Summary
وصفنا استخدام مراسل الفلورسنت فيروس اللقاحية التي تمكن قياس الوقت الحقيقي من العدوى الفيروسية والتعبير الجيني من خلال التعبير مرحلة محددة من fluorophores مراسل متميزة طيفيا. نحن بالتفصيل طريقة القائمة على لوحة لتحديد بدقة المرحلة التي يتأثر تكاثر الفيروس ردا على تثبيط جزيء صغير.
Abstract
فيروسات الجدري هي عائلة من الفيروسات الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل التي تشمل مسببات الأمراض البشرية النشطة مثل جدري القرود، المليساء contagiousum، وفيروس Contagalo. ويشمل الأسرة أيضا فيروس الجدري، الجدري. نظرا لتعقيد تكرار الفيروسة الجدرية، العديد من الأسئلة لا تزال قائمة بشأن استراتيجيتهم التعبير الجيني. في هذه المادة ونحن تصف وضع تصور واستخدام الفيروسات اللقاحية المؤتلف التي تمكن قياس الوقت الحقيقي من مراحل واحدة ومتعددة في التعبير الجيني الفيروسي في شكل عالية الإنتاجية. يتم تمكين هذا من خلال استخدام البروتينات الفلورية متميزة طيفيا كما صحفيين لكل من ثلاث مراحل من تكاثر الفيروس. توفر هذه الفيروسات على نسبة عالية إشارة إلى الضوضاء مع الحفاظ على أنماط محددة المرحلة التعبير، وتمكين المقايسات القائمة على لوحة والملاحظات المجهرية من انتشار الفيروسات والنسخ المتماثل. هذه الأدوات لها استخدامات لاكتشاف فيروسات، ودراسات للتفاعل الفيروس المضيف، والبيولوجية التطوريةبليد الحركة.
Introduction
تقليديا، يتم درس التعبير الفيروس باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية (مثل النشاف الشمالية، النشاف الغربية، ميكروأري التهجين، الخ) 1. في حين أن هذه الأساليب هي قادرة على توفير معلومات مفصلة فيما يتعلق بتصنيف التغييرات التعبير عن mRNAs والفردية أو البروتينات، فإنها عادة ما تكون غير قابلة للعمليات في الوقت الحقيقي والإنتاجية العالية. وقد تم تطبيق النهج البديلة باستخدام صحفيين القائم على مضان سابقا عند العمل مع فيروسات الجدري؛ ومع ذلك، فقد كان الدافع تنميتها واستخدامها من قبل أهداف متنوعة. تم تصميم العديد من هذه الأساليب للاختيار من الفيروسات المؤتلف 2،3. هذه التقنيات التعبير عن EGFP عند التأسيس السليم والتعبير من الحمض النووي من الحيوانات المستنسخة الخارجية اللقاحية المؤتلف. وبالمثل، عدة سلالات اللقاحية معربا عن ثابت للذوبان EGFP أو البروتينات GFP الموسومة أعرب تحت اللقاحية المروج الأصلي قد استخدمت على نطاق واسع. هذه هي الطباعically تستخدم لتحديد دخول الفيروس وتكرارها خلال فحوصات تحييد الأجسام المضادة على أساس، وتثبيط المواد الكيميائية، أو المقارنة بين فعالية المضادة للفيروسات 4-6. في حين أثبتت هذه الفيروسات مفيدة، فهي محدودة في قدرتها على تقديم معلومات مفصلة عن وجهة تثبيط بسبب استخدامها لغامضة في وقت مبكر / متأخر المروج الفيروسية واحد. جعلت الطرق السابقة أيضا استخدام البروتين EGFP مع الإشارة إلى الضوضاء الخصائص الأمثل.
نظرا لتعقيد تكرار الفيروسة الجدرية وعدم وجود الأدوات المتوافرة لفحص التغييرات في الوقت الحقيقي في التعبير الجيني الفيروسي، وقد وضعنا مجموعة من الفيروسات واحد ومتعدد مراسل المرحلة 7،8. كما هو موضح في المنشورات السابقة، هذه الفيروسات تعبير عن واحد أو اثنين أو ثلاثة البروتينات الفلورية متميزة طيفيا من المروجين اللقاحية الأم خلال وقت مبكر، ومراحل وسيطة، أو في وقت متأخر من العدوى. هذه الفيروسات يمكن أن يكون لناإد كمؤشرات للفيروس التقدم النسخ المتماثل باستخدام المجهر مضان وأنهم على قدم المساواة مناسبة تماما لوحة وقارئ مقرها المقايسات الإنتاجية العالية. هذه الفيروسات هي سهلة الاستخدام في مكان النوع البري الفيروس، وتزايد مع حركية مماثلة لتصل إلى ما يعادل 7 التتر. خلال تخطيط وإنشاء هذه الفيروسات، واتخذت الكثير من الرعاية في اختيار fluorophores التي لها خصائص عالية إشارة إلى خلفية قابلة للطي مع كفاءة متفوقة على تسهيل الكمي موثوق بها مع ردود الفعل السريعة للتغيرات في التعبير (فينوس، mCherry وTagBFP). بالإضافة إلى ذلك، تم اختيار مجموعات من المروجين الفيروسية التي تنتج الدقة العالية، لا لبس فيها التعبير مرحلة محددة، وتوفير المعلومات حول مجموعة كاملة من وقت مبكر (C11R المروج) والمتوسطة (G8R المروج) وأواخر (F17R المروج) التعبير الجيني، على النقيض من غامض المروجين المبكر / في وقت متأخر.
ويمكن لهذه الفيروسات أن تستخدم كأداة لإنفيتقصى دورة حياة تنميط الفيروسة الجدرية، فيروس اللقاحية. الكثير لا يزال غير معروف عن التفاعل المضيفة للفيروس على الرغم من تاريخها الطويل من الدراسة. اللقاحية معقدة، وتنتج أكثر من 200 بروتينات فريدة من نوعها، وكثير منها المناعية واستضافة عدائية. على العدوى، يبدأ الفيروس في وقت مبكر اللقاحية فورا مرنا النسخ. ومما يسهل هذا من قبل البلمرة الحمض النووي الريبي والنسخ العوامل التي تم تحميلها على الجينوم الفيروسي خلال التعبئة والتغليف الفيريون والذي عقد في دولة مؤقتا حتى عدوى لاحقة. هذا التعبير في وقت مبكر تنتج أساسا من البروتينات اللازمة لقمع نظام المناعة المضيف (مرنا decapping، عزل الرنا المزدوج الجديلة، والبروتينات مستقبلات شرك وكذلك مثبطات موت الخلايا المبرمج، استجابة الإجهاد، وتول، IL، وNF كيلوبايت إشارات) وتكرار الجينوم. التعبير المبكر تنتج أيضا عوامل النسخ اللازمة للتعبير وسيطة. ويشمل تعبير وسيطة للتعبير عن العوامل أواخر مرحلة النسخ. هذاالتعبير تتالي يؤدي إلى إنتاج بروتينات الفيروس الهيكلية والأنزيمية خلال المراحل المتأخرة من العدوى، والتي هي ضرورية لتجميع كامل للاللقاحية الفيريون ناضجة.
لدينا مجموعة من الفيروسات مراسل الفلورسنت يسمح للتقدم السريع الذي سيدلي في فهم علم الأحياء الفيروسة الجدرية. إحدى الطرق الأكثر شيوعا وتستغرق وقتا طويلا في مجال علم الفيروسات هو فحص النمو. هذا عادة ما ينطوي على اصابة الخلايا، بسن سلسلة من العلاجات، وفيروس الحصاد من قبل lysing الخلايا المصابة، وقياس عيار الفيروسية الناتجة عن طريق فحص اللوحة. باستخدام الفيروسات مراسل الموصوفة هنا يسمح قياس الوقت الحقيقي للنمو الفيروس الذي يمكن أن يعاير بسهولة ومقارنة بين العديد من العلاجات يقوم بالتوازي. نتوقع هذه المجموعة من الكواشف سيتم استخدامها في بروتوكولات مختلفة لتحديد التغيرات في التعبير الجيني الفيروسي في الاستجابة للعلاج بالعقاقير، رني كnockdown، أو تقييد نطاق المضيف.
هذه الطريقة تمكن أيضا تحليل عالية المحتوى على نطاق أوسع مما كان متاحا في السابق، مما يسمح للشاشات العقاقير المضادة للفيروسات الإنتاجية العالية لمراحل محددة تحديدا الهدف من الفائدة. في حين تم التعرف على العديد من العلاجات المحتملة لمكافحة عدوى الفيروسة الجدرية، وافقت ادارة الاغذية والعقاقير فقط علاجات فعالة لعلاج عدوى الفيروسة الجدرية هي نوكليوزيد اللاحلقية فسفونات، السيدوفير، والعلاج المناعي مع اللقاحية الجلوبيولين 9،10. على الرغم من القضاء على الجدري في عام 1977 11، تظل فيروسات الجدري خطرا كبيرا على صحة الإنسان 12. وقد أدى وقف انتشار التطعيم ضد فيروس الجدري إلى زيادة التعرض لفيروسات الجدري الأخرى 13. على سبيل المثال، مناطق وسط أفريقيا محمية من قبل التطعيم تشهد طفرة في فيروس جدري القردة الإصابات 14. وكان مصدر قلق كبير أيضاالمثارة بشأن قابلية كامنة لإطلاق المتعمد للفيروس الجدري. ويرجع ذلك إلى العلاجات المتاحة حاليا محدودة، وهناك حاجة ملحة لتطوير علاجات جديدة. هذه الفيروسات مراسل تسمح فحص جزيء صغير المانع السريع والإنتاجية العالية لتثبيط مرحلة معينة من تكاثر الفيروس. سوف تحديد مثبطات التي تستهدف المراحل التعبير الفيروسية حاليا لا هدف تثبيط تسهيل تطوير علاجات تركيبة مع زيادة رجولية.
الكثير يمكن استخلاصها حول اللقاحية بيولوجيا الخلية من خلال مراقبة التغيرات في التعبير الجيني في كل مرحلة. وعادة ما يتم التعبير عن التوهين بواسطة مادة كيميائية أو التلاعب الجيني للخلية المضيفة المصابة من حيث انخفاض التتر الفيروسية. ومع ذلك، من خلال مقارنة التغيرات في كل مرحلة من مراحل سلسلة التعبير الفيروسية، يمكن للمرء الحصول على فهم أكثر اكتمالا لكيفية تأثير الفيروس هو اللياقة البدنيةإد عن طريق علاج خاص. وقد تبين أن هذه البيانات أنها تتطابق جيدا مع الإخراج عيار الفيروس التقليدية، ولكن تقديم معلومات أكثر تفصيلا الآلية فضلا عن قدرات إنتاجية عالية 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خلايا بلايت
- فصل خلايا هيلا من لوحة وتمييع في وسائط النمو (DMEM، 2 مم L-تخمة، و 10٪ FBS) إلى ما يقرب من 2.0 × 10 5 خلية / مل. الاستغناء 100 ميكرولتر / جيد في وواضحة لوحة 96 جيدا مسطحة القاع الأسود الجدران (20،000 خلية / جيد).
- احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة حتى متكدسة في حاضنة 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2.
2. تصيب الخلايا
- تمييع الفيروسات وتصيب الخلايا.
- ذوبان الجليد TrpV (الفيروس الثلاثي؛ فينوس المبكر والمتوسط mCherry، في وقت متأخر TagBFP) وPLV (المروج أقل فينوس) فيروس الفلورسنت وتفصيل باستخدام صوتنة لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك، مخزونات فيروس الخام يمكن أن تكون مختلطة مع 01:01 0.25 ملغ / مل التربسين في وسائل الإعلام العدوى والمحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تمييع مخزونات فيروس الخام في 37 ° C وسائل الإعلام العدوى (DMEM، 2 مم L-تخمة، 2٪ FBS). لالتهابات وزارة الداخلية عالية (10 PFU / خلية)، وتمييع الأسهم الفيروس إلى 1.0 × 10 7 PFU / مل على افتراض 5 × 10 4خلايا / جيد وحجم اللقاح من 50 ميكرولتر. الخطة على اصابة 3 آبار تكرار لكل معاملة مع TrpV و 3 آبار أخرى لتكرار نفس المعاملة مع PLV لحساب مضان الخلفية محددة لكل معاملة.
- تصيب الآبار وذلك بإضافة 50 ميكرولتر / المخفف جيدا الفيروس في وسائل الإعلام العدوى. ويعرف هذا باسم عدوى الوقت = 0 ساعة آخر (0 HPI).
- تمييع المركبات العلاج المطلوب في وسائل الإعلام العدوى. لجميع العلاجات وينبغي بذل واحد 2X سيد مزيج التخفيف وتطبيقها لتكرار الآبار (مثلا 350 ميكرولتر اجمالى حجم 96 لمدة ستة آبار مع 50 ميكرولتر لكل منهما).
- تمييع المركبات التجريبية في وسائل الإعلام العدوى.
- تمييع للسيطرة على السيارة المذيبات (مثل برنامج تلفزيوني، DMSO) في وسائل الإعلام العدوى. ملاحظة: تركيزات النهائي مماثلة المذيبات السيطرة على السيارة وينبغي أن تستخدم على النحو المطبق للمركبات التجريبية (على سبيل المثال إذا تم IBT الأسهم الخاصة بك مع DMSO وتستخدم في concentratio النهائينانوثانية من 1 ميكرولتر / مل، ثم استخدم وحده في DMSO 1 ميكرولتر / مل كما السيطرة على السيارة).
- تمييع مركبات التحكم في وسائل الإعلام العدوى. وتشمل المركبات المكافحة الموصى بها: 3.6 ميكرومتر (1 ميكروغرام / مل) 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (أراك)، و 50 ميكرومتر (11.7 ميكروغرام / مل) إيزاتين β-thiosemicarbazone (IBT)، 60 ميكرومتر (50 ميكروغرام / مل) ريفامبيسين، أو 5 ميكرومتر (1.9 ميكروغرام / مل) ST-246 8،15،16. رؤية النتائج الممثل للآثار المتوقعة. ملاحظة: جعل هذا التخفيف في مرتين (2X) على التركيز النهائي المطلوب لأن هذا يضاف إلى نسبة 1:1 لحجم بالفعل في البئر.
- مباشرة بعد إضافة الفيروس، إضافة 50 ميكرولتر التي تحتوي على وسائل الاعلام العدوى العلاجات المطلوبة والضوابط المخففة كما في الخطوة 2.2. ملاحظة: لمقايسة لتثبيط قبل مرحلة مبكرة التعبير، مجمع (ق) يمكن أن تكون إما إضافتها مباشرة إلى اللقاح الفيروس المخفف (الخطوة 2.1.2) أو لاستضافة الخلايا قبل عدوى (قبل الخطوة 2.1.3).
- احتضان 6-24 ساعة في 37 & #176؛ C + حاضنة 5٪ CO 2.
3. إصلاح خلايا
- إصلاح الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر 8٪ بارافورمالدهيد إلى وسائل الإعلام العدوى بالفعل في كل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء. ملاحظة: من المستحسن لإضافة 2X PFA (8٪) مباشرة إلى وسائل الإعلام لمنع العدوى هباء من اللقاحية المعدية التي يمكن أن تحدث إذا تم مقلوب وسائل الإعلام عالية عيار مباشرة في طبق النفايات قبل التثبيت.
- إزالة تثبيتي التي كتبها قلب لوحة في طبق النفايات.
- إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني درجة حرارة الغرفة.
- ختم لوحة مع فيلم لاصق واضحة بصريا. ملاحظة: يمكن تخزين لوحات في 4 درجات مئوية إذا لم يقرأ على الفور. ومن المؤكد أن عودة وحات مختوم إلى درجة حرارة الغرفة قبل قراءة لمنع التكثيف من تشويه قياسات معمل.
4. القياس الكمي الفيروسات النمو
- قياس مضان نقطة النهاية في 515:530 لفينوس، 587:610 لmCherry، و415:457 وأو TagBFP (الإثارة: الانبعاثات الطول الموجي في نانومتر). ينبغي أن متوسط أربعة قياسات لكل بئر باستخدام إعدادات مكاسب الأمثل لكل قناة. ملاحظة: قد يكون الطول الموجي الانبعاثات الملائمة مختلفة اعتمادا على نموذج وتصفية الخصائص المحددة للقارئ لوحة الخاص بك. وهذا يمكن أن تحدد تجريبيا عن طريق إجراء فحص الانبعاثات الطول الموجي لتحديد نقطة حيث هناك أعظم الفرق بين TrpV وPLV لكل قناة.
- تطبيع البيانات الخام لتسهيل المقارنة بين التجارب.
- لكل قناة، وتحديد متوسط TrpV تكرار والآبار PLV.
- طرح متوسط قياسات الخلفية PLV المصابة من القياسات التجريبية متوسط TrpV المصابة عن كل معاملة.
- تطبيع البيانات عن طريق قسمة قيمة كل خلفية طرح من قبل قيمة السيارة فقط أيضا.
- مرة واحدة وقد تكرر تجربة عدة مرات، وتحليل التباين في اتجاه واحد (في اتجاه واحد أنوفا) واختبار متعددة جomparison يمكن إجراء اختبار آخر لتحديد ما إذا كان أي من العلاجات يعكس فروق ذات دلالة إحصائية من العلاج للمركبات فقط لكل قناة.
5 بروتوكول بديل: فحوصات لوحة الحركية
- تنفيذ جميع الخطوات من خلال إضافة العلاجات (الخطوة 2.3).
- ختم لوحة مع فيلم لاصقة وضعها في غرفة قارئ لوحة معايرتها إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: يجب أن يتم إيلاء عناية خاصة للحفاظ على لوحات باستمرار عند 37 درجة مئوية لمنع الإجهاد الخلية لا مبرر له والتكثيف. لفحوصات الحركية، من المهم بشكل خاص لاستخدام وسيلة مخزنة (بيكربونات الصوديوم وHEPES) للحفاظ على درجة الحموضة المناسبة دون إضافة 5٪ CO 2.
- مجموعة كسب قارئ لوحة يدويا لمنع تشبع نقاط وقت لاحق. ملاحظة: يمكن الحصول على دقة مكاسب الأمثل عن طريق إجراء فحوصات نقطة النهاية في ظل ظروف مماثلة.
- الحصول على قراءات للساعة 8-24 HPI وتطبيع باستخدام سيميلار الإجراء كما هو الحال في نقطة النهاية مقايسة (الخطوة 4.2).
- نقاط زمنية الفردية يمكن تحليلها إحصائيا باستخدام أساليب مماثلة لفحص نقطة النهاية هو موضح سابقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كمثال على استخدام نموذجي من هذه الفيروسات، وكان يستخدم الفيروس الثلاثي مضان مراسل لمقارنة وجهة تثبيط العديد من الفيروسة الجدرية مثبطات محددة جيدا.
كانت مطلية خلايا هيلا في زراعة الأنسجة المعالجة واضحة لوحات 96 جيدا مسطحة القاع الأسود الجدران وحضنت بين عشية وضحاها. أصيب الطبقات الوحيدة متكدسة في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 10 باستخدام إما الثلاثي فيروس مراسل (TrpV؛ الجدول 1) أو المروج أقل فينوس (PLV) كما هو مفصل على لوحة الخريطة (الشكل 1). تم إضافة وسائل الإعلام العدوى التي تحتوي على العلاجات للحصول على تركيز النهائي من 0.1٪ DMSO، 3.6 ميكرومتر (1 ميكروغرام / مل) أراك، و 50 ميكرومتر (11.7 ميكروغرام / مل) IBT، 5 ميكرومتر (1.9 ميكروغرام / مل) ST-246 أو 60 ميكرومتر (50 ميكروغرام / مل) ريفامبيسين في ثلاث نسخ. تم استخدام 0.1٪ DMSO كما السيطرة على السيارة لأن جميع المانع استخدمت المخزونات في 1 ميكرولتر / مل في DMSO. وقد عاد لوحة إلى 37 درجة مئوية incubatoص حتى 18 HPI. تم إصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة قبل إضافة 100 ميكرولتر 8٪ PFA لجميع الآبار وتخزينها في برنامج تلفزيوني محمية من الضوء حتى على قراءة قارئ لوحة. أجريت قراءات مضان باستخدام لوحة قارئ TECAN اللانهائي M1000 والبرمجيات ط السيطرة (v1.5.14.0) من خلال القراءة أسفل 4 نقاط لكل بئر في الإثارة: موجات الانبعاثات من 515:530، 587:610، 415:457 نانومتر لفينوس ، fluorophores mCherry، وTagBFP، على التوالي. قبل القياسات النهائية، وتحقيق مكاسب الأمثل للسماح للإشارة القصوى دون التشبع من أجهزة الاستشعار (كان مكسب عادة 235، 255، 235 للأخضر، أحمر وأزرق القياسات، على التوالي).
الشكل 1. تخطيط الممثل من العدوى والعلاج بالعقاقير على 96 لوحة جيدا. مخطط من 96 لوحة جيدا العدوى والصغيرة بالإضافة مخطط جزيء تستخدم لكرتناول ممثل النتائج. فيروس الفلورسنت الثلاثي (TrpV؛ أخف الرمادي) معربا عن أوائل فينوس والمتوسطة mCherry، وأواخر TagBFP أو المروج أقل فينوس (PLV؛ قتامة اللون الرمادي) وتستخدم في الأعمدة ثلاث نسخ. 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (أراك)، β-إيزاتين thiosemicarbazone (IBT)، يشار إلى ريفامبيسين، ST-246 وDMSO السيطرة على السيارة مع تركيز اختبارها في الحق. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
تم تطبيع وحدات مضان النسبي (RFU) لكل تكرار لكل قناة. أولا، تم طرح متوسط كثافة مضان للآبار PLV من شدة متوسط الآبار TrpV لكل معاملة لحساب كثافة الخلفية التي ساهمت كل دواء. المقبل، تم تقسيم هذه القيمة الخلفية تطرح كثافة متوسط الآبار TrpV المعالجة DMSO (النمو النوع البري). النتائج التي تم الحصول عليها بعد العلاج مع بو معروفكان xvirus مثبطات متسقة مع نتائج الدراسة التي نشرت سابقا وآلية بهم فهم العمل. وقد تبين وقف أوائل النسخ الجيني والتحول إلى وسيط التعبير الجيني تتطلب تكرار الحمض النووي 17. واتساقا مع هذا، أراك، المانع من تكرار الحمض النووي، وأظهرت زيادة كبيرة في أوائل التعبير الجيني (210٪ من DMSO تعامل التعبير المبكر؛ الشكل 2) وانعدام تام للالمتوسطة والمتأخرة التعبير (0.4٪ و 0.3٪ من DMSO يعامل المتوسطة والمتأخرة التعبير، على التوالي؛ الشكل 2). في حين أن الآلية الدقيقة لعمل لم يتم تعريف لIBT، ويعتقد أنه من أجل تعزيز القراءة من خلال النسخ، مما أدى إلى زيادة كميات الرنا المزدوج الجديلة، تفعيل ريبونوكلياز L مسار موت الخلايا المبرمج و18-20. في الاستجابة للعلاج IBT لوحظ وجود النمط الظاهري شديدة تدريجيا في التعبير الذي المتوسطة والمتأخرة كانت أقل بكثير من DMSO وحدها (24.7٪و 2.9٪ من DMSO المعالجة للتعبير المتوسطة والمتأخرة، على التوالي؛ الشكل 2). ولوحظ أيضا انخفاض مضان في وقت مبكر بما يتفق، ولكن لا يعتد به إحصائيا؛ ولكن هذا هو الأرجح بسبب موت الخلايا المبرمج IBT التي يسببها في هذه المرحلة وقت لاحق (74.0٪ من DMSO في 18 HPI). وعلى النقيض من أراك وIBT، الأدوية الفيروسة الجدرية ST-246 وريفامبيسين كلا تمنع بعد أواخر التعبير الجيني خلال التجمع الفيريون والنضج 15،16. لم تظهر أية تغيرات في التعبير الجيني خلال جميع المراحل عندما تم علاج الخلايا مع إما ST-246 (100.9٪، 98.5٪، 94.5٪ من وDMSO علاجها في وقت مبكر، والتعبير المتوسطة والمتأخرة، على التوالي؛ الشكل 2) أو ريفامبيسين (107.6٪، 104.2٪، 106.5٪ من وDMSO علاجها في وقت مبكر، والتعبير المتوسطة والمتأخرة، على التوالي).
تاريخيا، وهو مزيج من انخفاض وزارة الداخلية (،01-،1 PFU / خلية) وارتفاع وزارة الداخلية (5-10 PFU / خلية) وتستخدم المقايسات النمو عند استكشاف تأثير كابح من جزيء صغير جديد أو متحولة الفيروس. في أدنى مستوى وزارة الداخلية، وغالبا ما يتم المبالغة الآثار المثبطة العام بنسبة طفيفة حتى تثبيط منذ فقط مجموعة فرعية من الخلايا مصاب في البداية. عند محاولة تحديد نقطة خلال دورة العدوى التي تحول دون فيروس، هو عدوى زارة الداخلية عالية المرجح أكثر ملاءمة، كما يصاب كل الخلايا عن طريق اللقاح الأساسي الخاص بك. تم إجراء التجربة هو مبين في الشكل (3) كما في الشكل 2 مع إضافة مجموعة من الآبار التي كانت مصابة في أقل زارة الداخلية = 1. كما المانع أن يعمل ما بعد transcriptionally آخر، يجب ST-246 لا يؤثر على أي مرحلة من مراحل التعبير الجيني ؛ ومع ذلك، فمن الواضح أنه عندما فقط مجموعة فرعية من الخلايا بالعدوىد (الشكل 3، وزارة الداخلية = 1) وجود تثبيط واضح لجميع مراحل التعبير (38.4٪، 48.9٪، و 52.9٪ من DMSO بالمقارنة مع 100.9٪، 98.5٪، 94.5٪ للوزارة الداخلية = 1 = 10 مقابل وزارة الداخلية مستوى العدوى التعبير في وقت مبكر والمتوسطة والمتأخرة، على التوالي؛ الشكل 3). على افتراض 100٪ تثبيط تشكيل الفيريون ناضجة من قبل ST-246، وهذا يعني أصيب 100٪ من الخلايا عن طريق وزارة الداخلية = 10 والالتهابات، ويتراوح ما بين 50 و 70٪ من خلايا منتجة أصيبوا خلال وزارة الداخلية = 1 العدوى.
الرقم 3. تأثير واضح على مستوى العدوى ST-246 تثبيط. خلايا هيلا المصابين كما في الشكل 2 مع كل من عالية (وزارة الداخلية = 10) ومنخفضة (وزارة الداخلية = 1) TrpV تعامل مع ST-246. وحدات مضان النسبي (RFU؛ خلفية طرح كل قناة س يستندن النمو PLV لكل معاملة وتطبيع TrpV + DMSO) في أوائل (الأخضر)، والمتوسطة (الحمراء)، وأواخر (الازرق) التعبير الفيروسي في الخلايا المصابة إما في وزارة الداخلية أو وزارة الداخلية = 1 = 10 وتعامل مع 20 ميكرومتر ST- 246. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
| اسم | وصف | المرجع. |
| TrpV | الفيروس الثلاثي؛ C11R (المبكر) الترويج فينوس، G8R (المتوسط) الترويج mCherry، F17R (الراحل) الترويج mTagBFP | 7 |
| PLV | المروج أقل فينوس | |
| EV | C11R (المبكر) الترويج فينوس | |
| رابعا | G8R (المتوسط) الترويج فينوس | |
| LV | F17R (الراحل) الترويج فينوس | |
| IREV | G8R (المتوسط) والترويج mCherry C11R (المبكر) الترويج فينوس | |
| LREV | F17R (الراحل) والترويج mCherry C11R (المبكر) الترويج فينوس | |
| LR | F17R (الراحل) الترويج mCherry | |
| mCherry-A4L | الانصهار N-محطة من fluorophore VENUS إلى وقت متأخر من أعرب البروتين الفيروسي الأساسية A4L |
الجدول 1. قائمة سلالات فيروس اللقاحية مراسل الجدول اصفا الفيروسات مراسل مضان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، لقد وصف الاستخدام العملي لمرحلة متعددة مراسل اللقاحية الفيروس (TrpV)، والذي يوفر، في الوقت الحقيقي التدابير ردود فعل استنساخه من تكاثر الفيروس. باستخدام الفيروسة الجدرية مثبطات محددة جيدا، وكنا قادرين على إظهار أن TrpV يستجيب بطريقة متسقة مع آلية عمل ليفهم كل مثبط. في حين يوفر الفيروس TrpV المعلومات الاكثر شمولا عن الفيروس مرحلة التقدم، على مرحلتين (IREV، LREV) ومرحلة واحدة (EV، والرابع، والوقف) فيروسات يمكن أن تستخدم أيضا على نحو مماثل، والاستفادة من البروتين للطي الأمثل والاستقرار، ونسبة متفوقة إشارة إلى الضوضاء من fluorophore فينوس.
فحص إثبات صحة المفهوم في هذا البروتوكول يشير إلى إمكانية تحديد المرحلة من التعبير الجيني الفيروسي تنفذ من قبل الفيروسة الجدرية مثبطات يعرف بطريقة بسيطة وعالية الإنتاجية لوحة الفحص. ويمكن تمديد هذا الاختبار لاستكمال سريع، فحص شاملالمكتبات الكيميائية غير معروفة كذلك. يمكن للفيروسات أن تستخدم لتصيب جزيء صغير الخلايا المعالجة في انخفاض وزارة الداخلية، والسماح لتحديد محددة من المركبات التي تعمل على منع أي مرحلة من مراحل دورة حياة الفيروس. ويمكن بعد ذلك استخدام مثبطات سيتم عرض TrpV في عدة موييس لتحديد مرحلة من مراحل دورة حياة الفيروس منعت من الدخول (أي التعبير الجيني)، لفي وقت مبكر، وسيطة، أو في وقت متأخر التعبير الجيني أو التجميع (التعبير الجيني الكامل ولكن لا انتشار الفيروس). وقد استخدمنا هذه التقنية لتحديد المانع مكافحة poxviral جديدة مع نشاط ضد العديد من فيروسات الجدري، بما في ذلك القردة 8 بنجاح.
في حين قدمنا تفاصيل لاستخدام هذه الفيروسات في شكل لوحة للقارئ، وعلى قدم المساواة تناسب بشكل جيد للفحص المجهري. العدوى والمراقبة عبر المجهر مضان (انظر الشكل 2B) يسمح لإجراء فحص خلية تلو خلية من الفيروسية مرحلة تطور، والتي يمكن أن تكون مفيدة فيإعداد خلية ثقافة مختلطة، مثل إصابة الأنسجة، أو في ظروف شارك في العدوى الفيروسية أو البكتيرية. بالإضافة إلى ذلك، في حين تم إنشاء هذه الفيروسات لأغراض الفحص المضادة للفيروسات 8، ونحن نتوقع منهم أن تكون ذات فائدة متساوية في مجال البحوث الأساسية التي تحقق في دورة حياة فيروس اللقاحية. على سبيل المثال، هذه الفيروسات يمكن بسهولة تعديلها باستخدام التقنيات التقليدية إما نقص أو overexpress البروتينات الفيروسية؛ ومن ثم يمكن رصد حركية فيروس التعبير الجيني وانتشار في الوقت الحقيقي لجميع المراحل من النسخ الفيروسية.
التحقيقات للتفاعل الفيروس في استضافة يمكن أن تستفيد من استخدام هذه الفيروسات مراسل كذلك. هذه تسمح للصحفيين التحديد السريع للمرحلة تكاثر الفيروس الانتهاء خلال العدوى من أنواع الخلايا غير متساهل، مثل بعض خطوط الخلايا الأولية، والكريات البيض في الدم المحيطي، أو الأنواع المتباينة 21،22. تجمع المعلومات من استخدام هذاسيكون أداة تعزيز معرفتنا عوامل تقييد الفيروسة الجدرية مجموعة المضيف وظيفة من البروتينات الفيروسية المناعية تغييري. الفيروسات وسوف يكون من المفيد تحديد مرحلة تكاثر الفيروس تحول دون ضربة قاضية من العوامل المضيفة المطلوبة للعدوى، إما في شاشة نطاق كامل الجينوم أو في شاشة مكتبة صغيرة موجهة أيضا.
وينبغي النظر في عدة خطوات في هذا البروتوكول الحرجة عند بداية استخدام هذه الفيروسات في النظام الجديد. قد تتطلب الاختلافات في شكل لوحة، وسائط النمو، ونوع من الخلايا التغيير من وزارة الداخلية، والوقت التلقيح، أو مدة الحضانة. يصبح من المهم بشكل خاص لتحسين نقطة النهاية قبل فترة حضانة الارتقاء إلى تنسيق الإنتاجية العالية. لتحديد فترة حضانة مثالية، يجب أن يتم تنفيذ طيار الحركية لوحة الفحص (انظر الخطوة 5). خلال الفحص الحركية، يتم إجراء قياسات مضان كل ساعة لمدة 12-24 ساعة، ويمكن استخدامها لتحديد الوقت الذي غرامويلاحظ تأكل الفرق بين التحكم والتعبير الفيروس العلاج. يمكن أن ينظر إلى أهمية هذه الخطوة في المعاملة مع IBT، حيث تثبيط بسبب زيادة معدلات موت الخلايا المبرمج الرصاص إلى واضح، على الرغم من عدم انخفاض ملحوظ إحصائيا في التعبير في وقت مبكر. سيكون إذا لوحظت نقاط وقت سابق (4-8 HPI) من المرجح أن يكون هناك فرق الملاحظة. بالإضافة إلى ذلك، اختبار مركب المثبطة رواية ينبغي أن تشمل تركيزات المركب متعددة. في حين أن هذه الفيروسات مراسل مضان قادرون على اكتشاف تغيرات طفيفة في التعبير الجيني، والمعلومات الإضافية التي حصلت عليها تركيزات متعددة يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للتأثير بشكل عام.
خلال تخطيط وإنشاء هذه الفيروسات، واتخذت الكثير من الرعاية في اختيار fluorophores أن يكون إشارة إلى الخلفية 7 خصائص عالية. تم التعرف على البروتين فينوس وأفضل بكثير من أي اختبار فلوري أخرىophore، وبالتالي تم استخدامه في جميع أنحاء تطوير الثلاثي، مزدوجة، واحدة الفيروسات مراسل الفلورسنت. القيد واحدة لاستخدام هذا fluorophore هو أنه لا يمكن استخدامها لتصيب أي خط الخلية التي تحتوي بالفعل مراسل الفلورية الخضراء من البروتين الانصهار. لمعالجة تحليل في ظل هذه الظروف، تم إنشاء العديد من الفيروسات البديلة باستخدام البروتينات الفلورية الحمراء (الجدول 1). بالإعراب إما للذوبان mCherry من F17R أواخر المروج أو mCherry-A4L الانصهار البروتين من أواخر المروج الطبيعية A4L ونحن قادرون على تحقيق قياسات مماثلة دون فينوس. على الرغم من أن استخدام mCherry لا تملك الفائدة المضافة التي تقدمها البروتين فينوس نحن الآن قادرة على استيعاب القياس في خطوط الخلايا معربا عن الأخضر.
باختصار، قمنا بتطوير مجموعة من الفيروسات اللقاحية مراسل مع مختلف التطبيقات، بما في ذلك الإنتاجية العالية أو قارئ لوحة نسبة عالية أسا التصويريس. هذه الفيروسات سيجعل فحص دورة حياة الفيروس بشكل أسرع بكثير من الطرق التقليدية، ويمكن استخدامها للعلوم الأساسية وكذلك البحوث التطبيقية المضادة للفيروسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما تكشف ولا براءات الاختراع في انتظار بحثا عن الفيروسات أو أساليب الفحص.
Acknowledgments
نشكر بشؤون تكنولوجيز (كورفاليس، OR) لتوفير ST-246. وأيد DKR من منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة في علم المناعة في جامعة بوسطن (5T32AI 7309). وأيد هذا العمل في جزء من P41 086180، المعاهد الوطنية للصحة RO1AI1096159-01، وRO3 (لJHC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance. BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).
- Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection. DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).
- Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts. Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).
- Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).
- Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein. Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).
- Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).
- Dower, K., et al. Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library. Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).
- De Clercq, E. Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).
- Prichard, M. N., Kern, E. R. Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents. Antiviral Research. 10, (2012).
- Fenner, F. A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox. Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).
- Breman, J. G., Henderson, D. A. Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England. Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).
- Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).
- Rimoin, A. W., et al. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).
- Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65. Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).
- Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic. Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).
- Broyles, S. S.
- Condit, R. C., Niles, E. G. Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).
- Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication. Virology. 227 (1), 220-228 (1997).
- Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus. Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).
- Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection. Virology Journal. 1 (1), (2004).
- Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription. PLoS One. 6 (2), (2011).
