Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/51396
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4, 1
1Department of Neurobiology, University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences, Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

פרוטוקולי אימונוהיסטוכימיה משמשים ללמוד את הלוקליזציה של חלבון מסוים ברשתית. טכניקות הדמיה סידן מועסקות ללמוד דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

Abstract

במאמר זה אנו מתארים את הכלים, חומרים כימיים, וצעדים המעשיים הדרושים ל: 1) הכנה מוצלחת של רשתית wholemount אימונוהיסטוכימיה ו, 2) הדמיה סידן לחקר תעלות סידן מתח מגודרת (VGCC) בתיווך איתות סידן ברשתית תאי הגנגליון. שיטת ההדמיה סידן אנו מתארים בעיות עוקפים לגבי הטעינה הלא ספציפית של תאי amacrine עקורים בשכבת תא גנגליון.

Introduction

תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) להביע VGCC L-, N-, P / Q- וT-הסוג, כפי שנקבע באמצעות מצור תרופתי של רכיבים של כל התא אלה Ca לתעל 1,2 הנוכחי. VGCC הם חלבוני Multimeric הטרנסממברני כי הם מעורבים בשחרור משדר, שעתוק הגנים, תקנת התא ו3,4,5 פלסטיות הסינפטית. VGCCs פונקציונלי מורכב של לפחות שלוש כיתות שונות של יחידות משנה: גדולות, הטרנסממברני α נקבובית 1 להרכיב יחידות משנה, אשר קובעת את מאפייני biophysical והתרופתיים של הערוץ, α בעיקר תאי עזר 2 δ יחידות משנה ותת יחידות β תאיות. שני מתחמי heteromeric הטופס האחרונים עם תת יחידות 1 α שונים ולשנות את קינטיקה gating וסחר של הערוצים לקרום הפלזמה 6.

בעשורים האחרונים, בטכניקות רבות כבר מועסקות ללמוד expre חלבוןssion, כגון אימונוהיסטוכימיה, assay immunosorbent צמוד אנזים, ניתוח מערבי וcytometry זרימה. טכניקות אלו דורשות השימוש בנוגדנים ספציפיים לזיהוי של חלבון מסוים של ריבית ומספקות כלים רבי עוצמה ללוקליזציה וההפצה של חלבונים ספציפיים ברקמות שונות. טכניקות המשמשות לאיתור וללכמת רמות ביטוי mRNA של חלבון מסוים, כגון ניתוח כתם צפוני, RT-PCR, בזמן אמת RT-PCR, הכלאה באתר, microarrays cDNA וassay הגנת ribonuclease לספק גישה חלופית כאשר נוגדנים אינם בקלות רמות ביטוי זמינות או אם של חלבון מסוים הן נמוכות 7. עם זאת, מגבלה אחת לשימוש בטכניקות מולקולריות כזה הוא זיהוי הנדרש של רצף הגן.

בתרגום חלבונים ברשתית, אימונוהיסטוכימיה יכולה להתבצע על רשתית wholemount. בשל הנגישות של RGCs, wholemountהכנה מספקת פלטפורמה מצוינת ללמוד הלוקליזציה של חלבונים ספציפיים לsomata RGC והאקסונים שלהם.

בנוסף ללוקליזציה שלהם, ניתן להדגים כמה תכונות פונקציונליות של VGCCs בRGCs באמצעות השימוש בטכניקות הדמיה סידן. אנו מתארים פרוטוקול הדמיה סידן לתייג RGCs סלקטיבי עם צבע מחוון סידן למדידת דינמיקת סידן תוך תאי. התרומה של VGCCs שונה לאות סידן בתאים סלולריים שונים יכולה להיות מבודדת עם השימוש בחוסמי תעלות תת ספציפי Ca.

אולי אחד ההיבטים מועילים ביותר של טכניקת ההדמיה סידן שתוארה כאן היא היכולת להקליט בו זמנית ובאופן עצמאי מRGCs מרובה והאקסונים שלהם. למרות שרבי טכניקות פיסיולוגיות, כגון הקלטת מהדק תא כל תיקון, לספק הקלטות גבוהות זמניות רזולוציה של זרמי קרום, סומטי או מקור axonal של thesזרמי דואר נרשמו לא יכולים להיות מופלים ולהקלטות יכולות להתבצע רק מתא עצב בודד בכל פעם. מערכי Multielectrode (MEAs) מסוגלים בו זמנית הקלטת קוצים מהתאים רבים, אבל אינו יכולים לזהות ולא להפלות את ההפעלה של, למשל, תת שונה של תעלות סידן. MEAs מעדיף להקליט מהתאים הנמצאים בסמיכות לאלקטרודה נתנה 8 ושיא מהתאים שיוצרים קוצים גדולים 9. שיטות הדמיה אופטיות לספק אסטרטגיה חלופית כדי לאפשר הקלטות בו זמנית ובלתי תלויות של אוכלוסיות שלמות של תאים שיכולים להיות משולבת עם המידע שהתקבל מmicroelectrode התא ותא והקלטת מהדק תיקון והקלטת MEA. למרות שטכניקות ההדמיה סידן המתוארות כאן הועסקו כדי ללמוד את דינמיקת סידן של RGCs, מהדק התיקון וMEAs יכולים גם לשמש במקביל על מנת להבהיר עוד יותר את הזרמים היוניים ומאפייני spiking של RGCs.

10, המטרה שלנו הייתה להשתמש בטכניקת העמסה שאופן סלקטיבי תוויות RGCs עם צבע מחוון סידן סינטטי ב הכנת wholemount. למרות צבעי מחוון סידן סינטטיים לספק פלטפורמה מצוינת ללימוד דינמיקת סידן תוך תאי, השימוש הנרחב שלה התעכב בשל חוסר היכולת לטעון ביעילות אוכלוסיות ספציפיות של תאי עצב בתוך רשת נתון. רבים טכניקות כגון טעינה בתפזורת 11 ו8,12 electroporation בוצעו לטעון אוכלוסיות שלמות של תאים, לעומת זאת, טכניקות אלה אינן מפלות בין סוגי תאים מסוימים. מבחינה גנטית מקודד מדדי סידן לספק את היכולת לתייג באופן סלקטיבי אוכלוסיות ספציפיות של תאים, לעומת זאת, שיטות אלו דורשות הדור של בעלי חיים מהונדסים 13. הטכניקה שלנו מתארת ​​methoד לתייג RGCs סלקטיבי בהכנת wholemount באמצעות הזרקת גדם עצב ראייה של צבע מחוון סידן.

יחדיו, הטכניקות המבניות ופיזיולוגיות שתוארו במאמר זה מספקות פלטפורמה לחקור את הלוקליזציה ותרומה של VGCCs לאות סידן בRGCs והאקסונים שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות לרווחתם של חיות ניסוי שהונפקו על ידי מדיניות שירות בריאות הציבור בארה"ב על טיפול באדם ושימוש בחי מעבדה ואוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (UCLA) ועדת מחקר בבעלי חיים. חולדות ספראג-Dawley בוגרת זכר ונקבה (נהר המעבדה צ'ארלס, Wilmington, MA) בין גיל 3-5 שבועות היו בשימוש.

.1 בעלי חיים ורקמות הכנה לWholemount רשתית ואימונוהיסטוכימיה פרוטוקול

  1. הכן את החומרים הבאים וכלים: מיקרוסקופ לנתח, 2 מלקחיים עם טיפים יפים מאוד, מספריים, נייר סינון תאית, פיפטה פלסטיק ושקופיות מיקרוסקופ.
  2. להרדים את העכברוש בחדר סגור על ידי עמוק הרדמת בעלי החיים עם isoflurane 1-3% אחריו עריפת ראש עם גיליוטינה. הסר את העיניים עם זוג מספריים איריס ומניחים בצלחת פטרי המכילה פתרון תאי. מצב שינה, איימסdium או פתרונות פיסיולוגיים מומלצים.
  3. [צעד אופציונאלי אם למלא את המשבצות של RGCs עם Fluo-4 היא רצויה]. לבצע את תיוג Fluo-4, כמתואר ב2.3-2.4 צעדים.
  4. באמצעות מיקרוסקופ לנתח (עוצמת אור: 1.6 x 10 8 פוטונים / 2 מ"מ ⋅sec), להסיר את הקרנית על ידי חיתוך החלק הקדמי של העין הכדור. הסר את העדשה וזגוגית מפני שטח הרשתית הפנימי עם מלקחיים. כדי להסיר את הזגוגית, לייצב את גלגל העין על ידי לחיצה על לובן העין בחוזקה עם מלקחיים אחד. לקלף בעדינות את בסיס הזגוגית לכיוון מרכז הרשתית עם המלקחיים האחרים. ההכנה בשלב זה נקראת עיינית, המשמשת לcryosections. ניתן למצוא פרטים נוספים על cryosections באזכור 14,15.
  5. הסר את הרשתית מעיינית. ואז, להפוך את ארבעה חתכים, כדי לאפשר את הרשתית לשכבה. בעדינות לעלות הרשתית בשקופית מיקרוסקופ עם השכבה עד קולטי האור. הוסף טיפה אחת של פתרון לרשתית ולשים ceנייר סינון llulose על הרשתית. ברגע שהרשתית מתחברת לנייר הסינון, למקם את הרשתית חזרה בפתרון. במידת הצורך, לשטח את הרשתית עם מברשת או מלקחיים.
  6. הנח את רשתיות wholemounted לPFA 4% עבור 10-15 דק 'לקיבעון.
  7. שטוף את רשתיות wholemounted שלוש פעמים ל30 דקות ב0.1 M חיץ פוספט (PB), pH 7.4. לחסום את הרשתיות עם 5% עזים בסרום נורמלי או חמור בדם ב0.1 PB מכיל 0.3% Triton-X 100 ו0.1% NaN 3 על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אנו ממליצים נפח סופי של μl 500 לכל הצעדים כדי להציל את הפתרונות ונוגדנים חסימה.
  8. למחרת, דגירה wholemounts רשתיות עם 5-7 ימי הנוגדן הראשוניים ב 4 ° C.. דילולים אופטימליים צריכים להיקבע על ידי המשתמש.
  9. שטוף את רשתיות 3 x 30 דקות בPB 0.1 M ודגירת הלילה בשעה 4 ° C בנוגדן fluorophore מצומדות- המקביל המשני שמופנה נגד המינים של הנוגדן הראשוני (ריכוז 1: 1,000).
  10. לאחר שלוש שטיפות סופיות של 30 דקות כל אחד עם PB, הר הרשתיות בהרכבה בינונית. חותם את coverslips עם לק לאחסון ממושך. דגימות חנות ב 4 ° C ולהגן מפני אור.

.2 תיוג של תאים הגנגליון והאקסונים בעכברוש Wholemount רשתיות עם סידן המחוון דיי

  1. הכן 1,000 מ"ל של Ringer של יונקים המכילים (במ"מ) 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, 1.25 לאא 2 PO 4, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, ו10 גלוקוז מבעבע עם 95% O CO 2/5% ­ 2.
  2. לבצע את הנתיחה, כמתואר ב1.2-1.4 הצעדים.
  3. כדי לטעון תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) והאקסונים שלהם עם צבע מחוון סידן, להזריק 0.5 μl של מלח Fluo-4 pentapotassium (40 מניית מ"מ בH 2 O) לגדם עצב הראייה כ מ"מ אחורי 1 לגלגל העין באמצעות מזרק . כדי למדוד עליות דינמיות בתא גנגליון [Ca 2 + אני מחוון בזיקה גבוהה, כגון Fluo-4 עם ד K של 345 ננומטר, הוא אופטימלי. Fluo-4 מציע יתרון נוסף שיש לו יעילות קוונטית גבוהה מאוד וכתוצאה מכך גידול פליטה של> 100 לקפל כאשר חייב סידן.
  4. הנח את עיינית בCO 2/5% מבעבע עם 95% O רינגר יונקים ­ 2 לשעה 1 בטמפרטורת חדר בחושך.

פרוטוקול הדמיה 3 סידן לתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים.

  1. הסר את העין, העדשה וזגוגית כמתואר בשלבי 1.1-1.4. לבודד את הרשתית מעיינית ומתחלקים לרביעים. צד הר תא גנגליון רבע אחד על שקופית זכוכית ולהשתמש ברשת פרוסת נבל כדי לייצב אותו. שמור את החלקים האחרים כהים מותאמים בCO 2/5% מבעבע עם 95% O רינגר יונקים ­ 2 על קרח לשימוש מאוחר יותר.
  2. Superfuse חדר ההקלטה עם הפתרון של רינגר יונקים ולשמור על הפתרון המבעבע ברציפות עם 95% O 2/5% CO 2.
  3. תמונת הרקמה תחת המיקרוסקופ. ניסויי התנהגות בטמפרטורת חדר (~ 23 מעלות צלזיוס) או להשיג טמפרטורות פיסיולוגיות על ידי התחממות השלב, חימום אמבט המים מתחת לדגימה או החלת אוויר חם אל פני השטח של הדגימה.
    הערה: חשוב לציין כי רבים תפקודים תאיים מוסדרים על ידי טמפרטורה, אשר ממלאת תפקיד מפתח בשמירה על הומאוסטזיס תאיים 16. עם זאת, כניסתה של אמצעי ההתחממות עשויה להגדיל את שיעור photobleaching, אידוי של הסחיפה בינונית ומיקוד הנגרמת על ידי התפשטות תרמית 17. שימוש בטמפרטורת חדר יורד מידור תאיים של Fluo-4 18.
  4. לבצע שליטה של שתי K + פולסים גבוהים לזווג בהעדר תרופות. Depolarize האקסונים RGCs וRGC ידי העלאה [K +] o מ3 מ"מ ל60 מ"מ ל33 שניות במהלך כל דופק כדי להפעילVGCCs עם מערכת superfusion מונעת שמונה הכבידה ערוץ. להפחית Na + על ידי 57 מ"מ לשמור isosmolarity בפתרון K + הגבוה.
  5. להעריך את התרומה של VGCCs שונה לאות סידן עם השימוש בחוסמי תעלות Ca כלליות או ספציפיים. לדוגמא, הירידה באות סידן הבא הממשל של קובלט חוסם תעלות הסיד שאינו ספציפי, ובלבד מידה חצי כמותית של התרומה של VGCCs לגבוה K אות סידן -evoked +.
  6. לרכוש ערכי עוצמת הקרינה על ידי הצבת אזור של עניין (ROI) ברחבי RGCs של עניין (איור 2).
  7. לנרמל את השינוי בעוצמת הקרינה המיוצרת על ידי הגבוה K השני + שיא לשינוי המיוצר על ידי הגבוהה K + השיא הראשון. ואז, לבדיקה של חוסמי תעלות סידן ספציפיים, תחול תרופות רק בדופק K + הגבוה השני של זוג ולנרמל את השיא הזה נגדערך השיא הראשון. כדי למדוד את ההשפעה של התרופה על הגבוהה K + השיא, לחלק את המשרעת של K + השיא השני על ידי זה של הראשונה. ניתוח צריכה להתבצע על ערכים אלה בביחס לבקרות ההתאמה שלהם נגזרות מגבוה K לזווג + פסגות נמדדו בהעדר התרופה.
  8. לרכוש תמונות ב5 מרווחי שניות. כדי להימנע מצילום הלבנה, לשמור על עירור הלייזר נמוך ככל האפשר. לספק עירור על ידי קו 488 ננומטר של לייזר הארגון, תוך הצינור מכפיל אוסף את פליטת הניאון דרך מסנן LP 505 ננומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunolabeling עם נוגדנים ספציפיים מספק פלטפורמה ללמוד הלוקליזציה של חלבונים מסוימים של עניין ברשתית וטכניקת ההדמיה סידן מאפשר המחקר של התרומה של VGCCs לדינמיקה סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

על ידי שימוש בנוגדנים נגד RBPMS חלבון תא גנגליון (חלבון RNA מחייב עם שחבור מרובה) שבאופן בררני תוויות RGCs 19, הצלחנו להראות כי תיוג Fluo-4 מוגבל לתאי הגנגליון (איור 1). גדם הזרקה אינה מובילה לתיוג של כל תאי הגנגליון כפי שניתן היה לצפות מטכניקה זו.

נוגדן הארנב polyclonal נוצר נגד N-הסופי של פוליפפטיד RBPMS (RBPMS 4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, על ידי ספק מסחרי (טבלת 1). RBPMS הוא שמור ביותר בקרב יונקים ורצף פוליפפטיד המשמש לחיסון זהה בעכבר, חולדה, קוף ואדם (בנק צמח השדה חלבון, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein). סרה ארנב נאספה הבא חיסון וזיקה מטוהר באמצעות עמודה זיקת פוליפפטיד RBPMS. הנוגדן מטוהר הזיקה הוצג immunostain תאי הגנגליון ברשתית עכבר וחולדה. כדי להעריך את הספציפיות של immunostaining RBPMS, שליטת preabsorption בוצעה עם נוגדן הארנבת. בקצרה, נוגדן RBPMS היה מדולל בPB 0.1 M מכיל 0.5% טריטון X-100 ומעורבים עם פוליפפטיד RBPMS בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​לשעה 2 ב RT. אין immunostaining RBPMS היה נוכח בחלקי רקמות הודגרו עם נוגדני ארנבת preabsorbed לRBPMS ועובדו על יד טכניקות immunohistochemical סטנדרטית.

"Width =" s.jpg 600 "/>
איור 1: immunostaining הוק הודעה עם נוגדנים כנגד חלבון RBPMS RGC (אדום) כדי להראות Fluo-4 לוקליזציה (ירוקה) לתאי הגנגליון נוגדנים משני נגד ארנב 568 עזים Alexa היה בשימוש.. סרגל קנה מידה: 20 מ"מ.

טכניקות הדמיה סידן נמצאות בשימוש כדי לחקור את התרומה של VGCCs לאות סידן בRGCs והאקסונים שלהם. ערכי עוצמת פלורסנט נרכשו על ידי הצבת ROIs על RGCs של עניין (איור 2).

איור 2
איור 2: על מנת לרכוש ערכי עוצמת ניאון, ROIs הונחו על somata תא גנגליון ו / או אקסונים סרגל קנה מידה:. 50 מ"מ.

pentapotassium Fluo-4 מלח שימש תווית RGCs והאקסונים שלהם (איור 3).

"Jove_content" FO: לשמור-together.within-page = "תמיד"> איור 3
איור 3: תת VGCC שתורמים לאיתות סידן בsomata תא גנגליון והאקסונים שלהם. תמונת Confocal של רשתית wholemount ברמות הבסיס (). האקסונים RGCs וRGC ניתן לראות שכותרתו עם fluo-4. (ב) אותות פלורסנט מsomata יחיד RGC מפגין העלייה בעוצמת הקרינה ממוצעת שהושרו על ידי פולסים לזווג של high-K + (60 מ"מ) פתרון רחצה ועוקבת הפחתה הקרינה בנוכחות של קובלט בדופק השני. סרגל קנה מידה ל: 20 מ"מ.

מערכת Zeiss LM5 פסקל הוקמה כדי ללכוד תמונות במסגרת שיעור של 5 שניות וכל סריקת מסגרת מלאה לקחה 1.57 שניות בהגדרות בשימוש. אזור אוסף של 318 מיקרומטר x 318 מיקרומטר נכלל באזור הסרוק של 512 x 512 pixels נותן שטח של 0.385 מיקרומטר 2 לפיקסל. הגדרות אלה עשויות להיות מגוונות בהתאם לרזולוציה הרצויה. המערכת משתמשת בליזר mW ארגון 25 לעירור 488 ננומטר. אנו משמשים את הקו הזה ב3% כוח. רוויה הייתה ממוזערת על ידי בחירת הריכוז הנמוך ביותר של צבע מחוון סידן שהניב תגובות חזקות לגירוי depolarizing ולאחר מכן על ידי הקטנת רווח הפלט ראשון. הפחתה של כוח הלייזר סייעה למנוע הלבנה. ריכוז מחוון לא נמדד. כיול של הדמיה שאינה ratiometric אפשרי עם השימוש ביונופורים סידן, אבל הטכניקה למלא את המשבצות יכולה לעבוד עם צבעי ratiometric גם כן. כדי לקבוע את ריכוז המחוון האופטימלי, השווינו את השינוי עורר שלילת קוטביות בקרינה עם ריכוזים מוזרקי גדם של Fluo-4 הנעים 1-40 מ"מ. ROIs העגול והסגלגלה צוירו סביב RGCs והאקסונים שלהם, בהתאמה שהציג עוצמת הקרינה יציבה. RGCs ואקסונים שנסחפו מתוךלהתמקד בשל תנועה הנגרמת על ידי superfusion לא נבחר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה, שתארנו שתי טכניקות שונות: 1) אימונוהיסטוכימיה להראות Fluo-4 לוקליזציה לתאי הגנגליון ברשתית wholemounts, ו2) סידן הדמיה כדי לנתח דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

אימונוהיסטוכימיה באמצעות wholemounts נעשתה שימוש כדי לחשוף את הלוקליזציה של חלבונים במכרסמי רשתית 20-23. עם זאת, יש כמה מגבלות. איכות הצביעה מסתמכת במידה רבה על יכולתו של הנוגדן לאנטיגן להכיר בהתאמתה ויכולתה לחדור לרקמת הרשתית לשכבה המסוימת של עניין. ניתן לשפר בעיות אלה על ידי הגדלת תקופת הדגירה בנוגדן הראשוני על ידי עד שבעה ימים, להגדיל את הריכוז של Triton-X ו / או דוגרים הרשתית ללא נייר הסינון כדי לאפשר דיפוזיה של הנוגדן דרך שכבת תא גנגליון ו קולטני האור. מגבלה נוספת היא duratiובריכוז של קיבעון. נוגדנים מסוימים פועלים טובים יותר כאשר הרקמה קבועה לשעה אחת, ואילו נוגדנים אחרים דורשים תקופת קיבוע קצרה יותר. כמו כן, בעוד שנוגדנים מסוימים יעבדו הכי טובים ב4% קיבעון PFA, אחרים לעבוד טוב יותר בריכוזים מופחתים. אנו ממליצים שהמשתמש לקבוע את משך הזמן האופטימלי וריכוז של קיבעון, את משך הזמן של דגירה, הריכוז של Triton-X, כמו גם הריכוז של הנוגדן הראשוני לתוצאות אופטימליות.

ההדמיה סידן הייתה בשימוש כדי ללמוד את דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם. Superfusion של סוכני חסימת VGCC אפשר הערכה של היעילות היחסית החסימה של התרופות ואת הנוכחות של תת ערוץ Ca שונה. במקרה שRGCs ואקסונים אינם מגיבים לגבוה K +, נסה לצמצם את הריכוז של צבע מחוון סידן, כמו ריכוזים גבוהים יכולים לגרום לרוויה. ההסרה חלקית של הזגוגיתיכול גם לפעול כמחסום, מניעה + K גבוהה מלהגיע RGCs והאקסונים שלהם. בנוסף, כישלון לעלות כראוי הנבל על גבי הרשתית עלול לגרום לתנועה, וכתוצאה מכך חוסר יכולת לרכוש ערכי עוצמת הקרינה. אם הרשתית ממשיכה לנוע, להסיר בזהירות את הנבל, לייבש את האזור המקיף את הרשתית ומחדש הר הנבל על ידי הוספה יותר שומן להיקפה. הסרה מלאה של תנועת הזגוגית והמינימאלית של wholemount הרשתית היא חיונית להצלחה של הניסוי.

אגוניסטים של קולטני סידן חדיר גלוטמט לידי ביטוי על ידי RGCs כגון N-methyl-D-aspartate (NMDA), 24,25 α -amino-3-5-4-propionate הידרוקסי methylisoxazole קולטנים (AMPA) וkainate סוג קולטני גלוטמט ionotropic 26-29, ניתן להשתמש בם כדי לעורר כניסה ישירה של סידן, כמו גם לספק גירוי depolarizing שמפעיל VGCCs. ניצול אגוניסטים כאלה עלולים להוביל לאיתגובת -uniform בשל ביטוי ההפרש של תת קולט גלוטמט לסוגים השונים של RGCs. שני הפוטונים במיקרוסקופ יכול גם להיות מנוצל כדי לחקור אותות סידן אור עורר ב30 RGCs והדנדריטים שלהם ביום 31 ב.

תיוג סלקטיבית של RGCs הושג בשל מאפייני impermeant הקרום של צבע מחוון סידן מלח pentapotassium Fluo-4. צבעי מחוון סידן dextran מצומדות- יש גם שימשו לתייג RGCs והאקסונים שלהם באופן סלקטיבי באמצעות זריקות intraretinal בארנב 32 ועכברוש 33. בשני המחקרים, תיוג סלקטיבית של RGCs והאקסונים שלהם הושג באמצעות זריקות intraretinal של צבע מחוון סידן dextran מצומדות-, ואחרי דגירה שעה 2 בארנב 32 או דגירה 7 שעות בחולדה 33. למרות מתן תקופת דגירה נאותה כדי להבטיח תיוג אחיד ברשתית, שיטות כאלה יגרמו לתיוג מוגבר של RGCs ואקסונים הקרובים ביותר באתר ההזרקה בהשוואה לתיוג דליל באזורי דיסטלי לאתר ההזרקה. כפי שנדון בBaldrige (1996), תיוג לא אחיד במקום ההזרקה יוחס לתיוג diffusional של סומה כתוצאה מספיגת הצבע בדנדריט נחשף (החתך), ואילו תיוג באזורי דיסטלי צפוי כתוצאה מהובלת מדרדר מספיגה של הצבע בהאקסון החשוף 32. הטכניקה שלנו מספקת שיטות משופרות כדי להגדיל את התיוג אחיד של RGCs והאקסונים שלהם ולצמצם את תקופת הדגירה הנדרשת.

שיטת טעינת הצבע הנוכחית מספקת אסטרטגיה חלופית לטכניקות קונבנציונליות כגון טעינה בתפזורת וelectroporation שתגרומנה לטעינה הלא ספציפית של תאי amacrine עקורים בשכבת תא גנגליון. עם הזמינות של קווי עכבר מהונדסים מבטא tdTomato או EGFP תחת השליטה של יזמים שנמצאים באוכלוסיות תאי הגנגליון ספציפיות 34-38 applicati, עתידתוספות של טכניקה זו עשויות לכלול בדיקות הדמית סידן של תת תא הגנגליון ברשתית ספציפית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אי לנו גילויים.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר ס 'סטלה והלן Vuong על תרומתו לפרוטוקול ההדמיה סידן. אנו מודים לגיליונות ד"ר ק לצילום סצנות הראיון. אנו מודים לד"ר ארלין היראנו על הערותיה על כתב היד. פרויקט מחקר ופיתוח זה נערך על ידי החוקרים בבית ספר דייוויד גפן לרפואה באוניברסיטת קליפורניה ומתאפשר על ידי הסכם חוזה שהוענק ומנוהל על ידי פיקוד המחקר ואמצעי רפואה של צבא ארה"ב (USAMRMC) וטכנולוגית טלרפואה והמתקדמת מרכז מחקר (TATRC), בפורט דטריק, MD תחת מספר חוזה: W81XWH-10-2-0077. תמיכה במחקרים אלה גם באו מEY04067 NIH וסקירת VA הצטיינות (NB). NCB הוא VA קריירה מדען מחקר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight scissors WPI 14124-G dissecting tools
Straight Forceps WPI 501985 dissecting tools
curved iris scissors WPI 504487 dissecting tools
Cellulose filter paper Millipore HABP04700
Hibernate A Invitrogen A12475-01 Media
Vectashield Vector H-1000 Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium Invitrogen F-14200
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 anesthesia
Microscope slide Fisher Scientific 22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular Probes A-11034 Secondary antibody
RBPMS ProSci, Poway, CA A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
  2. Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
  3. Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
  4. Berridge, M. J., et al. Calcium--a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
  5. Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
  6. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  7. Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
  8. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  9. Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
  10. Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
  11. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
  12. Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
  13. Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
  14. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
  15. Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
  16. Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
  17. Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
  18. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
  19. Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
  20. Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
  21. Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
  22. Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
  23. Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
  24. Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
  25. Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
  26. Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
  27. Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
  28. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  29. Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
  30. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
  31. Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
  32. Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
  33. Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
  34. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
  35. Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
  36. Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
  37. Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
  38. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).

Tags

Neuroscience גיליון 92 אימונוהיסטוכימיה נוגדן fluo-4 הדמיה סידן תאי הגנגליון רשתית חולדה
שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N.… More

Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Pérez De Sevilla Müller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J. Vis. Exp. (92), e51396, doi:10.3791/51396 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter