングモジュラス（Peaucelle ら 9,17及びBraybrook らを参照してください。詳細は、10）。最後に、 図1（b）は、メソスケールのくぼみ（500 nmの深さ）とマイクロスケール圧子（2.5μmの半径）のためcartographを示しています。興味深いことに、この解像度で撮影が9目に見える成長を前に臓器開始時に、組織の柔軟化を明らかにした。
我々は今、ハイライト表示し、植物器官の開発の特性を測定するために、AFMを使用する際に一般的に発生する4技術的な問題への部分的な解決策を提案。まず、サンプルは不適切にアガロース中に埋め込 まれることがあります。アガロースで覆われている領域を適切に（ 図1Eの矢印のエッジを参照）を測定することができません。これを解決するには、ステップ1.2.6を繰り返してみてください。第二に、不適切にスライドガラスに固定された試料は、実験中に移動してもよく;そして異常なストライプが画像に表示されます借りとなっている左右の進展をスキャンします（ 図1F）との間で非相関する。これを解決するには、サンプル前処理を繰り返して慎重にしてみてください。第三に、サンプルの高さのz範囲が特定のしきい値以下でなければなりません。そこに垂直z方向のサンプルの平均身長に制限はありませんが、z方向（最高点と最低点の間の距離）での高さの範囲は15ミクロン未満である必要があり、そうでなければスキャンは中止されます（参照図1B;設定は、AFM nanowizardにあります）。スキャン中に、原子間力顕微鏡は、自動的にサンプルの高さを合わせて、カンチレバーの高さを調整しますが、一回の走査で、カンチレバーの高さがわずか15ミクロンで変化することができるからである。これを解決するには、 図1E-Gで示したように、100μmのZ-範囲を増加させる、JPKのcellHesionモジュールを使用しています。第四に、この方法は、表面トポグラフィーに敏感である：より多くの試料表面はオリエンテですインデントの方向Dに平行、測定の信頼性が低い。 図1G-Hに示されたルートのサンプルでは、細胞壁は、根の長軸に平行にスキャンの上端と下端に表示されていない：ここに根面がはるかにインデントに垂直であるからである。分裂組織、同様に、開花芽のエッジにおける細胞壁が適切に測定されなかった（ 図1A）である。メソスケールのインデント（ 図1C）のために、再びこの地形効果が観察される：細胞のエッジを誤ってソフトな正確であると測定される離れてカンチレバーの面から細胞カーブ。これらの地形の影響を考慮することができ、データ解析ツールは、将来的にこのアーティファクトを解決することもできますが、このようなツールはまだ使用できません。
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Discussion
植物では、変化する機械的特性は、成長や形態形成を演出に大きな役割を果たしている。これまでに存在し、植物の成長を制御する遺伝的および化学的なネットワークの解明に大きな進歩であったが、これらのネットワークはに貢献し、機械的性質の変化によってどのような影響を受けるかについての我々の知識は、初歩的でもあります。このメソッドは、このギャップを埋めるために私たちを有効にする必要があり、そしてそれは、植物の成長や形態形成のあらゆる側面を研究する科学者への強い関心があるはずです。我々は今、課題や制限法の、そして今後の展望をまとめた。
プロトコルの中で最も困難なステップは、サンプル調製である。サンプルでは、しっかりとアガロースでガラススライドに固定されている必要がありますが、このアガロースは、測定すべきであるサンプルの任意の領域をカバーしてはならない。微妙に乾燥を防止しするように、組織の損傷を防止するようにさらに準備が（数分以内）に十分迅速に完了されなければならない：創傷ndは干ばつ、セル壁18の機械的特性の不可逆的変化をもたらすと予測される。別の挑戦的な工程は、適切なAFMマイクロインデンテーション設定を選択することである：科学的疑問に応じて、組織、細胞、または細胞下解像度が異なると圧子の押し込み深さを達成することができる。詳細については、9,10を参照してください。
この方法は、いくつかの制限がある。まず、この方法は、器官の表面に機械的特性を測定することに制限される;切除臓器の内部領域を測定するためのプロトコルを開発する試みは、我々の研究室で進められている。第二に、高度に可変のトポグラフィーを有する分化した組織は、測定が非常に困難である。例えば、トライコームは、葉の表皮にAFMチップのアクセスをブロックし、茎、および同様に、根毛は根の表皮にAFMチップのアクセスをブロックする。第三に、この方法は、最高の長さは100μmルのサンプルに適用されるSS;それは、最大1mmまで拡大サンプルに対して使用してもよいが、（ 図1Dおよび図1Eに示すように）、これは時間のかかる逐次的地図作成の測定を必要とする。最後に、AFM対策細胞壁の機械的な複雑さの一部のみ：セル壁が変形の種類（圧縮対例えば張力）に応じて異なる機械的特性を示し得る複雑なゲルであるが、それは、圧縮押込み試験に制限される。まず、圧縮に限定されるもので、この方法は、延伸工程膨圧誘導された細胞壁である、増殖に通知するために、非またはリモートできると思われる。しかし分裂組織9、19または胚軸（未発表データ）に当社独自のスーパーサイズの測定には明らかにヤング率と成長を通して測定弾力性との間に驚くべき相関関係を示している。将来的には、この技術の開発は、この謎を理解するのに役立ちますことを願っています。
ザ·上述したように、ここで提示した方法は、植物組織の弾性の機械的特性の特定の側面を測定した。しかし、生体組織はまた、粘性挙動、合わせた粘弾性及び弾性挙動は成長および発達16,20のために重要であることが予測される。 、我々は、時間依存数十秒にわたってたAFM微小くぼみに細胞壁の応答を、これまで言及されていない観察 - この応答は粘弾性として特徴付けられた。我々の以前の研究では、この粘弾性応答9を評価するために1原子間力顕微鏡法を提示した。組織の他の重要な増殖媒介プロパティは、細胞の局所膨圧である。膨圧を測定するために、我々は同じような課題に直面しています。組織全体のメソスケールの分解能で計測する技術はまだ存在しません。プラントで使用される圧力マイクロプローブは、最近まで、分裂組織細胞の大きさ（5〜）12、21であるガラス先端半径によって制限されていました。別の研究の非常に有望な手段は、非plasmolyzed組織で使用するため、この原子間力顕微鏡法を開発することである。我々は、単一細胞膨圧と組織の成長との関係を明らかにするために、このように、願っています。 24 -この方法は、基本的に他のデバイスを使用して、個々のセル22上で使用されるインデントによって既に開発のAFM膨圧測定に適用されます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は、多くの有用な議論のためにイヴCouderに特別な感謝を与える。私たちは、カンチレバーと議論のキャリブレーションのためのアテフAsnaciosに感謝します。我々は重要な読書のためにリサ·ウィリス、エリオットマイヤーウィッツ、そしてオリバーHamantに感謝します。この作品は、ヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラムグラントRGP0062/2005-Cによって部分的に資金を供給された。通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュは'''' Growpec、''と'' Mechastemを投影する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are able to do the work with the same preferment. |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope. |
| Stereo microscope | Leica | M125 | Any type of stereo microscope could do. |
| 150 nm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use. |
| 1 µm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis. |
| Tipless cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | TL-NCH-20 | To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever. |
| 5 µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Araldite | Bartik S.A. 77170 Coubet, France | Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever. | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 °C gelation temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland | 951199 |
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