Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Иммуногистохимические и кальция способы визуализации в Wholemount сетчатке крыс

Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/51396
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4, 1
1Department of Neurobiology, University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences, Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Протоколы Иммуногистохимия используются для изучения локализации специфического белка в сетчатке. Методы визуализации кальция используются для изучения динамики кальция в ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов.

Abstract

В этой статье мы опишем инструменты, реактивы и практические шаги, которые необходимы для: 1) успешной подготовки Wholemount сетчатки для иммуногистохимии и, 2) изображения кальция для изучения напряжения закрытого кальциевых каналов (VGCC) передачи сигналов кальция в сетчатке глаза ганглиозные клетки. Метод визуализации кальция мы описываем обходит вопросы, касающиеся неспецифическую нагрузку перемещенных амакринных клеток в слое ганглиозных клеток.

Introduction

Ганглиозных клеток сетчатки (РГК) выразить L-, N-, P / Q-и Т-типа VGCC как определено с помощью лекарственных препаратов блокады этих компонентов всей клетки Калифорния Channel ток 1,2. VGCC являются трансмембранными мультимерные белки, которые участвуют в выпуске передатчика, транскрипции генов, регуляции клеточного и синаптической пластичности 3,4,5. Функциональные VGCCs состоят как минимум из трех различных классов субъединиц: крупные, трансмембранных α 1 пор формирования подразделений, которые устанавливают биофизические и фармакологические свойства канала, в первую очередь внеклеточного вспомогательный α 2 δ субъединицы и внутриклеточные β субъединиц. Последние два форма гетеромерные комплексы с различными α 1 субъединицы и изменять литниковые кинетики и оборота каналов в мембране 6.

За последние десятилетия, многие методы были использованы для изучения белка Expreделения, такие как иммуногистохимии, иммуноферментного анализа, вестерн-анализа и проточной цитометрии. Эти методы требуют использования специфических антител для обнаружения данного белка, представляющего интерес, и обеспечивают мощный инструмент для локализации и распределения специфических белков в различных тканях. Методы, используемые для обнаружения и количественной оценки уровней экспрессии мРНК того или иного белка, такие как Нозерн-блот анализ, ОТ-ПЦР в режиме реального времени количественный ПЦР, гибридизация, кДНК-микрочипов и защиты рибонуклеазы анализа обеспечивают альтернативный подход, когда антитела не являются легко отсутствует или если уровни экспрессии конкретного белка низки 7. Тем не менее, одно ограничение на использование таких молекулярных методов является искомым идентификации последовательности гена.

Для локализации белков в сетчатке, иммуногистохимия может быть выполнена на Wholemount сетчатки. В связи с доступностью РГК, в Wholemountподготовка обеспечивает отличную платформу для изучения локализации специфических белков в somata РГК и их аксонов.

В дополнение к их локализации, некоторые функциональные свойства VGCCs в РСК может быть продемонстрирована путем использования методов визуализации кальция. Мы опишем протокол визуализации кальция выборочно маркировать РГК с индикатора кальция красителя для измерения динамики внутриклеточного кальция. Вклад различных VGCCs к сигналу кальция в различных клеточных компартментах, могут быть выделены с использованием специфических подтипов антагонистов кальция.

Возможно, одним из самых выгодных аспектов техники изображающего кальция, описанного здесь является способность одновременно и независимо записывать с нескольких РГК и их аксонов. Хотя многие физиологические методы, такие как всей записи зажима клеток патч, обеспечивают высокие временные записи разрешением мембранных токов, соматических или аксонов источник Фесе токи, записанные не может быть подвергнут дискриминации и записи могут быть сделаны только из одного нейрона в то время. Многоэлектродная массивы (МПС) способны одновременно записывать шипы из многих клетках, но не может ни обнаружить, ни дискриминации активацию, например, различных подтипов кальциевых каналов. МЭС преимущественно записывать из клеток, которые расположены в непосредственной близости от данного электрода 8 и записи из клеток, которые генерируют большие шипы 9. Методы оптических изображений обеспечивают альтернативную стратегию, с тем чтобы одновременные и независимые записи целых популяций клеток, которые могут быть интегрированы с информацией, полученной от одного микроэлектродом клеток и записи зажима патч и записи MEA. Хотя методы визуализации кальция, описанные здесь, были использованы для изучения динамики кальциевые РСК, патч зажим и МПС также могут быть использованы параллельно, чтобы дальнейшее выявление ионные токи и пики свойства РСК.

10, наша цель в том, чтобы использовать загрузочную технику, которая избирательно маркирует РГК с индикатора синтетического кальция красителя в Wholemount подготовка. Хотя синтетические красители индикатор кальция обеспечивают отличную платформу для изучения динамики внутриклеточного кальция, его широкое использование было затруднено невозможностью эффективно загружать определенные популяции нейронов в данной сети. Многие методы, такие как массовой загрузки 11 и электропорации 8,12 были выполнены, чтобы загрузить целые популяции клеток, однако, такие методы не различают специфические типы клеток. Генетически кодируемых показатели кальция обеспечивают возможность выборочно маркировать определенные популяции клеток, однако, такие методы требуют генерации трансгенных животных 13. Наша методика описывает метод избирательно маркировать РГК в Wholemount подготовки через зрительного инъекции нервных культи индикатора кальция красителя.

Взятые вместе, структурные и физиологические методы, изложенные в этой статье обеспечить платформу для изучения локализации и вклад VGCCs до сигнала кальция в РГК и их аксонов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами для благосостояния экспериментальных животных, выпущенных политики службы общественного здравоохранения США на уход человека и использованию лабораторных животных и Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA) исследовательского комитета животных. Были использованы взрослых мужчин и женщин Спрэг Доули (Charles River Lab, Уилмингтон, Массачусетс) в возрасте от 3-5 недель.

1 Животное и тканей Подготовка к Wholemount Retina и иммуногистохимии протокола

  1. Подготовьте следующие материалы и инструменты: вскрытии микроскопом, 2 щипцы с очень мелких советов, ножницы, целлюлозы фильтровальной бумаги, пластика пипетки и предметное стекло микроскопа.
  2. Эвтаназии крысу в закрытой камере с помощью глубоко анестезии животного с 1-3% изофлуран с последующей декапитацией с гильотины. Снимите глаза ножницами ириса и место в чашку Петри, содержащую внеклеточный раствор. Гибернации, Эймса МеняDIUM или физиологических растворов рекомендуется.
  3. [Необязательный шаг, если засыпка РГК Fluo-4 требуется]. Выполните Fluo-4 маркировку, как описано в шагах 2,3-2,4.
  4. Использование рассекает микроскопом (интенсивность света: 1,6 х 10 8 фотон / мм 2 ⋅sec), удалить роговицу, отрезав переднюю часть глазного яблока. Снимите объектив и стекловидного тела от внутренней поверхности сетчатки щипцами. Для удаления стекловидного тела, стабилизации глазное яблоко, удерживая склеры твердо одной силы р. Аккуратно очистить стекловидного базы к центру сетчатки с другой силы р. Подготовка на данном этапе называется наглазник, который используется для криосрезов. Подробнее о криосрезов можно найти в справочниках 14,15.
  5. Удалить сетчатку от наглазник. Тогда, сделать четыре порезы, чтобы сетчатка чтобы заложить квартиру. Аккуратно установите сетчатку на предметное стекло микроскопа с фоторецепторов слоя вверх. Добавьте одну каплю раствора к сетчатке и поставить сеllulose фильтровальная бумага на сетчатке. После того, как сетчатка прикрепляется к фильтровальной бумаге, разместить на сетчатку обратно в растворе. При необходимости, выровнять сетчатку с помощью щетки или пинцетом.
  6. Поместите wholemounted сетчатки в 4% PFA в течение 10-15 мин для фиксации.
  7. Промыть wholemounted сетчатки три раза в течение 30 мин в 0,1 М фосфатном буфере (PB), рН 7,4. Блок сетчатки с 5% нормальной козьей сывороткой или осла сыворотке в 0,1 ПБ, содержащем 0,3% Тритон Х-100 и 0,1% NaN 3 при 4 ° С в течение ночи. Мы рекомендуем конечный объем 500 мкл для всех шагов, чтобы сохранить блокирующие решения и антитела.
  8. На следующий день, инкубировать сетчатки wholemounts с первичным антителом 5-7 дней при температуре 4 ° С. Оптимальные разведения должны быть определены пользователем.
  9. Промыть сетчатке 3 х 30 мин в 0,1 М PB и инкубируют в течение ночи при 4 ° С в соответствующем флуорофора, конъюгированным вторичным антителом, которое направлено против видов первичного антитела (концентрация 1: 1000).
  10. После трех финальных моет 30 мин каждая с ПБ, крепление сетчатку в монтаже среду. Печать покровные с лаком для ногтей для длительного хранения. Магазин образцы при температуре 4 ° С и защиты от света.

2 Маркировка ганглиозных клеток и аксонов в Rat Wholemount сетчатки с кальцием индикаторный краситель

  1. Подготовьте 1000 мл млекопитающих Рингера, содержащий (в мМ) NaCl, 125 3 KCl, 2 CaCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, и 10 глюкозу барботируют 95% O 2/5% CO ­ 2.
  2. Выполните рассечение, как описано в шагах 1,2-1,4.
  3. Чтобы загрузить ганглиозных клеток сетчатки (РГК) и их аксоны с индикаторным красителем кальция, вводят 0,5 мкл Fluo-4 pentapotassium соли (40 мм складе в H 2 O) в зрительного нерва пень примерно 1 мм кзади от глазного яблока с помощью шприца . Для измерения динамических увеличение ганглиозных клеток [Са 2 + я индикатор с высоким сродством, например, Fluo-4 с его Уб 345 нМ, является оптимальным. Fluo-4 предлагает дополнительное преимущество, имеющих очень высокую квантовую эффективность, выражающееся в увеличении эмиссии> 100 раз при связывании с кальцием.
  4. Поместите окуляр в Рингера млекопитающих в пропускают с 95% O 2/5% CO ­ 2 в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.

Изображений Протокол 3 Кальций для ганглиозных клеток сетчатки и аксонов.

  1. Снимите глаз, хрусталик и стекловидное как описано в шагах 1.1-1.4. Изолировать сетчатку от наглазник и разделить на сектора. Гора сторона один квадрант ганглиозных клеток на предметное стекло и использовать арфа ломтик сетку стабилизировать его. Держите другие части адаптируются к темноте в Рингера млекопитающих в пропускают с 95% O 2/5% CO ­ 2 на льду для последующего использования.
  2. Superfuse на записи камеры с раствором Рингера млекопитающих идержать решение барботируемого непрерывно с 95% O 2/5% CO 2.
  3. Изображение ткани под микроскопом. Проведение экспериментов при комнатной температуре (~ 23 ° C) или достижения физиологических температурах при нагревании этап, нагрев на водяной бане при применении образца или теплого воздуха к поверхности образца.
    Примечание: Важно отметить, что многие клеточные функции регулируются температуры, которая играет ключевую роль в поддержании внутриклеточного гомеостаза 16. Тем не менее, введение мер потепления может увеличить скорость фотообесцвечиванию, испарение среднесрочной и фокус дрейфа, вызванного тепловым расширением 17. Использование комнатной температуре уменьшается внутриклеточный обособления Fluo-4 18.
  4. Выполнение контроль двух парных высоких K + импульсов в отсутствии лекарств. Деполяризовать РГК и РГК аксоны, поднимая [K +] о от 3 ​​мм до 60 мм для 33 сек во время каждого импульса, чтобы активироватьVGCCs с восьми каналов тяжести системы приводом суперфузии. Уменьшите Na + по 57 мм для поддержания isosmolarity в повышенной решения K +.
  5. Оценку вклада различных VGCCs к сигналу кальция с использованием общих или конкретных антагонистов кальция. Например, снижение сигнала кальция после введения неспецифического блокатора кальциевых каналов, кобальта, при условии, полу-количественная мера вклада VGCCs к высокой K + -evoked сигнала кальция.
  6. Приобретать значения интенсивности флуоресценции, помещая область интереса (ROI) вокруг РГК интереса (Рис 2).
  7. Нормализация изменение интенсивности флуоресценции, полученного во втором высокой K + пика к изменению производимого первой высокой K + пика. Затем, для тестирования конкретных блокаторы кальциевых каналов, препараты применяются только во второй высоким К + импульса пары и нормализовать этот пик противпервый пиковое значение. Для измерения влияют препарата на высокой K + пика, разделить амплитуду второго K + пика на том, что из первых. Анализ должен быть выполнен на следующих значений в отношении их контроля соответствия, полученных из парных высокой K + пиков, измеренных при отсутствии препарата.
  8. Получение изображений на 5-секундными интервалами. Чтобы избежать фото-отбеливание, держать лазерного возбуждения как можно ниже. Обеспечить возбуждение 488 нм линии аргонового лазера, в то время как ФЭУ собирает флуоресцентного свечения через ФНЧ 505 нм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Иммунноокрашивания со специфическими антителами предоставляет платформу для изучения локализации конкретных белков, представляющих интерес в сетчатке и метод визуализации кальция позволяет изучать вклада VGCCs в динамике кальция в ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов.

Используя антитела против белка ганглиозных клеток RBPMS (РНК-связывающий белок с множественной сплайсинга), которые избирательно маркирует РГК 19, мы смогли показать, что Fluo-4 маркировка ограничивается ганглиозных клеток (рисунок 1). Пень-инъекции не приводит к маркировке всех ганглиозных клеток как можно было бы ожидать от этой техники.

Кроличьи поликлональные антитела против генерируется N-концу полипептида RBPMS (RBPMS 4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, коммерческим поставщиком (Таблица 1). RBPMS высоко консервативен среди млекопитающих и используется полипептидная последовательность для иммунизации идентична мыши, крысы, обезьяны и человека (NCBI белка банка, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). Кролик сыворотку собирали после иммунизации и аффинно-очищенные с помощью аффинной колонки полипептид RBPMS. Аффинной очистке антител было показано, immunostain ганглиозных клеток в мыши и крысы сетчатки. Для оценки специфичности иммунной окраски RBPMS, контроль предварительной абсорбции проводили с антителами кролика. Если коротко, то это антитело RBPMS разводили в 0,1 М PB, содержащем 0,5% Тритон Х-100 и смешивают с полипептидом RBPMS в конечной концентрации 1 мкг / мл в течение 2 ч при комнатной температуре. Нет RBPMS иммуноокрашивание не присутствовал в срезах тканей инкубировали с предварительно адсорбированный кролика антител к RBPMS и обработанных стандартных иммуногистохимических методов.

s.jpg "ширина =" 600 "/>
Рисунок 1: Сообщение Временной иммуноокрашивание с антителами против RGC белковых RBPMS (красных), чтобы показать Fluo-4 (зеленый) локализацию в ганглиозных клеток был использован Alexa 568 козы против кролика вторичные антитела.. Шкала бар: 20 мм.

Методы визуализации кальция используются для изучения вклада VGCCs к сигналу кальция в РГК и их аксонов. Значения интенсивности флуоресценции были приобретены путем размещения трансформирования на РГК интересов (рисунок 2).

Рисунок 2
Рисунок 2: Для того чтобы получить значения интенсивности флуоресценции, трансформирования были размещены на ганглиозных клеток somata и / или аксонов Масштаб штрих:. 50 мм.

Fluo-4 pentapotassium соль используется для обозначения РГК и их аксоны (рисунок 3).


Рисунок 3: VGCC подтипы, которые способствуют кальциевой сигнализации в ганглиозных клеток somata и их аксонов. () Конфокальной образ Wholemount сетчатки на базовых уровнях. РГК и RGC аксоны можно увидеть помечены Fluo-4. (B) Флуоресцентные сигналы от одного РГК somata демонстрируя увеличение средней интенсивности флуоресценции, вызванной парных импульсов высокой K + (60 мМ) раствор, омывающий и последующего сокращения флуоресценции в присутствии кобальта во втором импульсе. Шкала бар для А: 20 мм.

Система Zeiss LM5 Паскаль был создан для захвата изображений с частотой кадров 5 сек, и каждый полный просмотр кадров взял 1,57 сек в настройках, используемых. Площадь коллекция 318 мкм х 318 мкм был включен в отсканированном области 512 х 512 пиxels давая площадью 0,385 мкм 2 на пиксель. Эти параметры могут быть изменены в зависимости от требуемого разрешения. Система использует мВт аргонового лазера 25 для возбуждения 488 нм. Мы использовали эту линию в 3% мощности. Насыщенность было сведено к минимуму, выбрав сначала наименьшую концентрацию индикатора кальция красителя, который привел к надежные ответов на деполяризующим стимула, а затем за счет снижения выходное усиление. Снижение мощности лазера позволило избежать обесцвечивания. Концентрация индикатор не измерялась. Калибровка не-радиометрического изображения можно с использованием ионофоров кальция, но техника засыпка может работать с логометрических красителей, а также. Для определения оптимальной концентрации индикатора, мы сравнили изменение деполяризации-вызвали флуоресценции с культи впрыском концентраций Fluo-4 от 1-40 мМ. Круглые и овальные трансформирования были привлечены около РГК и их аксонов, соответственно, что выставлены стабильной интенсивности флуоресценции. РГК и аксоны, которые дрейфовали изсосредоточить внимание в связи с движением, вызванного суперфузии не были выбраны.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы описали два различных методов: 1) Иммуногистохимия чтобы показать Fluo-4 локализацию к ганглиозных клеток в сетчатке глаза wholemounts, и 2) визуализации кальция для анализа динамики кальция в ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов.

Иммуногистохимия помощью wholemounts был использован, чтобы показать локализацию белков в грызуна сетчатки 20-23. Тем не менее, есть несколько ограничений. Качество окрашивания во многом зависит от способности антител распознавать свой соответствующий антиген и его способностью проникать в ткани сетчатки в определенном слое интереса. Эти проблемы могут быть улучшены за счет увеличения инкубационный период в первичных антител вплоть до семи дней, увеличение концентрации Тритона-X и / или инкубации сетчатки без фильтровальной бумаги, чтобы позволить диффузию антитела через слое ганглиозных клеток и фоторецепторы. Еще одним ограничением является durati, и концентрация фиксации. Некоторые антитела работают лучше, когда ткань фиксируется в течение одного часа, в то время как другие антитела требуют более короткий период фиксации. Точно так же, в то время как некоторые антитела работают лучше всего в 4% PFA фиксации, другие работают лучше при пониженных концентрациях. Мы рекомендуем, чтобы пользователь определить оптимальную продолжительность и концентрацию фиксации, продолжительность инкубации концентрации Тритона-X, а также концентрацию первичных антител для получения оптимальных результатов.

Визуализации кальция был использован для изучения динамики кальция в ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов. Суперфузии блокирующих VGCC агентов позволило оценку относительной блокирующего эффективности лекарств и наличия различных каналов подтипов Ca. В том случае, РСК и аксоны не реагировать на высокой K +, можно уменьшить концентрацию индикатора кальция красителя, так как высокие концентрации могут привести к насыщению. Неполное удаление стекловидного теламожет также выступать в качестве барьера, предотвращая высокое K + от достижения РГК и их аксоны. Кроме того, неспособность правильно установить на арфе в верхней части сетчатки могут вызвать движение, в результате чего неспособности приобрести значений интенсивности флуоресценции. Если сетчатка продолжает двигаться, осторожно снимите на арфе, высушите область, окружающая сетчатку и перемонтировать на арфе, добавив больше смазку на его периметру. Полное удаление стекловидного тела и минимальным движением сетчатки Wholemount имеет решающее значение для успеха эксперимента.

Агонисты кальция проницаемый глутаматных рецепторов, выраженных РСК, такие как N-метил-D-аспартата (NMDA), 24,25 α-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионовой кислоты (АМРА) рецепторов и каинат-типа ионотропные глутамата рецепторы 26-29, может быть использован, чтобы вызвать прямое вход кальция, а также обеспечить деполяризующее стимул, который активирует VGCCs. Использование таких агонистов может привести к не-равномерным ответ в связи с дифференциальной экспрессии глутаматных рецепторов подтипов в различных типах РГК. Двухфотонного микроскопа также может быть использован, чтобы исследовать сигналы кальция светло-вызывали в РСК 30 и их дендритов 31.

Селективный маркировки РГК был достигнут за счет мембранных impermeant свойств pentapotassium соли индикатора кальция красителя Fluo-4. Декстран-конъюгированные красители индикатор кальция также были использованы для селективного маркировать РГК и их аксонов через intraretinal инъекций в кролика и крысы 32 33. В обоих исследований, селективный маркировка РСК и их аксонов была достигнута с помощью intraretinal инъекций декстран-конъюгированные индикатора кальция красителя, после чего 2 ч инкубации в кролика 32 или 7 ч инкубации в 33 крыс. Несмотря обеспечение достаточного инкубационный период для обеспечения равномерного маркировку в сетчатке, такие методы приводят к повышенной маркировки РГК и ихаксоны ближайшие месте инъекции по сравнению с редкой маркировки в регионах дистальных на месте инъекции. Как уже говорилось в Болдриджа (1996), неравномерная маркировки в месте инъекции была приписана диффузионного маркировки сомы в результате поглощения красителя в открытой (вырезания) дендритов, в то время как маркировка в дистальных отделах, скорее всего, в связи с ретроградного транспорта от поглощения красителя при открытой аксона 32. Наша методика обеспечивает улучшенные методы увеличения равномерное маркировки РГК и их аксонов и для сведения к минимуму требуемое инкубационный период.

Настоящий способ загрузки красителя обеспечивает альтернативную стратегию к обычным методам, таким как массовой загрузки и электропорации, которые приводят к неспецифической нагрузки перемещенных амакринных клеток в слое ганглиозных клеток. При наличии трансгенных линий мышей, выражающих tdTomato или EGFP под контролем промоутеров, которые в конкретных группах населения ганглиозных клеток 34-38, будущие ApplicatiДополнения этой техники может включать визуализации кальция исследования конкретных сетчатки подтипов ганглиозных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют раскрытия.

Acknowledgments

Мы благодарим д-р С. Стелла и Хелен Vuong за вклад в протоколе изображений кальция. Мы благодарим д-р К. листы для съемок интервью сцены. Мы благодарим доктора Арлин Хирано за ее замечания по рукописи. Этот проект исследования и разработки было проведено авторами на Дэвида Geffen Школа медицины при Калифорнийском университете и стало возможным благодаря договору подряда, который был удостоен и ведении армии США медицинских исследований и Команда матчасти (USAMRMC) и Телемедицина и Advanced Technology Научно-исследовательский центр (TATRC), в Форт Детрике, MD под номер контракта: W81XWH-10-2-0077. Поддержка этих исследований также пришел из NIH EY04067 и заслуги Review В.А. (NB). НКО является В.А. Карьера научный.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight scissors WPI 14124-G dissecting tools
Straight Forceps WPI 501985 dissecting tools
curved iris scissors WPI 504487 dissecting tools
Cellulose filter paper Millipore HABP04700
Hibernate A Invitrogen A12475-01 Media
Vectashield Vector H-1000 Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium Invitrogen F-14200
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 anesthesia
Microscope slide Fisher Scientific 22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular Probes A-11034 Secondary antibody
RBPMS ProSci, Poway, CA A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
  2. Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
  3. Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
  4. Berridge, M. J., et al. Calcium--a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
  5. Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
  6. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  7. Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
  8. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  9. Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
  10. Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
  11. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
  12. Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
  13. Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
  14. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
  15. Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
  16. Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
  17. Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
  18. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
  19. Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
  20. Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
  21. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
  22. Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
  23. Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
  24. Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
  25. Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
  26. Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
  27. Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
  28. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  29. Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
  30. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
  31. Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
  32. Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
  33. Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
  34. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
  35. Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
  36. Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
  37. Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
  38. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).

Tags

Neuroscience выпуск 92 иммуногистохимии антитела фтор-4 изображений кальция ганглиозные клетки сетчатка крыса
Иммуногистохимические и кальция способы визуализации в Wholemount сетчатке крыс
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N.… More

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Pérez De Sevilla Müller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J. Vis. Exp. (92), e51396, doi:10.3791/51396 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter