Summary
면역 프로토콜은 망막에있는 특정 단백질의 현지화를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 연구하기 위해 사용된다.
Abstract
본 논문에서 우리는 도구, 시약 및에 필요한 실제적인 단계를 설명 : 면역 조직 화학 염색에 대한 wholemount 망막의 1) 성공적인 준비를하고, 망막에서 칼슘 신호 전달을 매개 전압 게이트 칼슘 채널 (VGCC)의 연구를위한 2) 칼슘 이미징 신경절 세포. 칼슘 촬상 방법 우리 신경절 세포 층에서의 변위 무 축삭 세포의 비특이적 로딩 우회 관한 문제를 설명한다.
Introduction
현재 1,2 채널 Ca는 전체 셀의 이들 성분의 약리 봉쇄를 통해 결정된 바와 같이 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포는) L-, N-, P / Q- 및 T 형 VGCC 표현. VGCC 송신기 자료, 유전자 전사, 세포 조절과 시냅스 가소성의 3,4,5에 참여하는 횡단 다중 체 단백질이다. 한 기공 채널의 생물 물리학 적 및 약리학 적 특성, 주로 세포 외 보조 α이 δ 소단위와 세포 내 β 서브 유닛을 설정 서브 유닛을 형성 α 대형, 횡단 : 기능 VGCCs은 서브 유닛 중 적어도 세 가지 클래스로 구성되어 있습니다. 다른 한 α 소단위와 후자의 두 형태 heteromeric 복합체와 세포막 6 채널의 게이팅 동력학 및 매매를 변경.
최근 수십 년 동안 많은 기술은 단백질 expre을 연구하기 위해 사용되었다이러한 면역 조직 화학, 효소 면역 분석법, 서부 분석 및 유동 세포 계측법 등 ssion. 이러한 기술은 주어진 관심 단백질의 검출을 위해 특정 항체의 사용을 필요로하고 다른 조직에서 지역화 특정 단백질의 분포를위한 강력한 도구를 제공한다. 항체가 용이하지 않을 때 예컨대 노던 블롯 분석과 같은 특정 단백질의 mRNA 발현 수준을 검출하고 정량화하기 위해 사용되는 기술은, RT-PCR은 실시간 정량 RT-PCR은, 동일계 하이브리드 화에서의 cDNA 마이크로 어레이 및 리보 뉴 클레아 제 보호 어 세이는 대안적인 접근법을 제공한다 특정 단백질을 사용할 경우 또는 발현 수준 7 낮다. 그러나, 이러한 분자 기술의 사용에 대한 제한은 하나의 유전자 서열의 신분증이다.
망막에서 단백질을 지역화하기 위해 면역 조직 화학 염색은 wholemount 망막 수행 할 수 있습니다. 망막 신경절 세포의 접근성, wholemount 인해준비는 RGC의 세포체와 축색 돌기 특정 단백질의 현지화를 연구 할 수있는 훌륭한 플랫폼을 제공합니다.
현지화 외에도, 망막 신경절 세포에서 VGCCs 일부 기능적 특성은 칼슘 이미징 기술의 사용을 통해 입증 될 수있다. 우리는 선택적으로 세포 내 칼슘의 동력학을 측정하는 칼슘 지시 염료와 망막 신경절 세포에 레이블 칼슘 촬상 프로토콜을 설명한다. 다른 세포 구획에서 칼슘 신호에 다른 VGCCs의 기여도는 특정 서브 타입 칼슘 채널 차단제를 이용하여 분리 할 수있다.
아마도 여기서 설명 칼슘 이미징 기술의 가장 이로운 측면 중 하나는 독립적으로 동시에 다수의 망막 신경절 세포 및 그들의 축삭에서 기록하는 기능이다. 이러한 전체 세포 패치 클램프 녹음 등 많은 생리 학적 기술은 높은 시간 해상도 막 전류의 기록, 신체 또는 살전의 축삭 소스를 제공하지만기록 된 전자 전류는 구별 될 수없고 레코딩은 한번에 하나의 신경 세포로부터 제조 될 수있다. 다중 전극 배열 (다자간)는 동시에 여러 셀들로부터 스파이크를 기록 할 수 있지만, 검출되지도의 활성화를 구별, 칼슘 채널의 예를 들면, 상이한 서브 타입 둘 수있다. 우선적으로 대형 스파이크 구를 생성하는 세포에서 주어진 전극 (8) 기록에 가까이에있는 세포에서 기록 MEAS. 광학 이미징 방법은 단일 세포 미세 전극 및 패치 클램프 기록 MEA 기록에 의한 정보로 통합 될 수있는 세포의 전체 인구의 동시 독립적 녹화 가능하도록 대체 전략을 제공한다. 여기에 설명 된 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포의 칼슘 동역학을 연구하기 위해 사용되었지만, 패치 클램프 및 다자간 또한 상기 이온 전류 및 망막 신경절 세포의 특성을 규명 급상승 병렬로 사용될 수있다.
이와 함께,이 문서에 설명 된 구조와 생리 학적 기술은 망막 신경절 세포와 축색 돌기의 현지화 및 칼슘 신호에 VGCCs의 기여를 공부하는 플랫폼을 제공합니다.
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Protocol
모든 실험은 인간의 실험실 동물의 관리 및 사용 및 캘리포니아 로스 앤젤레스 대학 (UCLA) 동물 연구위원회에 미국 공중 보건 서비스 정책에 의해 발행 된 실험 동물의 복지에 대한 지침에 따라 수행 하였다. 남성과 여성 성인 흰쥐 3-5주 세 사이 (찰스 리버 연구소, 윌 밍턴, MA)를 사용 하였다.
Wholemount 망막 및 면역 프로토콜에 대한 1 동물 및 조직 준비
- 해부 현미경, 아주 좋은 팁, 가위, 셀룰로오스 필터 종이, 플라스틱 피펫과 현미경 슬라이드와 두 집게 다음 재료 및 도구를 준비합니다.
- 깊이 단두대로 잘린 다음 1-3% 이소 플루 란 (isoflurane)와 동물을 마취에 의해 밀폐 된 챔버에 쥐를 안락사. 세포 외 용액을 포함하는 페트리 접시에 홍채 가위와 장소 한 쌍의 눈을 제거합니다. A, 에임스 나 최대 절전 모드dium 또는 생리 학적 솔루션을 권장합니다.
- [선택 단계 FLUO-4와 망막 신경절 세포의 채움이 필요한 경우]. 단계 2.3-2.4에 설명 된대로 FLUO-4 라벨을 수행합니다.
- 해부 현미경 (광량 : 1.6 x 10 8 포톤 / mm 2 ⋅sec)를 사용하여, 안구의 전면을 차단하여 각막을 제거한다. 집게 안쪽 망막 표면에서 렌즈와 유리체를 제거합니다. 유리체를 제거하려면 한 forcep으로 꽉 공막을 잡고 안구를 안정. 조심스럽게 다른 forcep와 망막의 중앙으로 유리체 기반을 벗겨. 이 단계에서 준비 저온부에 사용되는 아이 컵, 불린다. 저온부에 대한 자세한 내용은 참고 문헌 (14, 15)에서 찾을 수 있습니다.
- 아이 컵에서 망막을 제거합니다. 그런 다음, 네 상처는 망막 눕혀 할 수 있도록 할 수 있습니다. 조심스럽게 광 수용체 층 위로 현미경 슬라이드에 망막을 탑재합니다. 망막에 용액을 한 방울을 추가하고 CE 마크를 넣어망막에 llulose 필터 종이. 망막 여과지에 부착되면, 다시 용액 망막 배치. 필요한 경우, 브러시 또는 집게로 망막을 평평.
- 고정 10 ~ 15 분 동안 4 % PFA에 wholemounted 망막을 놓습니다.
- 0.1 M 인산염 완충액 (PB), pH가 7.4에서 30 분 동안 wholemounted 망막을 세 번 씻으십시오. 밤새 4 ° C에서 0.3 % 트리톤 X-100, 0.1 % NaN의 3을 포함하는 0.1 PB 5 % 정상 염소 혈청 또는 당나귀 혈청 망막을 차단합니다. 우리는 차단 솔루션과 항체를 저장하기위한 모든 단계 500 μL의 최종 볼륨을 권장합니다.
- 다음 날, 4 ° C에서 차 항체 5-7일와 망막의 wholemounts을 배양한다. 최적의 희석은 사용자에 의해 결정되어야한다.
- PB 0.1 M에서 망막 3 × 30 분 씻고 차 항체 (농도 1 : 1000)의 종류에 대하여 지시 된 해당 형광 접합 된 이차 항체에 4 ° C에서 하룻밤 배양한다.
- PB 30 분 각각의 세 최종 세척 후, 중간 장착의 망막을 탑재합니다. 장기간 보관을위한 매니큐어와 커버 슬립을 봉쇄. 저장 샘플 4 ° C에서와 빛으로부터 보호합니다.
칼슘 표시기 염료와 쥐 Wholemount 망막의 신경절 세포와 축삭의 2 라벨링
- 95 %, O2 / 5 % CO 버블 포유 동물 링거 포함 125 염화나트륨, 3의 KCl, 2 염화칼슘, 1.25의 NaH 2 PO 4, 1 MgCl2를, 25 탄산 수소 나트륨 (mm 단위)의 1,000 ml의 10 포도당을 준비 2.
- 단계 1.2-1.4에 설명 된대로 절개를 수행합니다.
- 주사기를 사용하여 안구에 약 1mm 후방 시신경 그루터기에 FLUO-4 pentapotassium 염 (H 2 O에서 40 밀리미터 주)의 0.5 μl를, 칼슘 지시 염료와 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)와 축색 돌기를로드 삽입하려면 . [CA에 신경절 세포의 동적 인 상승을 측정하기 2+ 나는 그런 FLUO-4 345 nm의의의 K의 D와 높은 친 화성을 가진 지표는 최적입니다. FLUO-4에 결합 할 때 칼슘> 100 배의 방출 증가의 결과로 매우 높은 양자 효율을 갖는 추가적인 이점을 제공한다.
- 포유 동물 링어의 95 % O 버블 2 / 5 % CO에 아이 컵을 놓고 이 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안.
망막 신경절 세포와 축삭을위한 3 칼슘 이미징 프로토콜.
- 단계 1.1 ~ 1.4에 설명 된대로 눈, 렌즈와 유리체를 제거합니다. 아이 컵에서 망막을 분리하고 사분면으로 나눕니다. 마운트 사분면의 신경절 세포의 유리 슬라이드에면을 위로하고 안정 하프 슬라이스 그리드를 사용합니다. 어두운 적응 다른 조각을 유지 포유 동물 링어의 95 % O 버블 2 / 5 % CO에 나중에 사용하기 위해 얼음에 2.
- 포유류 링거액으로 기록 챔버와 Superfuse95 %, O2 / 5 % CO 2와 함께 지속적으로 버블 링 솔루션을 유지한다.
- 이미지 현미경 조직. 실온 (~ 23 ° C에서) 또는 행동 실험, 무대를 따뜻하게 시편에서 물 목욕을 가열 또는 시료의 표면에 따뜻한 공기를 적용하여 생리 온도를 얻을 수 있습니다.
주 : 많은 세포 기능은 세포 내 항상성 (16)를 유지에 중요한 역할을 온도에 의해 조절된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 그러나 온난화 대책의 도입은, 열팽창 17 의한 중간 포커스 드리프트의 증발을 photobleaching에의 속도를 증가시킬 수있다. 실내 온도의 사용은 FLUO-4 (18)의 세포 내 구획화을 감소시킨다. - 약물의 부재에 두 쌍의 높은 K + 펄스들의 제어를 수행한다. 활성화하기 위해 각 펄스 동안 33 초 60는 3mm O를 [K +]를 높여 망막 신경절 세포와 축삭 RGC을 탈분극여덟 채널 중력 구동 superfusion 시스템 VGCCs. 높은 K + 용액 isosmolarity을 유지하기 위해 57 mm 정도 나 +를 줄입니다.
- 일반 또는 특정 칼슘 채널 차단제의 사용과 칼슘 신호에 다른 VGCCs의 기여를 평가한다. 예를 들어, 비 특정 칼슘 채널 차단제, 코발트 투여 칼슘 신호의 감소는, 높은 K + -evoked 칼슘 신호 VGCCs의 기여의 반 정량적 측정 값을 제공 하였다.
- (도 2) 관심 망막 신경절 세포 주변의 관심 (ROI)의 영역을 배치하여 형광 강도 값을 획득.
- 제 높은 K + 피크에 의해 생성 된 변화에 제 높은 K + 피크에 의해 생성 된 형광 강도의 변화를 정규화한다. 이어서, 특정 칼슘 채널 차단제의 테스트를 위해, 단지 한 쌍의 제 높은 K + 펄스 동안 약물을 적용하고이 피크에 대해 정상화제 1 피크 값. 이 높은 K + 피크에 약물의 영향을 측정하기 위해 제의 의하여 제 K + 피크의 진폭을 나눈다. 분석은 약물의 부재하에 측정 한 쌍의 높은 K + 피크로부터 유도 그들의 정합 제어에 대하여 이러한 값을 수행하여야한다.
- 5 초 간격으로 이미지를 획득. 광 탈색을 방지하기 위해 가능한 한 낮은 레이저 구동을 유지한다. 광전자 증 배관은 505 나노 LP 필터로 형광 방출을 수집하면서, 아르곤 레이저의 488 nm의 라인으로 음원을 제공한다.
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Representative Results
특정 항체를 Immunolabeling은 망막과 칼슘 이미징 기술에 대한 관심의 특정 단백질의 현지화를 연구하는 플랫폼을 제공하는 망막 신경절 세포 축색 돌기의 칼슘 역학 VGCCs의 기여에 대한 연구를 허용합니다.
신경절 세포 단백질 RBPMS에 대해 선택적으로 망막 신경절 세포 (19) 레이블 (다중 접합와 RNA 결합 단백질)을 항체를 사용하여, 우리는 FLUO-4 라벨은 신경절 세포 (그림 1)로 제한되어 있음을 보여줄 수 있었다. 루터 주입이 기술에서 예상 할 수있는 모든 신경절 세포의 라벨로 이어질하지 않습니다.
토끼 폴리 클로 날 항체는 상업적 공급 업체 (표 1)에 의해, RBPMS 폴리펩티드 (RBPMS 4-24) GGKAEKENTPSEANLQEEEVR의 N-말단에 대해 생성 하였다. RBPMS 높은 포유 동물 중에서 보존되고 폴리펩티드 서열이 사용 예방 접종에 대한 마우스, 쥐, 원숭이와 인간 (NCBI 단백질 은행, 동일하다 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). 토끼의 혈청은 RBPMS 폴리 펩타이드 친 화성 컬럼을 사용하여 정제 예방 접종과 친 화성이 다음 수집 하였다. 친 화성 정제 된 항체는 마우스와 쥐의 망막 신경절 세포를 발현 사이 나타났다. RBPMS 면역 염색의 특이성을 평가하기 위해, preabsorption 제어 토끼 항체로 실시 하였다. 간단히, RBPMS 항체 RT에서 2 시간 동안 1 μg / ML의 최종 농도에서 RBPMS 폴리펩티드와 0.5 % 트리톤 X-100을 함유하는 혼합 된 0.1 M의 PB로 희석 하였다. 아니 RBPMS 면역 염색은 RBPMS 표준 면역 조직 화학 기술에 의해 처리 할 수있는 미리 흡수 토끼 항체와 함께 배양 조직 섹션에 존재하지 않았다.
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그림 1 : RGC 단백질 RBPMS (빨간색)에 대한 항체와 사후 면역 염색은 신경절 세포에 FLUO-4 (녹색) 지역화를 보여 알렉사 568 염소 항 - 토끼 차 항체를 사용 하였다.. 스케일 바 : 20mm.
칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포의 축삭과 그들의 칼슘 VGCCs 신호의 기여도를 연구하는 데 사용된다. 형광 강도 값은 관심있는 망막 신경절 세포 (그림 2)에 ROI를 배치하여 획득 하였다.
그림 2 :. 50mm : 형광 강도 값을 획득하기 위해, 로아가 신경절 세포의 세포체 및 / 또는 축삭 스케일 표시 줄에 배치했다.
FLUO-4 pentapotassium 염은 망막 신경절 세포와 축색 돌기 (그림 3) 라벨을 사용 하였다.
그림 3 : 신경절 세포의 세포체와 축색 돌기에서 칼슘 신호에 기여 VGCC 아형. (A)베이스 라인 수준에서 wholemount 망막의 공 초점 이미지. 망막 신경절 세포 및 RGC 축삭은 FLUO-4로 표지 알 수있다. (B)이 높은 K의 페어링 펄스 + (60 mM)을 입욕 용액 및 후속 환원에 의해 유도 된 평균 형광 강도의 증가를 보여주는 단일 RGC의 세포체로부터 형광 신호 초 펄스 동안에 코발트의 존재 하에서 형광. 에 대한 스케일 바 : 20mm.
자이스 LM5 파스칼 시스템은 5 초의 프레임 레이트로 이미지를 포착하도록 설정하고 각 풀 프레임 주사가 사용 설정에서 1.57 초 걸렸다. 318 μm의 X 318 μm의 컬렉션 영역은 512 X 512 파이의 스캔 영역에 포함되었다픽셀 당 0.385 μM 2의 면적을주는 xels. 이러한 설정은 원하는 해상도에 따라 변화 될 수있다. 시스템은 488 nm의 여기를위한 25 mW의 아르곤 레이저를 사용한다. 우리는 3 % 전력에서이 라인을 사용했다. 채도가 제 탈분극 자극에 강력한 반응을 수득 한 다음, 출력 이득을 감소시킴으로써 칼슘 지시 염료의 최저 농도를 선택함으로써 최소화 하였다. 레이저 파워의 감소는 표백을 방지하는 데 도움이. 표시 농도는 측정되지 않았다. 비 비율 적 이미징 보정 칼슘 ionophores의 사용으로 가능하지만 백필 기법뿐만 아니라 염료 비율 적으로 작동 할 수 있습니다. 최적의 표시 농도를 결정하기 위해, 우리는 1-40 밀리미터에 이르기까지 FLUO-4의 그루터기 주입 농도와 형광의 탈분극 - 유발 변화를 비교 하였다. 원형 및 타원형 ROI를 안정 형광 강도를 나타내 각각 망막 신경절 세포와 축색 돌기 주위에 그려진. 망막 신경절 세포와 축삭에서 표류때문에 superfusion에 의한 움직임에 초점이 선택되지 않았습니다.
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Discussion
1) 면역 조직 화학 망막 wholemounts의 신경절 세포에 FLUO-4 현지화를 보여, 2) 칼슘 이미징 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 분석하기 위해이 문서에서 우리는 두 가지 기술을 설명했다.
wholemounts을 사용하여 면역 조직 화학 20-23 망막 설치류에서 단백질의 현지화를 나타 내기 위해 사용되었다. 그러나, 몇 가지 제한이있다. 염색의 품질은 그 각각의 항원과 관심 특정 층에 망막 조직에 침투하는 능력을 인식하는 항체의 능력에 크게 의존한다. 이러한 문제는 신경절 세포 층을 통해 항체의 확산을 허용하도록 여과지없이, 최대 7 일까지 차 항체의 잠복기를 증가 트리톤-X의 농도를 증가 및 / 또는 망막을 배양함으로써 개선 될 수 있고, 광 수용체. 또 다른 제한은 durati입니다에와 고정의 농도. 조직이 한 시간 동안 고정 될 때 다른 항체가 짧은 고정 기간을 필요로하지만 어떤 항체는 더 나은 작동합니다. 특정 항체가 4 % PFA 고정에 최선을 작업하는 동안 마찬가지로, 다른 사람은 감소 된 농도에서 더 잘 작동합니다. 우리는 사용자가 최적의 재생 시간과의 고정 농도, 인큐베이션 시간, 트리톤-X의 농도뿐만 아니라, 최적의 결과를위한 일차 항체의 농도를 결정하는 것을 추천한다.
칼슘 이미징은 망막 신경절 세포의 축색 돌기 칼슘 동역학을 연구하기 위해 사용되었다. VGCC 차단제의 Superfusion는 약물의 상대적 차단 효과와 다른 칼슘 채널 아형의 존재의 평가를 허용했다. 망막 신경절 세포 축삭과 높은 K +에 응답하지 않는 경우에는, 높은 농도가 포화 될 수 있고, 칼슘 지시 염료의 농도를 감소하려고. 유리체의 불완전한 제거또한 망막 신경절 세포와 축색 돌기에 도달 높은 K의 +를 방지 장벽으로 작용할 수있다. 또한, 적절하게 망막 위에 하프를 탑재 실패 형광 강도 값을 획득하지 못하는 결과를 초래할 수있는 운동. 망막이 계속 이동하면, 신중 망막 주변 영역을 건조, 하프를 제거하고 그 둘레에 그리스를 더 추가하여 하프 다시 마운트. 망막 wholemount의 유리체 최소한의 운동의 완전한 제거는 실험의 성공에 매우 중요합니다.
예컨대 N-메틸-D-아스파 테이트 (NMDA) 등 망막 신경절 세포에 의해 발현 칼슘 투과성 글루타메이트 수용체 α 24,25 - 아미노 -3 - 하이드 록시 -5 - 메틸 아이 -4 - 프로피온산 (AMPA) 수용체 및 kainate 형 작용제 이온 성 글루타메이트 수용체는 26-29, 칼슘의 직접 입력을 불러 일으킬뿐만 아니라 VGCCs를 활성화 탈분극 자극을 제공하는데 사용될 수있다. 이러한 작용 물질의 이용은 비 발생할 수 있습니다망막 신경절 세포의 다른 유형에 글루타메이트 수용체 아형의 발현 차이에 기인 -uniform 응답. 이광자 현미경은 망막 신경절 세포 (30) 및 그 돌기 (31)의 광 유발 칼슘 신호들을 조사하는 데에 이용 될 수있다.
망막 신경절 세포의 선택적 표지는 FLUO-4 pentapotassium 소금 칼슘 지시 염료의 막 impermeant 특성으로 인해 달성되었다. 덱스 트란 - 복합 칼슘 지표 염료를 선택적으로 토끼 32 쥐 33에서 망막 주사를 통해 망막 신경절 세포와 축삭 자신의 레이블을 사용되어왔다. 두 연구에서 망막 신경절 세포와 축색 돌기의 선택적 표지 토끼 32에서 2 시간 배양 또는 쥐 33에서 7 시간 배양 한 다음에 덱스 트란 - 복합 칼슘 지시 염료의 망막 주사를 통해 달성되었다. 망막에서 균일 한 표시를 위해 적절한 배양 기간을 제공에도 불구하고, 이러한 방법은 망막 신경절 세포의 증가 및 라벨링 될 그들의주사 부위 가까운 축삭 주사 부위에 말단 지역에 비해 부족한 라벨. 볼드리지 (1996), 주사 부위 불균일 라벨링 한 바와 같이 선단 영역에 라벨링 가능성하다가 역행 수송, 노광 (절단) 수지상에서 염료 흡수의 결과로 소마의 diffusional 라벨링에 기인 한 노출 축삭 32에서 염료의 흡수부터. 우리의 기술은 개선 된 방법 망막 신경절 세포와 축색 돌기의 균일 한 라벨을 증가하고 필요한 잠복 기간을 최소화 할 수 있습니다.
본 염료 로딩 방법은 신경절 세포 층에서의 변위 무 축삭 세포의 비특이적 로딩 될 벌크 로딩 및 전기 천공과 같은 종래의 기술에 대한 대안의 전략을 제공한다. 특정 신경절 세포 집단 34-38, 미래 입학 원서에 프로모터의 제어하에 tdTomato 또는 EGFP를 발현하는 형질 전환 마우스 선 가용성이 기술의 기능은 특정 망막 신경절 세포 아형의 칼슘 이미징 연구를 포함 할 수있다.
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Disclosures
저자는 공시가 없습니다.
Acknowledgments
우리는 칼슘 이미징 프로토콜에 기여 박사 S. 스텔라와 헬렌 브엉 감사합니다. 우리는 인터뷰 장면을 촬영 박사 K. 시트 감사합니다. 우리는 원고에 그녀의 의견을 박사 아린 히라노 감사합니다. 이 연구 개발 프로젝트는 원격 진료 및 고급 기술 UCLA에서 의학의 데이비드 게펜 학교에서 저자에 의해 실시 된 미국 육군 의학 연구 및 물자 명령 (USAMRMC)에 의해 수여 및 투여 한 계약의 계약에 의해 가능하게되고, 계약 번호에서 MD 요새 Detrick에서 연구 센터 (TATRC) : W81XWH-10-2-0077. 이러한 연구에 대한 지원은 NIH의 EY04067 및 VA 훈장 검토 (NB)에서왔다. NCB는 VA 경력 연구원이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight scissors | WPI | 14124-G | dissecting tools |
| Straight Forceps | WPI | 501985 | dissecting tools |
| curved iris scissors | WPI | 504487 | dissecting tools |
| Cellulose filter paper | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Mounting Media for Fluorescence |
| Fluo-4 pentapotassium | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | anesthesia |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Pascal microscope | Zeiss | ||
| Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular Probes | A-11034 | Secondary antibody |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA). |
References
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