Summary
Schwangerschaft führt zu signifikanten Änderungen der Fettsäurezusammensetzung von mütterlichem Gewebe. Lipid-Profile können über Gaschromatographie erhalten werden, damit die Identifizierung und Quantifizierung von Fettsäuren in den einzelnen Lipidklassen unter Ratten während der Schwangerschaft zugeführt verschiedenen Hoch-und fettarme Ernährung.
Abstract
Gaschromatographie (GC) ist ein auf Basis von Geweben, Zellen und Plasma / Serum zu identifizieren und die Fettsäuren der Lipide, wodurch Ergebnisse mit hoher Genauigkeit und hoher Reproduzierbarkeit hochempfindliche Methode. Im Stoffwechsel-und Ernährungsstudien ermöglicht GC Beurteilung von Änderungen der Fettsäure-Konzentrationen nach Eingriffen oder bei Veränderungen in physiologischen Zustand wie Schwangerschaft. Festphasenextraktion (SPE) mit Aminopropyl-Silicakartuschen ermöglicht die Trennung der Hauptlipidklassen, einschließlich Triglyceride, verschiedene Phospholipide, und Cholesterylester (CE). GC in Kombination mit SPE wurde verwendet, um die Änderungen in der Fettsäurezusammensetzung der CE-Fraktion in der Leber von Jungfrau und trächtige Ratten, die verschiedenen Hoch-und fettarme Ernährung zugeführt hatte zu analysieren. Es gibt signifikante Diät / Schwangerschaft Wechselwirkungen auf die Omega-3 und Omega-6-Fettsäuren von Leber CE, das anzeigt, dass schwangere Frauen eine unterschiedliche Reaktion auf Nahrungs MANIPULATIonen, als unter den jungfräulichen Weibchen gesehen.
Introduction
Gaschromatographie (GC) ist eine gut etablierte Technik, die zur Nahrungsergänzung bei oder physiologischen Bedingungen, wie Fettsucht (und verwandten Krankheiten wie Diabetes) oder Schwangerschaft 3 in Lipidpools und Zellmembranen 1,2 Identifizierung und Quantifizierung des Einbaus von Fettsäuren - 5. Es ist auch für die Analyse der Art und Menge der Fette in Lebensmitteln. Dies ist nützlich bei der Charakterisierung von Versuchsdiäten, sowie die Gewährleistung, dass die Lebensmittelindustrie erfüllt die Norm. Zum Beispiel kann GC verwendet werden, um die Identität und Menge der Fettsäuren in einem Produkt, wie ein Nahrungsergänzungsmittel zu bestätigen, um sicherzustellen, dass die Kennzeichnung korrekt und Vorschriften eingehalten 6,7. Analyse der Fettsäuren können wertvolle Einblicke in den Fettstoffwechsel in Gesundheit und Krankheit, die Auswirkungen der Änderung der Ernährungsgewohnheiten und die Auswirkungen von Änderungen in physiologischen Zustand 8 bereitzustellen. Verwendung von GC-Proben während der Schwangerschaft Studie hat wichtige bereitgestelltInformationen über Änderungen in Fettsäure und komplexe Lipidhomöostase 3.
Vor der chromatographischen Trennung, Lipide werden typischerweise aus der Probe unter Verwendung der Löslichkeit der Lipide im Lösungsmittel Mischungen aus Chloroform und Methanol extrahiert. Natriumchlorid wird zugegeben, um die Trennung der Mischung in eine wässrige und organische Phasen enthaltendes Lipid 9,10 erleichtern. Komplexe Lipidklassen von Interesse aus der Gesamtlipidextrakt durch Festphasenextraktion (SPE) getrennt werden. Dieses Trennverfahren eluiert Lipidklassen auf der Grundlage ihrer Polarität oder Bindungsaffinität. Triacyglycerols (TAG) und Cholesterinester (CE) zunächst als Kombinationsanteil, weitere Klassen, Phosphatidylcholin (PC) eluiert, Phosphatidylethanolamin (PE), und nicht-veresterten Fettsäuren (NEFA), indem die Polarität der Elutionsmittel eluiert . Die Trennung der TAG von CE nutzt die Bindung von TAG nur zu einem frischen SPE cartridge, so dass CE eluiert werden. TAG kann dann durch Erhöhen der Polarität des Lösungsmittels 9,10 Elution eluiert werden. Diese Verfahren können mehrere Proben gleichzeitig mit einer höheren Ausbeute als getrennt werden mit Dünnschichtchromatographie erreicht, was bedeutet, dass relativ klein Proben (z. B. <100 ul Plasma oder Serum, <100 mg Gewebe) können analysiert werden 11,12.
GC ist eine gut etablierte Technik zuerst in den 1950er Jahren beschrieben, wurde vorgeschlagen, dass die mobile Phase in der dann Flüssigkeit-Flüssigkeit-Systeme können mit Dampf ersetzt werden. Es wurde ursprünglich für die Erdöl-Analyse verwendet, aber schnell in anderen Bereichen, wie Aminosäureanalyse und Lipidbiochemie, die immer noch von besonderem Interesse erweitert. Fortschritte in der GC und Technologie wie die Entwicklung von Kapillarsäulen von den bisher verwendeten Füllkörper hat unseren derzeitigen Techniken, bei denen Fettsäuren sind in der Lage zu sein, führteeffizienter bei niedrigeren Temperaturen, was zu GC routinemäßig verwendet werden, um in einer Vielzahl von Untersuchungen 13 identifizieren und zu quantifizieren Fettsäuren getrennt.
GC benötigt Fettsäuren zu, damit sie ausreichend flüchtig, um bei vernünftigen Temperaturen ohne thermische Zersetzung eluiert werden können derivatisiert werden. Dies beinhaltet gewöhnlich die Substitution einer funktionellen Gruppe Wasserstoff enthaltenden Ester, Thioester oder Amide, zur Analyse zu bilden. Methylester sind häufig Derivate untersucht, die durch Methylierung hergestellt werden. In diesem Verfahren werden die Esterbindungen in komplexen Lipiden hydrolysiert, um freie Fettsäuren, die transmethyliert zu Fettsäuremethylester (FAME) bilden freizugeben. Das resultierende Profil der FAME GC bestimmt wird, wird als die Fettsäurezusammensetzung bezeichnet und kann leicht zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen 9,10 verglichen werden. Die Technik ermöglicht sowohl die Anteile der einzelmanuelle Fettsäuren und deren Konzentrationen zu messen.
Neben der Verwendung von GC analysiert Fettsäuren in der Ernährung Studien und in der Lebensmittelindustrie, kann die Technik für eine Vielzahl von Analysefeldern verwendet werden. Zum Beispiel, Umweltanalysen mit GC sind die Bestimmung von Wasserverunreinigungen durch Insektizide und Bodenanalysen Messchlorgehalt. In der Toxikologie hat GC auch verwendet, um illegale Substanzen in Urin-und Blutproben von Personen zu identifizieren, wie ein Sport-Leistungsförderer 12 und die Fähigkeit, komplexe Mischungen von Kohlenwasserstoffen zu trennen macht diese Technik beliebt in der Erdölindustrie für petrochemische Analyse 12.
Schwangerschaft mit signifikanten Änderungen der Fettsäurezusammensetzung von mütterlichem Gewebe, insbesondere des Gehalts an Omega-3 (n-3) und Omega-6 (n-6) polyungesättigten Fettsäuren aci zugehörigends (PUFA) 3. In der aktuellen Studie, veranschaulichen wir die Verwendung von GC in der Messung der Fettsäuren durch die Beschreibung seiner Verwendung in der Analyse der Fettsäurezusammensetzung von Lebergewebe aus Jungfrau und trächtige Ratten Fett niedrigen und hohen Diäten mit verschiedenen Ölquellen gespeist übernommen. Die experimentellen Diäten hier vorgesehen waren eine fettarme Sojaölbasis Diät, eine fettreiche Sojaöl-Diät (130,9 g Gesamtfett / kg Gesamtfett) oder eine hohe Fett-Leinöl-Diät (130,9 g Gesamtfett / kg Ernährung) für 20 Tage zur Verfügung gestellt. Der vollständige Nährstoff und Fettsäurezusammensetzung dieser Diäten wurden zuvor 14 beschrieben. Die Sojaöl-Diäten sind reich an Linolsäure (18.02 n-6) und enthalten eine α-Linolensäure (n-3-18.03 Uhr), während der Leinöl-Diät ist reich an α-Linolensäure. Diese fettreiche Ernährung repräsentieren unterschiedliche Rationen von Linolsäure zu α-Linolensäure (Ration von 8:1 und 1:1, jeweils). Das Verfahren zur Isolierung einzelner Lipidklassen und Analyse durch GC ist, dass wirll entwickelt und validiert, und hat vorher 10, aber ohne detaillierte technische Beschreibung hier gefunden veröffentlicht.
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Protocol
1. Tierverfahren
- Alle Tier Arbeiten sollten in Übereinstimmung mit den Home Office Tiere (Scientific Procedures) Act (1986) durchgeführt werden.
- Mate-Wistar-Ratten im Alter von 10 Wochen alt von monogamen Zucht, und bestätigen Schwangerschaft durch das Auftreten einer vaginalen Stecker. Nehmen Sie dies als ein Tag der Trächtigkeit und beginnen experimentelle Ernährung. Für jungfräulichen Weibchen, jedes Haus individuell Ratte, und beginnen experimentelle Ernährung.
- Nach Fütterung der Versuchsdiäten für 20 Tage einschläfern Ratten durch CO 2-Erstickung durch Genickbruch folgte.
- Verwenden Dissektion Pinzette und Schere, um die Bauchhöhle zu entlarven und die Leber herauszuschneiden, indem die Bänder, die die Leber mit der Membran zu verbinden, Vorderwand der Bauch, Magen und Zwölffingerdarm. Waschen der Leber in PBS und in flüssigem Stickstoff einfrieren vor der Lagerung bei -80 ° C.
2. Erstellung eines Gesamtlipidextrakt 9
- Molecul hinzufügenar Sieben (zu füllen 1/10 der Lösungsmittelbehälter) an alle Lösungsmittel, um "trocken" Lösungsmittel erstellen. Führen Sie alle Lösungsmittel Arbeit innerhalb einer Abzugshaube.
- Schneiden Sie ca. 100 mg eingefroren Leber und wiegen. Legen Sie das Gewebe in ein Rohr in einem Eiskübel und fügen Sie 0,8 ml eiskaltem 0,9% NaCl. Homogenisieren des Gewebes.
- Hinzufügen interner Standards in 1 ml / mg trockenes Chloroform: Methanol (2:1, v / v) enthält, butyliertes Hydroxytoluol (BHT, 50 mg / l) als Antioxidationsmittel. Für 100 mg Rattenleber mit 100 ug CE-Standard (Cholesteryl heptadecanoate 17.00). Vorsicht: Chloroform und BHT sind gefährlich.
- 5,0 ml trockenem Chloroform: Methanol (2:1, v / v), enthaltend BHT (50 mg / L).
- 1,0 ml 1 M NaCl, gründlich durch Vortexen mischen, bis die Mischung aussieht Uniform. Proben verschlossen und bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert werden für bis zu einer Woche.
- Zentrifugieren bei 1000 × g für 10 min, geringe Brems bei Raumtemperatur.
- Sammeln unterenPhase mit Pasteur-Glaspipette, Transfer zum neuen Schraubverschluss Glasrohr und trocken unter Stickstoff bei 40 ° C Proben verschlossen und bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert werden für bis zu einer Woche.
3. Trennung der Lipidklassen durch Festphasenextraktion (SPE) 10
- Verbinden der SPE Tank mit einer Vakuumpumpe und legen Aminopropylsilicagel SPE-Kartusche auf den Tank.
- Zeigen neuen Schraubverschluss Glasrohr markiert TAG und CE im Tank Rack unter der Spalte zur ersten Fraktion zu sammeln.
- Lösen Sie die Gesamtlipidextrakt in 1,0 ml trockenem Chloroform und Wirbel.
- Bewerben Probe auf die Säule mit einem Glas-Pasteur-Pipette und zu ermöglichen, durch in die Schraubkappe Rohr unter der Schwerkraft tropfen. Wenn keine weiteren Tropfen fallen, entfernen Sie die restliche Flüssigkeit durch Vakuum.
- Eluiere das TAG-und CE-Fraktion unter Vakuum, waschen Sie die Säule mit 2 x 1,0 ml trockenem Chloroform wäscht.
- Wenn alle Flüssigkeit entfernt wird, trocknen die TAG-und CE-Fraktionierungn unter Stickstoff bei 40 ° C. Proben verschlossen und bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert werden für bis zu einer Woche.
- Zeigen neuen Schraubverschluss Glasrohr markiert PC in den Tank Fach unter der Spalte.
- Eluieren die PC-Fraktion im Vakuum unter Zusatz von 2 x 1,0 ml trockenem Chloroform: Methanol (60:40, v / v), bis alle Flüssigkeit aus der Säule entfernt wird.
- Entfernen und trocken PC-Fraktion unter Stickstoff bei 40 ° C Proben verschlossen und bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert werden für bis zu einer Woche.
- Legen Sie eine neue Schraubverschluss Glasrohr mit der Bezeichnung PE in den Tank Tablett und eluieren PE Fraktion mit der Zugabe von 1,0 ml trockenem Methanol unter Vakuum.
- Entfernen und trocken PE-Fraktion unter Stickstoff bei 40 ° C Proben verschlossen und bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert werden für bis zu einer Woche.
- Zeigen neuen Schraubverschluss Glasrohr markiert NEFA in den Tank Tablett und eluieren NEFA-Fraktion unter Vakuum durch die Zugabe von 2 x 1,0 ml Wasch trockenem Chloroform: Methanol: Eisessig. (100:2:2, v / v / v) Achtung: Eisessig ist gefährlich.
- Entfernen gesammelten NEFA-Fraktion und trocken unter Stickstoff bei 40 ° C Proben verschlossen und bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert werden für bis zu einer Woche.
- Legen Sie eine neue Aminopropylsilicagel SPE-Kartusche auf dem SPE Tank und setzen Sie ein Glas mit Schraubverschluss Rohr im Tank Wanne unter der Patrone, um Abfall zu sammeln.
- Mit 3 Wasch trockenem Hexan unter Vakuum und dann eine endgültige 1,0 ml Wasch unter der Schwerkraft Die Säule. Lassen Sie die Patrone zu trocken geworden Vorsicht (drehen Sie die Patrone Spalte Kanäle in eine geschlossene Position, wenn Hexan Füllstand nahe an der Patrone Matrix):. Hexan ist gefährlich.
- Ersetzen Abfallschlauch mit neuen Schraubverschluss Glasrohr markiert CE.
- Lösen Sie die TAG getrocknet und CE-Fraktion (in Schritt 3.6 vorbereitet) in 1.0 ml trockenem Hexan und Wirbel. Wenden Sie diese auf die Säule mit einem Glas-Pasteur-Pipette und ermöglichen durch unter g abtropfenravity.
- Wenn keine weiteren Tropfen fallen, entfernen Sie die restliche Flüssigkeit im Vakuum.
- Im Vakuum, waschen Sie die Säule mit 2 x 1,0 ml trockenem Hexan wäscht CE und trocken gesammelte Fraktion eluieren unter Stickstoff bei 40 ° C Proben verschlossen und bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert werden für bis zu einer Woche.
- Zeigen neuen Schraubverschluss Glasrohr markiert TAG in der Tankschale und eluieren TAG mit der Zugabe von 2 x 1,0 ml Wasch trockenem Hexan: Methanol: Ethylacetat (100:5:5) unter Vakuum.
- Trocken gesammelte Fraktion unter Stickstoff bei 40 ° C. Proben können begrenzt werden und bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert sind bis zu einer Woche. Vorsicht: Ethylacetat ist gefährlich.
4. Herstellung von FAME von CE 10
- 0,5 ml trockenem Toluol zu der abgetrennten CE-Fraktion (in Schritt 3.19) und auf die Wirbel. Vorsicht: Toluol ist gefährlich.
- Bereiten Methylierungsreagens (trocken Methanol mit 2% (v/ V) H 2 SO 4), von denen 1,0 ml pro Probe erforderlich. Abgabevolumen trockenem Methanol in Glas oder geeignete Kunststoffbehälter mit Deckel, und fügen Sie die erforderliche Menge an H 2 SO 4 tropfenweise dann mischen durch Umdrehen. Vorsicht: Schwefelsäure ist gefährlich.
- 1,0 ml der Methylierungsreagens auf die in trockenem Toluol gelöst Proben, die Kappe die Rohre sicher und vorsichtig mischen.
- Erhitzen Sie die Proben für 2 Stunden bei 50 ° C
- Nach 2 Stunden Rohre vom Herd nehmen. Nach dem Abkühlen 1,0 ml Neutralisationslösung (0,25 M KHCO 3 0.5MK 2 CO 3). Vorsicht: Kaliumbicarbonat und Kaliumcarbonat sind gefährlich.
- 1,0 ml trockenem Hexan und Wirbel.
- Zentrifuge bei 250 × g für 2 min, geringe Brems bei Raumtemperatur.
- Sammeln oberen Phase, die die FAME enthält, und übertragen in eine neue nicht Schraubverschluss Einwegglasrohr.
- Trocknen Sie die gesammelten FAME unterStickstoff bei 40 ° C. Proben verschlossen und bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert werden für bis zu einer Woche.
5. Entfernung von freiem Cholesterin Kontamination von CE FAME 14
(Free Cholesterin kann die Probe verunreinigen, siehe Abbildung 1 zum Beispiel Gaschromatographen Spuren mit und ohne freies Cholesterin-Entfernung).
- Stellen Sie einen Abfallrohr in SPE Tank und setzen Sie ein Kieselgel-SPE-Kartusche auf den Tank.
- Mit 3 x 1 ml Wasch trockenem Hexan unter Vakuum und 1 x 1 ml unter Schwerkraft waschen Spalte.
- Entfernen Abfall wäscht und neue Abfallschlauch in den Tank.
- Lösen CE FAME in 1 ml trockenem Hexan, Wirbel.
- Übernehmen, um die Spalte mit einer Glaspasteurpipette und ermöglichen durch unter der Schwerkraft zu tropfen.
- Mit 3 x 1 ml Waschschritten mit Hexan unter Vakuum Waschkolonne.
- Entfernen Abfall wäscht und setzen Sie neue Schraubverschluss Rohr in den Tank markiert CE FAME.
- Eluieren derCE FAME mit 2 x 1 ml trockenem Hexan: Diethylether (95:5 v / v) Waschen.
- Trocknen unter Stickstoff bei 40 ° C. Proben können begrenzt werden und bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert sind bis zu einer Woche. Vorsicht: Diethylether ist gefährlich.
6. Übernahme von FAME in GC Auto Sampler Vial
- In 75 ul trockenem Hexan zu probieren, Wirbel-, und Transfer zu einem GC-Autoprobenfläschchen.
- Fügen Sie eine weitere 75 ul trockenem Hexan zu probieren, Wirbel und übertragen auf den gleichen GC Autoprobenfläschchen. Proben verschlossen und bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert werden für bis zu einem Monat.
7. Analyse mit dem Gaschromatographen 14
- Analysieren FAME auf einem Gaschromatographen. Beispiel einzurichten: 30 mx 0,25 um x 0,25 mm BPX-70 Quarzkapillarsäule mit Temperaturprotokoll:
Anfangstemperatur 115 ° C, halten 2 min, Rampe 10 ° C / min auf 200 ° C, halten 18,5 min, Rampe 60 ° C / min bis 245 ° C, halt 4 min.
Kolumne: Heliumgas, Durchflussmenge 1,0-, Druck-und Geschwindigkeits 29 14.6.
Injektor: Temperatur = 300 ° C
Detektor: Der Wasserstoffstrom 40,0, 184,0 Luftstrom, Make-up Gas Helium, fließen 45,0, Temperatur = 300 ° C - Stellen Splitverhältnis als angemessen (zB 25:1 für die CE-FAME-Analyse).
- Bestimmen Sie die Fläche unter jedem Peak mit der entsprechenden Software und identifizieren FAME durch Vergleich mit Standards. Siehe Abbildung 2 beispielsweise Chromatogramme.
- Verwenden der Fläche unter den Spitzendaten, um den Beitrag der einzelnen Fettsäuren als Prozentsatz der Gesamtfettsäuren zu berechnen.
- Berechnen absoluten Konzentrationen von Fettsäuren durch Teilen der Fläche des internen Standards von der zugegebenen Menge. Teilen die Fläche jeder Fettsäure dieses Ergebnis absoluten Konzentrationen jeder Fettsäure in der Menge des Gewebes verwendet zu erhalten.
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Representative Results
Der Erfolg dieser Methode hängt von genau nach dem Protokoll und auf die saubere Lösemittel und Reagenzien, um "Lärm" und Verunreinigungen, die auf einem Chromatogramm erscheinen können reduzieren. Kontaminierten Proben sind schwieriger zu analysieren, eine Senkung der Genauigkeit der Fläche unter der Kurve Berechnungen. Wenn das Protokoll erfolgreich ein Chromatogramm mit klaren symmetrischen, gut definierte Höhen und mit minimalem Hintergrundgeräusche gefolgt sollten erhalten werden, wie in Abbildung 3 dargestellt. Wenn eine Kontamination stattgefunden hat das Chromatogramm wird zusätzliche Peaks zeigen und zeigen nicht-symmetrische (schief) Spitzen, wie in Abbildung 4 dargestellt. Die Kontamination von freiem Cholesterin wird bei der Ausführung von FAME von CE abgeleitet (siehe Abbildung 1, es sei denn, das Cholesterin entfernt wird (wie in Protokoll Nr. 5 beschrieben).
Die Verwendung einer vorbereiteten Kalibrierungsmischung ermöglicht die Identifizierung der FAME in thE Probe. Das Kalibrierungsgemisch wird mit den gleichen Instrumenteneinstellungen wie die Proben, so daß das Chromatogramm der Probe und Peaks auf der Basis ihrer Retentionszeiten ordnungsgemäß identifiziert, wie in Fig. 2 dargestellt, verglichen werden ausgeführt.
Peakfläche wird verwendet, um den Prozentsatz der spezifischen Fettsäuren in der gesamten Berechnung. Sobald die Daten gesammelt worden sind, ist es sinnvoll, sie Ausreißer untersuchen, wie in Fig. 5 gezeigt. Ausreißerproben können dann weiter untersucht werden und die Extraktion und / oder Analyse wiederholt, wenn nötig.
Zugabe eines internen Standards, Proben (wie in Schritt 2.3 beschriebenen Protokoll) ermöglicht die Quantifizierung der Fettsäuren in der Probe durch Berechnungen unter Verwendung der Fläche der bekannten Menge des internen Standard-Peaks relativ zu der Fläche des Peaks von Interesse und für die eingestellte Originalprobenvolumen oder Gewicht. In Tabelle 1 sind in der Rattenleber FAME CE als beschriebenProzent der gesamten Fettsäuren (g/100 g Gesamtfettsäure) in Leber CE. Diese Daten beschreiben die CE-Fettsäuren in der Leber der Jungfrau oder trächtigen Ratten 20 Tage lang auf einem von drei verschiedenen Diäten zugeführt. Statistische Auswertung mittels Zwei-Faktor-ANOVA (Faktoren: Ernährung, schwanger vs Jungfrau) zeigt deutliche Auswirkungen von Ernährung und Schwangerschaft auf den Anteil der verschiedenen Fettsäuren, sowie signifikante Wechselwirkungen Schwangerschaft Diät-x (Tabelle 1). Als Beispiel, Abbildung 6 zeigt, dass die Arachidonsäure (AA, 20:4 n-6)-Gehalt von Leber CE bei trächtigen Ratten mehr durch Ernährung als der jungfräulichen Weibchen beeinflusst.
Abbildung 1. Vergleichende Gaschromatogramme identische Proben, die die Bedeutung des freien Cholesterinentfernung in Rattenlebergewebe. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 2. Beispiel des zur Probe CE FAME aus Rattenlebergewebe zu identifizieren mit Hilfe eines vorbereiteten Kalibrierungsmischung Methode. A prepared Kalibrierungsmischung wird mit den gleichen Instrumenteneinstellungen wie die Proben, so dass die Chromatogramme verglichen mit Fettsäuren in der Probe zu identifizieren, auszuführen. Die begleitende Chromatogramm für die Kalibrierung der FAME-Mix kann in der Mischung gekennzeichnet zu werden. Diese markierte Spur kann dann in dem Chromatogramm der Probe, leicht erkennbar große Spitzen können durch ihre Retentionszeiten mit denen auf dem Kalibrierungsmischung dann entsprechend gekennzeichnet verglichen werden verglichen. Zum Beispiel hervorgehoben auf der Spur. ist 16.00 Uhr, um den Vergleich der Retentionszeiten von der Kalibrierungsmischung oben auf der Fettsäuren in der Probe Überwachung unten ermöglicht korrekte Kennzeichnung von Fettsäuren zu veranschaulichen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
4. Beispiel eines kontaminierten NEFA Gaschromatogramm aus menschlichem Plasma gewonnen. Es gibt viele unerwartete Peaks, wie zu Beginn der Proben eingekreist, die die Integration von echten Peaks beeinflussen können. Die Peaks werden unterbrochen und undefinierte als towar gesehen ds Ende der Probe und haben sich geneigt als eingekreist. Dies wird die Genauigkeit der Fläche unter der Kurve Berechnungen und der Quantifizierung dieser Fettsäuren beeinflussen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
5. Identifizierung von Ausreißerdaten zwischen Fettsäurezusammensetzung der Leber in CE Jungfrau Ratten eine fettreiche Ernährung Sojaöl (n = 6). Dieser Prozentsatz zeigt, wie Daten der analysierten Fettsäuren können verwendet werden, um mehrdeutige Ergebnisse bestimmen. Diese Daten zeigen, dass die Probe 125 kann ein Ausreißer ist, und erfordert eine weitere Untersuchung. Die fünf wichtigsten Fettsäuren in CE (16.00, 18.00, 18.01 Uhr n-9, 18.02 Uhr n-6, 20:4 n-6) sind nicht dargestellt.. Jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
6. Arachidonsäure Inhalt der Leber unter CE Jungfrau und schwangere Ratten experimentellen Diäten. Werte sind Mittelwerte ± SD, n = 6. Bedeutet ohne gemeinsamen Buchstaben unterscheiden, P <0,05. * Sich von jungfräulichen Weibchen innerhalb abgestimmte Ernährungsgruppe, P <0,05. Dies ist eine visuelle Darstellung der Ergebnisse aus Tabelle 1, die die Unterschiede in der Leber CE Inhalt der Jungfrau Ratten im Vergleich zu den schwangeren Ratten verschiedenen Diäten gefüttert die gleichen Diäten zugeführt. Unterschiede können in jeder Nahrungsgruppe zwischen den Jungfrau und trächtige Ratten gesehen werden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Tabelle 1. Die Fettsäurezusammensetzung von Rattenlebercholesterinestern der Jungfrau und schwangere Ratten experimentellen Diäten. Werte sind Mittelwerte (SD), n = 6. ND zeigt nicht erkannt (im Mittel <0,1%). Bedeutet ohne gemeinsamen Brief innerhalb Jungfrau oder trächtige Weibchen unterscheiden, P <0,05. * Sich von jungfräulichen Weibchen innerhalb abgestimmte Ernährungsgruppe, P <0,05. Diese Tabelle zeigt die Durchschnittswerte der n-3-und n-6-Fettsäuren in der Leber Gewebe der Jungfrau und trächtige Ratten wenn gefüttert niedrigen und unterschiedlichen fettreichen Diäten vorhandenen Säuren. Die Ergebnisse wurden statistisch durch eine Varianzanalyse (ANOVA) mit einem Signifikanzniveau von p <0,05 für Differenzen zwischen Jungfrau und trächtige Ratten analysiert, die Art der Ernährung und Diät x Schwangerschaft Interaktion. ANOVA Ergebnisse legen nahe, gibt es erhebliche Unterschiede in der Höhe der Arachidonsäure (20:4 n-6) zwischen Jungfrau und trächtige Ratten in matched Ernährungsgruppen.
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Discussion
Gas-Chromatographie ist eine genaue Technik, um für die Fettsäureanalyse zu verwenden, und die hohe Reproduzierbarkeit hält diese Technik für die klinische Analysen. Falls GC-Säulen verwendet werden, um die Identifizierung der Fettsäuren von Interesse zu ermöglichen, die verfügbaren Spalten mit Variationen in der Polarität der stationären Phase, Säulenlänge und Innendurchmesser. Die Verwendung einer Quarzglas-Kapillarsäule in dieser Analysemethode eine gute thermische Stabilität und eine hohe Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten aufgrund seiner hohen Oberfläche und guter Auflösung Inertheit 8.
Kritische Schritte innerhalb dieses Protokolls sind untere und obere Phase Sammlung Schritte (Protokoll Schritte 2.7 und 4.8). Es ist wichtig, dass so viel von der richtigen Phase ist wie möglich, ohne eine Kontamination mit einem unerwünschten Phase gesammelt. Das Vorhandensein von Kontaminanten in einer Probe wird in einer unerwünschten chromatographische Ausgabe führenWie in Fig. 2 dargestellt. Beim Sammeln von CE während SPE ist es unerlässlich, dass die Patronensäulen mit Lösemittel (Schritt 3.15) nach den Waschungen mit Hexan, um sicherzustellen, die Probe die Säule für eine erfolgreiche Trennung der CE von TAG ermöglichen dringt gesättigt gehalten werden. Die weitere Trennung von CE auf freies Cholesterin zu entfernen, ist wichtig, um eine Kontamination zu vermeiden, auf Chromatographen Spuren erscheinen, wie in Fig. 1 dargestellt. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen Schritte Entfernung von Flüssigkeit unter Vakuum erfordern, genau so die gesamte Flüssigkeit vollständig aus der Säule entfernt, um eine gute Ausbeute zu gewährleisten gefolgt.
Die wichtigste Einschränkung der GC ist, dass komplexe Lipide wie Phospholipide und triacyglycerols müssen vor der Derivatisierung zu FAME vor der Analyse bilden verseift werden, so dass Informationen über die spezifischen Strukturen dieser Lipide und typische Kombinationen von Fettsäuren ist 10 verloren. Alle Schritte inDieses Protokoll muß in einer Abzugshaube durch den Einsatz von Lösemitteln, die die Eignung der Umgebung dieses Verfahren kann sich dieses Verfahren durchgeführt werden, durchgeführt werden können, begrenzt auch zeitaufwendig für die Analyse einer kleinen Anzahl von Proben, typischerweise unter zwei Arbeitstagen von Probe von Interesse, die Datenausgabe zu erhalten, es sei denn, vollautomatische Verfahren verwendet werden. Wenn jedoch die Verarbeitung großer Probenzahlen, wobei jede Stufe kann in Chargen durchgeführt, um Zeit Wirksamkeit dieser Technik und die Verfügbarkeit von Geräten an andere Benutzer zu maximieren. Bestimmte Techniken innerhalb des Protokolls erfordern Übung und Geschicklichkeit, wie obere und untere Phasenextraktionen (Schritte 2.7 und 4.8), was ein Problem für Menschen mit problematischem oder die Gelenke sind anfällig für negative Auswirkungen von wiederholenden Bewegungen sein könnte.
Schritte in diesem Verfahren können leicht hinzugefügt oder entfernt werden, um die Sammlung der verschiedenen Fraktionen zu erleichtern für eine Vielzahl von Probens, beispielsweise PE-Auffang möglicherweise nicht erforderlich, wenn die Analyse-Plasma, ist jedoch von Interesse in Zell-und Gewebeproben 10. Dieses Verfahren kann auch für die Analyse von Zellen des Gesamtlipidextrakte, die SPE Schritte können auf Wunsch weggelassen werden, modifiziert werden. Eine solche Veränderung ist, dass für rote Blutzellen, die die Gesamtlipidextraktionsschritt weggelassen sowie SPE Schritte 15 beschrieben. Im Gegensatz zu dem aktuellen Protokoll, das in dieser Studie verwendete Verfahren benutzt 250 ul Methylierungreagens (14% Bortrifluorid), die zusammen mit 250 &mgr; l Hexan und 10 Minuten bei 100 ˚ C erhitzt direkt an Erythrozyten zugegeben wird Der Neutralisationsschritt weggelassen und stattdessen Wasser und Hexan zugesetzt, die Probe wird dann zentrifugiert und die obere Phase Hexan gesammelt und direkt in ein GC-Autosampler Fläschchen überführt, ohne Trocknen unter Stickstoff und Wiederauflösen in Hexan.
GC ist eine vielseitige Methode und bietet reliable Ergebnisse mit einer Reihe von verfügbaren Modifikationen 15 und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Proben zu analysieren. Es hat Vorteile gegenüber der Massenspektrometrie (MS) bei der Analyse von n-6 und n-3-Fettsäure-Stoffwechsel, wie es ist in der Lage, zwischen strukturell ähnlichen Fettsäuren zu unterscheiden, wie sie verwendet Retentionszeit für die Markierung im Gegensatz zur Atommasse. MS ist in der Lage, Fettsäuren innerhalb einer Probe zu identifizieren, aber nicht in der Lage Doppelbindung Positionen in Stereoisomere unterscheiden und daher nicht in der Lage, bestimmte Fettsäuren auseinander. Bei Bedarf können beide Methoden im Tandem durch GC-MS 16 verwendet werden. Diese Technik wird im Rahmen der Untersuchung in den Lipidstoffwechsel und Funktion im Bereich der lipidomics eingesetzt. Die Verwendung von GC im Tandem mit MS hat zu großen Fortschritten geführt, da es ermöglicht die Manipulation von Fettsäure Identifizierung durch die Verwendung von verschiedenen stationären Phasen in GC zwischen Fettsäuren zu unterscheiden, die allein MS nicht. GC kann auch in Kombination mit Elektronenstoß-Massenspektrometrie verwendet werden,(EI-MS), die für die Identifizierung der Fettsäuren ermöglicht, wenn sie mit alternativen chemischen Derivate wie Ester Picolinyl kombiniert werden. Dies erweitert den Einsatz der Technik und ist weiterhin Lipid Profilierung als Forschungsmethode in einer Reihe von Bereichen wie Physiologie, klinische Nachweis von Biomarkern und Pathologie sowie Lipid-Biochemie 17 zu verbessern.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten den Beitrag von Meritxell Romeu-Nadal in die Studie an Ratten bestätigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Chloroform | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| BHT | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns - 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns - 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas - explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6 mm |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 |
References
- Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
- Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
- Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
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