Summary
Drosophila melanogaster sind nützlich bei der Untersuchung genetischer oder umwelt Manipulationen, die Verhaltensweisen wie spontane Bewegungsaktivität beeinflussen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Monitore mit Infrarot-Strahlen und Datenanalyse-Software, um die spontane Bewegungsaktivität zu quantifizieren nutzt.
Abstract
Drosophila melanogaster als Modellorganismus eine hervorragende Umwelt-und genetischen Manipulationen, die das Verhalten beeinflussen studieren verwendet. Ein solches Verhalten ist spontane Bewegungsaktivität. Hier beschreiben wir unser Protokoll, Drosophila Population überwacht und ein Verfolgungssystem, das eine kontinuierliche Überwachung der spontanen lokomotorischen Aktivität von Fliegen können für mehrere Tage in einer Zeit verwendet. Dieses Verfahren ist einfach, zuverlässig und objektiv und kann verwendet werden, um die Auswirkungen des Alterns, des Geschlechts, Änderungen der Kaloriengehalt von Lebensmitteln, Zugabe von Drogen oder genetische Manipulationen, die menschliche Krankheiten nachahmen untersuchen.
Introduction
Fruchtfliegen, Drosophila melanogaster, sind als wertvolle Modellorganismus, um Mechanismen, die komplexe Verhaltensweisen, wie Lernen und Gedächtnis, soziale Interaktion, Aggression, Drogenmissbrauch, Schlaf, sensorische Funktion, Balz, Paarung und 1,2 studieren verwendet. Ein Verhalten, das durch mehrere Protokolle untersucht worden ist, ist die spontane Bewegungsaktivität. Negative Geotaxis war eines der ersten Verfahren zur Messung Drosophila Aktivität entwickelt, und dieses Protokoll beinhaltet die Messung des Prozentsatzes der Fliegen, die eine bestimmte Höhe der Flasche zu erreichen, nachdem Fliegen wurden auf den Boden des Behälters 1,3 geschüttelt. Dieses Verfahren hat Vorteile, einfach, kostengünstig, und da es keine spezielle Ausrüstung kann in jedem Labor durchgeführt werden müssen. Es hat sich als ein wertvolles Screening-Werkzeug, um Effekte von verschiedenen genetischen Manipulationen auf Fliege Mobilität 3 Studie verwendet worden. Es ist jedoch zeit-und arbeitsintensiv einnd hat die Möglichkeit der Verzerrung durch variable Schütteln der Fläschchen und Menschenaufnahmen.
Die negative Geotaxis Verfahren wurde auf durch Entwicklung der Negative Geotaxis (RING)-Methode Schnelle Iterative 4,5, die Fotografien der Fliege Ampullen nach Schütteln der Fliegen auf den Boden nimmt verbessert. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Empfindlichkeit und die Möglichkeit zum Testen einer Vielzahl von Flug Fläschchen gleichzeitig. Allerdings hat dieses Protokoll immer noch die Potenzial für menschliche Fehler und misst nur negativ Geotaxis. Andere Laboratorien haben einfache Beobachtung in Kulturfläschchen verwendet werden, um die Bewegungsaktivität 6 zu bestimmen.
Kürzlich mehrere Videoaufzeichnungssystemen zur Messung der Bewegungsaktivität fly entwickelt worden. Eine Videoüberwachungsprotokoll bietet Zeit für die Einstellung vor der Aufnahme 7. Die von Slawson et al. Verwendet auch eine Luftimpuls auf movemen stoppent bis zum Beginn der Aufzeichnung, die potentiell ein Stressor den Tieren 7 sein könnte. Diese Methode liefert Informationen über Durchschnittsgeschwindigkeit, Höchstgeschwindigkeit, Zeit in Bewegung, etc. Ein weiteres dreidimensionales Tracking-System misst die maximale Geschwindigkeit der einzelnen Fliegen bei ~ 0,2 Sekunden des freien Fluges 8 Start. Ein dreidimensionales Videoüberwachungsprotokoll verwendet Linie, die GFP und mehrere Kameras mit Filtern und somit die Detektion der Fluoreszenz zu fliegen Mobilität 9 bestimmen ausgerüstet. Fliegen in diesem Protokoll sind in der Regel zylindrisch Flugmuster, die potentiell durch die Form von Drosophila Kulturgefäße 10 aufweisen. Dieses Verfahren wurde mit einer Kuppel, die Messung spontaner Bewegung von zwei Fliegen 11 kann verbessert werden. Eine Hochdurchsatz-Verfahren, das eine Kamera verwendet, um automatisch zu überwachen und zu quantifizieren, die individuelle und soziale Verhalten von Drosophila ist ebenfalls beschrieben 12 gewesen. Zou etal. entwickelten eine Verhaltens Monitor-System (BMS), die zwei computergestützten Kameras verwendet, um Verhalten und Lebensdauer Bewegungen wie Ruhe aufzunehmen, bewegen, fliegen, Essen, Trinken, oder Tod von einzelnen Tephritiden Fruchtfliegen 13. Mehrere andere Video-Systeme wurden entwickelt, um Fliegen 14,15 Verhaltensaktivität überwachen.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Quantifizierung von Drosophila Aktivität, die Bevölkerung Monitoren verwendet. Diese Monitore sind in der Temperatur-und Feuchte-kontrollierten Inkubatoren bei 25 ° C auf einem 12-stündigen Tag-Nacht-Lichtzyklus untergebracht. Jede Population Monitor hat Infrarotstrahlen in Ringen in drei verschiedenen Höhen angeordnet war. Jedes Mal, wenn eine Fliege in die Ringe bewegt er den Infrarotstrahl, der von einem Mikroprozessor unabhängig Datensätze erfasst und zählt die Aktivität des in der Phiole entfernt bricht. Ein Mikroprozessor lädt die Gesamtaktivität in dem Fläschchen mit dem Computer in benutzerdefinierten intervals das könnte von 1 Sekunde bis 60 Minuten variieren. Das hier beschriebene Verfahren bietet ausreichend Zeit entfernt, um an die neue Umgebung anpassen und ermöglicht die gleichzeitige Messung der spontanen lokomotorischen Aktivität von nicht weniger als 120 Populationen entfernt. Zusätzlich beschreiben wir, Zubereitung der Speisen, fliegen Wartung, Einrichtung der Mobilität Bevölkerung Monitore in temperaturgesteuerten Inkubatoren und potenziellen Faktoren, die die Ergebnisse beeinflussen können. Diese Methode kann verwendet werden, um zu untersuchen, wie die verschiedenen Umwelt-oder genetische Veränderungen beeinflussen spontane Bewegungsaktivität der Fliegen werden.
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Protocol
Hinweis: Die Canton-S-Stamm ist der Standard von der Bloomington Stock Center-Wildtyp-Hintergrundlinie.
1. Lebensmittelzubereitung und Rezept für 1000 ml Nahrung
Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt das Protokoll für die Zubereitung von Speisen. Große Metall-Töpfe verwendet werden, um etwa 18 L von Lebensmitteln zu einer Zeit vorzubereiten. Das hier beschriebene Protokoll verwendet wird verkleinert und 1000 ml H 2 O. Das Essen wird zweimal autoklaviert.
- Mischen Sie 113 g Saccharose und 28 g Bierhefe in 643 ml Wasser. Lassen Zutaten auf einer heißen Platte Satz bei 25 ° C mit einem Rührstab in der gesamten 15 Minuten mischen.
- Autoklav Lebensmittel-Lösung für 20 min.
- Mischen Sie 49 g Maismehl und 8,1 g Agar-Agar in 268 ml Wasser und fügen Sie zu dem in Schritt 1.2 beschrieben autoklaviert Futtermischung. Gut mischen mit einem großen Löffel oder einem Schneebesen.
- Autoklav Futtermischung für weitere 20 min.
- Legen Sie das Essen auf einem Teller abkühlen lassen und unter ständigem Mischen mit einem Rührstab. Ichf zusätzliche Lösungen sollten Lebensmittel wie Mifepriston (RU486) hinzugefügt werden, halten Sie die Speisen auf einer heißen Platte bis auf 60 ° C eingestellt und fügen Lösung, wenn das Essen die erforderliche Temperatur erreicht hat.
- Lösen Sie 2,4 g tegosept in 10,7 ml 100% EtOH und auf eine kalte Platte zu halten mit einem Rührer vollständig auflösen und mischen Sie für ca. 15 min.
- In tegosept Lösung auf Nahrung, wenn die Temperatur der Lebensmittel ist 60 ° C und gut mischen.
- Verwenden einer Pumpe oder eines Futterspender zu etwa 10 ml der Nahrung in einer großen Fläschchen gießen. Durch die Verwendung eines Futterspender kann man Lebensmittel gleichzeitig in 100 breit, Kunststofffläschchen (1 Fach) zu einem Zeitpunkt, zu gießen.
- Decken Sie die Röhrchen mit Kimwipes und Käse Tuch und lassen Sie Lebensmittel bei Raumtemperatur für 12-24 Stunden abkühlen. Halten Sie das Essen bei 4 ° C lagern und innerhalb von 3-4 Wochen. Wärmen Sie die Lebensmittel auf Raumtemperatur vor der Verwendung für Fliegen Arbeit.
2. Herstellung von Glasflaschen
- Zubereitet wird nach der in Schritt 1 genannten Protokolls. Aliquot von 5 ml Nahrung in jeder Schmal, Glasfläschchen, die die richtige Größe für die Bevölkerung Monitoren. Diese Menge an Nahrung sollte niedrig genug, um unter der niedrigsten Ring der Bevölkerung Monitor sein.
- Nachdem das Essen kühlt auf Raumtemperatur decken die Fläschchen mit Schwamm Stecker und halten Sie sie bei 4 ° C bis zu 2 Wochen. Da die Menge der Nahrung in einem Glasfläschchen eher gering ist, ist es am besten, um das Essen in ein oder zwei Wochen nutzen, um das Eintrocknen verhindern.
- Warm up die Fläschchen auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch.
3. Wartung der Kinder Flies
- Wachsen die Fliegen im breiten Kunststofffläschchen mit Standard-Labor Essen und halten die Fläschchen in einer feuchten, temperaturgesteuerten Klimakammer bei 25 ° C auf einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus. Die Tageslichtzeit beginnt um 6:00 Uhr in diesem Labor.
- Am Morgen klar Erwachsenen fliegt von den Ampullen aus dem Eltern Fliegen werden nicht erhoben.
- Sammeln Sie neu geschlüpften flies und trennen sie nach Geschlecht auf eine CO 2-Pad innerhalb von 8 Stunden nach dem Schlüpfen, um sicherzustellen, dass die weiblichen Fliegen sind Jungfrauen. Fliegen beginnen zu 8 Stunden nach dem Schlüpfen paaren.
- Wenn die Jungfrau männlichen und weiblichen Fliegen sind zwischen 5 und 10 Tage alt, legte 10 männliche und 10 weibliche Fliegen in einem Fläschchen mit Standard-Lebensmittel einige Stückchen aktive Hefe an der Spitze.
Hinweis: Steuern der Dichte der Larven unter Verwendung der gleichen Anzahl von entfernt und sie in einer Ampulle für zwei Tage. Die Zugabe von Hefe fördert aktiv die Eiererzeugung. - Halten Sie die Fliegen um sich zu paaren und Eier zu legen in einem temperaturgesteuerten Klimakammer bei 25 ° C mit einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus für 2 Tage. Richten Sie 5-10 Fläschchen der elterlichen Fliegen.
- Übergeben Sie die Fliegen zu einem neuen Kunststoffröhrchen jeden zweiten Tag und halten die Fläschchen mit den Eiern in einem Brutschrank bei 25 ° C
4. Sammlung von Experimental Fliegen
- Nach 9 Tagen entfernt werden beginnen, aus den Fläschchen schlüpfen, wo der Parental Fliegen Eier gelegt (in Schritt 3.6 beschrieben.). Klar und entsorgen Sie die Fliegen, die während des ersten Tages geschlüpften und zurück, um die Fläschchen Inkubator. Die meisten der Fliegen am Tag 1 geschlüpften Weibchen sind. Eine synchronisierte Population von Fliegen werden an Tag 2 schlüpfen.
- Innerhalb von 24 h Ort neu geschlüpften Fliegen auf CO 2-Pads und sammeln 25 männliche und 25 weibliche Fliegen pro Fläschchen mit einem Pinsel oder Metalllöffel. Halten Sie Fliegen auf CO 2 Pads für eine kurze Zeit, um alle Auswirkungen von CO 2 zu minimieren. Notieren Sie sich den Tag des Schlüpfens auf dem Fläschchen. Bauen Sie mindestens 5 Wiederholungs Fläschchen für Versuche und für Kontrollgruppen.
- Die Durchstechflaschen in temperaturgesteuerten Klimakammern bei 25 ° C mit einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus.
- Übergeben Sie die Fliegen zu einem neuen Kunststoffröhrchen jeden zweiten Tag mit einem Trichter.
- Altern die Fliegen, bis die gewünschte Alters für Experimente erreicht ist.
5. Einrichten der Mobility-Monitore
- Legen Sie diePopulation überwacht in einem temperaturkontrollierten Inkubator.
- Verbinden Sie jeden Monitor mit einer 4-Draht Telefonkabel an die Stromversorgung Interface Unit (PSIU) über 5-Wege-Verteiler (Multiline), die bis zu 5 verbinden einzelne Monitore mit einer Öffnung in der PSIU. Siehe 1A und 2B.
- Schließen Sie das PSIU zu einer Linie Steckdose (100-240 V). Stecken Sie den Netzstromanschluss in einem der 2 Gegen PSIU-Buchsen. Das angrenzende grüne Licht leuchtet grün, wenn richtig angeschlossen.
- Schließen Sie das PSIU dem Universal Serial Bus (USB)-Hardware. Verbinden Sie das USB-Kabel zwischen dem USB-Hardware mit einem Macintosh-oder Windows-PC für die Datenaufzeichnung. Am besten wäre es, einen Computer nur für die Datenerhebung gewidmet haben, da Sammlung läuft seit Tagen auf einmal.
- Laden Sie die USB-Software (PSIUdrivers.zip). USB-Treiber-Software wird von der Power Supply-Schnittstelle verwendet und muss nur einmal heruntergeladen werden. Es synthetisiert einDatenverbindung zwischen dem Computerprogramm und den PSIU / Aktivitätsmonitore. Für einen PC-Nutzung und ein COM-Port für einen Macintosh verwenden eine einfache serielle Schnittstelle.
- Laden Sie das Computer-Programm für Macintosh OSX (Intel) oder für Windows PC (XP/Vista/7) Programme, die von folgenden von der Hersteller Hinweise 308.pdf Verfügung gestellt.
- Starten Sie den Computer-Programm und stellen Sie das Programm, indem Sie auf den Einstellungen, Leuchten oder Monitore. Das Programm läuft bis der Benutzer "quit", um das Programm zu stoppen. Wenn das Computer-Programm oder der Computer heruntergefahren wird die Monitore werden weiterhin Strahlunterbrechungen zählen, aber die zählt nicht aufgezeichnet, bis das Programm neu gestartet werden. In diesem Fall wird die erste Lesung enthalten alle zählt seit dem letzten Mal die PSIU schickte die Daten an den Computer.
- Wählen Sie die Registerkarte Einstellungen und wählen Sie das Serial Port, PSIU für Macintosh und COM für den PC.
- Wählen Sie das Intervall, das Lesen von Sekunden reicht, Minuten oder eine Stunde. <li> Wählen Sie die Monitore: Jeder Monitor hat seine eindeutige Nummer, die vom Hersteller angegeben wird. Wählen Sie die Monitor-Range, zu den Zahlen auf die Monitore des Herstellers entspricht.
- Die Lichter Feld: Stellen Sie sicher, dass alle Monitore ordnungsgemäß angeschlossen sind, die durch eine grüne Licht neben der Monitornummer auf der Software markiert. Ein rotes Licht zeigt an, dass die Verbindung unterbrochen wird, und eine Black Box zeigt an, dass das System ausgeschaltet ist oder nicht richtig eingerichtet.
6. Einrichten des Experiment
- Entfernen Sie Lebensmittel, die Glasflaschen von 4 ° C und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen.
- Separate männlichen und weiblichen Fliegen im gleichen Alter auf CO 2-Pad. Zur Alterung Studien ist es möglich, Mobilitätsstudien schon nach 3 Tagen Alter beginnen.
- Setzen Sie 10 oder 10 männlich weibliche Fliegen in jedes Glasfläschchen haltige Speisen. Verwenden Sie mindestens drei Flaschen von jeder experimentellen und Steuerleitung von Fliegen und für jedes Geschlecht.
- Halten Sie den viALS auf ihrer Seite entfernt, bis die Wiederherstellung von CO 2, die entfernt sind, keine in der Lebensmittel stecken. Separate Fliegen bei etwa 8.00 und lassen sie für ca. 2 Stunden bei Raumtemperatur von CO 2 zu erholen.
- Die Durchstechflaschen im Inneren der Bevölkerung Monitore in den Gründerzentren untergebracht.
- Entsorgen Sie die innerhalb der ersten 24 Stunden nach der gesammelten Daten die Fliegen in den Inkubator stellen sie an die neue Umgebung anpassen können.
- Übergeben Sie die Fliegen nach 3 oder 4 Tage für neue Fläschchen, um das Trocknen der Lebensmittel zu vermeiden. Wenn Fliegen sind anfällig für Tod oder Alter sind 40 Tage oder älter, übergeben Sie die Fliegen nach 2 Tagen und Nutzungsdaten für Tag 2 gesammelt. Auch nutzen mehr als drei Fläschchen pro Gruppe, um eine ausreichende Wiederholungen zu gewährleisten. Daten aus Flaschen mit toten Fliegen sollte ignoriert werden und nicht in der Analyse enthalten.
7. Ausführen der Aktivität Monitore und Berechnung des Gesamt spontane Aktivität
- Präferenzen wählen - das Intervall für die Datensammlung <.br /> Hinweis: Das Computerprogramm ermöglicht das Erfassen der Daten in Intervallen von 1 Sekunde bis 60 Minuten. 10 und 30 Minuten-Perioden gefunden, um angemessene Informationen über Mobilität, ohne dass eine überwältigende Anzahl von Zeitpunkten zu liefern. Bei den ausgewählten Zeitraum, wird das Programm die aktuelle Gesamtzahl für jeden Monitor zu senden an den Computer und beginnen wieder von Null zu zählen. Das Computerprogramm speichert die Daten in einem neuen Ordner durch den Computer-Daten-System. Die in jedem Monitor gesammelten Daten werden separat gespeichert und einzelne Textdokumente für jedes Fläschchen hergestellt. Die Daten werden kontinuierlich gesammelt, solange das Programm arbeitet.
- Am Ende des Experiments, scannen Sie die Daten mit Hilfe der FileScan110X für Macintosh OSX (Intel) oder SystemMB108 für Windows PC-Programm (XP/Vista/7).
Hinweis: Die Scan-Programm eliminiert doppelte Lesungen und stellt sicher, dass die Aufnahmen abgeschlossen sind. - Speichern Sie die innerhalb einer bestimmten Zeit und p gesammelten DatenEITRAUM von Tagen. Wählen Sie eine experimentelle Namen und kopieren Sie die Dateien vom Computer Datenordner für die Analyse.
Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt kann die Aktivität Abständen geändert und verschiedene, umgewandelt werden. Die Originaldaten werden in der Computerdaten-Ordner gespeichert und kann bleiben, solange sie nicht gelöscht werden abgerufen werden.
8. Datenanalyse
- Kopieren Sie die in der Textdateien gesammelten Daten in Spalten der Excel-Tabellen für die Datenanalyse. Von dieser Software gesammelten Daten sind in Spalten, die Zahlen, die Gesamtaktivität in einem einzigen Monitor über einen Zeitraum von Zeit, die der Prüfer ausgewählt enthalten.
Hinweis: für jeden Monitor gesammelten Daten sind in separaten Textdateien. Es gibt 32 Spalten für jeden Monitor. Die ersten sechs Spalten sind leer und enthalten nur 0; nächsten drei enthalten die am unteren Ring erhobenen Daten, in der Mitte und am oberen Ring. Der Rest der Kanäle können gelöscht werden, da sie keine Daten enthalten. Jeder Ring gibt einEinzelwert pro Zeit. Siehe Screenshot der Rohdaten in Abbildung 2. - Berechnung des Gesamtaktivität innerhalb einer gewünschten Zeit für jeden Monitor, der die Summe der Aktivität in drei verschiedenen Höhen von Infrarotstrahlen gesammelt darstellt.
Hinweis: Der Zeitraum kann von einigen Stunden, 24 Stunden oder mehrere Tage reichen. - Bestimmen Sie den Mittelwert der Bewegungsaktivität und die Standardabweichung zwischen den drei Monitoren, die drei biologischen Replikate zu vertreten.
Anmerkung: Die Daten können für statistische Signifikanz unter Verwendung einer Reihe von Tests untersucht werden. Eines zweiseitigen Students-t-Test, eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) und einem Tukey HSD post-hoc-Test verwendet werden könnten, um die Auswirkungen der verschiedenen Umwelt-oder genetische Manipulationen auf 24 Stunden spontane Bewegungsaktivität 16 zu bestimmen. Es gibt eine Anzahl von anderen Programmen, die verwendet werden können, und sind zuvor veröffentlicht worden 17.
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Representative Results
Die spontane Bewegungsaktivität bei Drosophila Fliege hängt von Geschlecht (3A), Kaloriengehalt der Nahrung (3B) und der Hell / Dunkel-Zyklus. Sobald das Licht ausgeschaltet fly Aktivität dramatisch abnimmt. 3A veranschaulicht von 24 Stunden nach der Bewegungsaktivität Aufnahmen von männlichen und weiblichen Fliegen. Ein Stern auf der x-Achse markiert den Zeitpunkt, wenn das Licht ausgeschaltet wurde und der Übergang zum Dunkel-Zyklus. 3B zeigt die Standardabweichung zwischen dem durchschnittlichen spontane Bewegungsaktivität in drei Monitore für männliche Bevölkerung gesammelt fliegt Alter 3 Tage auf Mais-Essen. Die für die spontane körperliche Aktivität während der 24 Stunden gesammelten Daten können auch als die Gesamtaktivität pro Fliege während eines Zeitraums von 24 Stunden, 3C ausgedrückt werden.
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Abbildung 1:.. Bevölkerung Monitor-Setup für die Überwachung der spontanen Bewegungsaktivität der Fliegen A) Mehrere Bevölkerung Monitore sind mit einem 4-Draht Telefonkabel mit 5-Wege-Splitter verbunden und in einem temperaturgeregelten Inkubator B) Höhere Vergrößerung von zwei Bevölkerungs Monitore, die Platzierung der Fläschchen innerhalb der Bevölkerung überwacht und drei Ringe mit Infrarot-Strahlen in drei verschiedenen Höhen positioniert zu zeigen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 2: Screenshot der Rohdaten durch die so erzeugtenftware zeigt Datum, Zeit und Daten in Ringe 1, 2 gesammelt und drei. R steht für Ring. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 3: A) Durchschnittliche spontane Bewegungsaktivität der männlichen (Schwarz) und weiblichen (Magenta) fliegt während 24 Stunden auf Standard-Labor Ernährung. Die Daten werden in 10-Minuten Behälter gesammelt und sind durchschnittliche Aktivität pro fly zwischen drei Fläschchen mit je 10 Fliegen. B) Durchschnittliche spontane Bewegungsaktivität der männlichen während 24 Stunden auf Standard-Labor Ernährung fliegt berechnet als durchschnittliche Aktivität. Die Daten werden in 10-Minuten Behälter gesammelt und sind durchschnittliche Aktivität pro fly berechnet als durchschnittliche Aktivität zwischen three Fläschchen. Die Standardabweichungen sind grün markiert. C) Die Gesamtaktivität von 20 Tagen alten männlichen fliegt auf kalorienarme (0,5-fach) (Grün) und kalorienreiche (1.5X) (Brown) Nahrungsmittel über 24 Stunden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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Discussion
Spontane Bewegungsaktivität der Fliegen wird von vielen Faktoren wie Alter, genetische Hintergrund und Geschlecht 2,13,18,19 beeinflusst. Außerdem können Umweltfaktoren wie Kaloriengehalt des Nahrungsmittels, der Temperatur der Umgebung, die Zugabe von verschiedenen Medikamenten, und Tag / Nacht-Lichtzyklus fly-Aktivität beeinflussen. Zum Beispiel männlichen Fliegen im gleichen Alter haben eine höhere spontane körperliche Aktivität im Vergleich zu Frauen (Abbildung 1). Daher sollte entfernt im gleichen Alter und Geschlecht miteinander verglichen werden. Bei der Untersuchung der Wirkung von genetischen Manipulationen auf Fly Aktivität, wie Überexpression oder Verlust der Funktion eines bestimmten Gens, müssen die Versuchs-und Kontrolllinie in der gleichen genetischen Hintergrund sein, um mögliche Auswirkungen der unterschiedlichen genetischen Hintergrund oder zweiten Standort Modifikatoren entfernen. Dies kann durch Rückkreuzung experimentellen weibliche Fliegen zu w 1118 oder yw Männchen für 10 Generationen erreicht werden. Nach 10Generationen von Rückkreuzung w 1118 oder yw entfernt könnte als genetische Kontroll verwendet werden. Ein weiterer Weg, um für den genetischen Hintergrund zu steuern, um die induzierbare GAL4 Geneswitch (GAL4-GS)-UAS binären System, das ermöglicht den Einsatz Expression oder Down-Regulation (RNAi) des Gens von Interesse in einer Zeit-und Gewebe-spezifische Weise in Fliegen mit der Zugabe von Mifepriston (RU486) 20,21 Nahrung gefüttert. RU486 ist notwendig für GAL4 zur Dimerisierung und an die UAS-Sequenz binden. Genetische Kontrollen Geschwister Fliegen gehalten auf Lebensmittel mit Zusatz von EtOH (RU486 Verdünnungsmittel).
Verschiedene Verfahren wurden verwendet, um Drosophila Mobilität aufzunehmen. Die hier beschriebene Methode ist einfach, zuverlässig, informativer und weniger Verzerrungspotential im Vergleich zu anderen Methoden verwendet, um zu bestimmen, Drosophila Mobilität wie negativen Geotaxis. Es hat den Vorteil der gleichzeitigen Ziel Aufnahme mehrerer Populationen von Fliegen für einen langen Zeitraum inStandardkulturbedingungen. Messung der Bewegungsaktivität, indem Bevölkerung Monitore können für die Untersuchung, wie verschiedene Kalorien Inhalt der Nahrung beeinflussen fly Aktivität oder um genetische Mechanismen auf die CR-16 zugrunde liegenden erhöhte Aktivität von Fliegen zu studieren. In ähnlicher Weise wurde dieses System verwendet, um die Effekte von verschiedenen genetischen Mutationen, Alterung oder der Zugabe verschiedener Medikamente auf Fliege spontane körperliche Aktivität zu studieren. Verwendung von einzelnen Rohren statt Bevölkerung Monitoren ermöglicht Mess H 2 O 2-Beständigkeit in verschiedenen Genotypen von Fliegen, studiert zirkadianen Rhythmen in vivo analysiert Schlafverhalten und andere 17,22-24.
Wie jede Methode, gibt es Einschränkungen bei dieser Kontrollsystem. Bei der Überwachung entfernt für eine lange Zeitdauer gibt es ein Potential für Fliegen Tod, insbesondere bei Verwendung von gealtertem entfernt. Mit nur gesunde Fliegen werden dies zu verhindern. Wir versuchen auch, mehr als 3 biologische Replikate pro verwendenGruppe, wenn die Fliegen sind alt oder anfällig für Sterben. Eine Lösung ist, entfernt nur für 2 Tage in den Mobilitäts überwacht und die Verwendung von Daten während Tag 2 gewonnen, zu halten, nachdem entfernt wurden an die Umgebung angepasst. Wenn der Tod eintritt wir nicht verwenden, die für die Fläschchen in Berechnungen gesammelten Daten. Obwohl wir haben mit Fläschchen nur vertikal in den Aktivitätsmonitore Trikinetics positioniert, gibt es eine Möglichkeit, um die Fläschchen horizontal zu platzieren. Wir wählen Fläschchen vertikal statt, weil das Essen ist an der Unterseite der Flasche, die ähnlich wie Standard-Inkubator Kulturbedingungen ist. Dies ermöglicht Fliegen, um mehr Platz auf und ab gehen die Fläschchen haben, und es mehr ähnlich negativen Geotaxis Experimente ist. Die Feuchtigkeit der Inkubator sollte auch überwacht werden, wenn Nahrung Austrocknung zu einem Problem wird 24. Dieses System liefert Daten in Bezug auf die durchschnittliche Aktivität und keine spezifischen Informationen über die Art der Aktivität. Darüber hinaus, wenn zwei Fliegen überqueren den Strahl in der gleichen Zeit, will nur als eine Unterbrechung aufgezeichnet werden. Das hier beschriebene Protokoll ist für die Gesamtaktivität zu quantifizieren, aber auch andere Protokolle könnte nützliche Hinweise liefern, wenn genauere Informationen wie Flugbahn oder Geschwindigkeit gewünscht 12,14,25.
Nach diesem Experiment werden Unterschiede in der spontanen Bewegungsaktivität auf genetische oder Umwelt Manipulationen bekannt sein. Eine zukünftige Änderung dieses Protokoll könnte es sein, die verschiedenen Ebenen der Aktivität von Fliegen an der oberen, mittleren und unteren Ringen der Bevölkerung überwacht analysieren. Dies würde zu bestimmen, ob die Fliegenpopulationen verbringen die meiste Zeit am Boden des Fläschchens in der Nähe des Nahrungsmittels oder an der Spitze. Das Protokoll in seiner jetzigen Form ermöglicht eine präzise, simultane Quantifizierung der spontanen motorischen Aktivität von Drosophila Versuchs-und Kontrollgruppen.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (AG023088 BR) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose FCC Food Grade 100 LB, | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90471380 | |
| Brewer’s Yeast | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90331280 | |
| Drosophila Agar Fine | SciMart | DR-820-25F | |
| Cornmeal | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90141125 | |
| Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept | Sigma | H5501-5KG | |
| EtOH | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Active Dry Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Fly CO2 pad | LabScientific | BGSU-7 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | |
| Drosophila carbon dioxide (CO2) tank | Airgas | UN1013 | |
| Small paint brush for pushing the flies | |||
| Shell vial wide | Fischer Scientific | AS519 | |
| Buzzplugs for wide plastic vials | Fischer Scientific | AS275 | |
| Glass vials (25 x 95 mm) | Fischer Scientific Kimble 60931-8 | AS-574 | |
| Sponge plugs for glass vials | SciMart | DR-750 | |
| Drosophila Food Dispenser | Applied Scientific (Fischer Scientific) | AS780Q | |
| DPM Drosophila Population Monitor | Trikinetics Inc. | ||
| DC Power Supply with line cord | Trikinetics Inc. | ||
| PSIU9 The Power Supply Interface Unit | Trikinetics Inc. | ||
| Telephone cables and 5 way splitters | Trikinetics Inc. | ||
| Universal Serial Bus (USB) hardware | Trikinetics Inc. | ||
| Macintosh or Windows PC with UCB port | |||
| DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel) | www.trikinetics.com | ||
| DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7) | www.trikinetics.com |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAMFileScan108X software for Macintosh | www.trikinetics.com | ||
| DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7) | www.trikinetics.com | ||
| USB software (PSIUdrivers.zip) | www.trikinetics.com | ||
| DAMSystem Notes 308 | (http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf |
References
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