Summary
Wir beschreiben die Verwendung eines fluoreszierenden Reporter Vaccinia-Virus, das Echtzeit-Messung der viralen Infektiosität und Genexpression ermöglicht durch die Stufe-spezifische Expression von spektral unterschiedlichen Fluorophoren Reporter. Wir detailliert ein plattenbasierte Verfahren zum genauen Identifizieren der Phase, in der die Virusreplikation in Reaktion auf kleine Molekül Inhibierung betroffen.
Abstract
Pockenviren sind eine Familie von Doppelstrang-DNA-Viren, die aktive menschliche Krankheitserreger wie Affenpocken, Dell contagiousum und Contagalo Virus enthalten. Die Familie umfasst auch die Pocken-Virus, Variola. Aufgrund der Komplexität des Pockenvirus-Replikation, bleiben noch viele Fragen hinsichtlich ihrer Genexpression Strategie. In diesem Artikel beschreiben wir die Konzeption und die Verwendung von rekombinanten Vaccinia-Viren, die Echtzeitmessung von einzelnen und mehrfachen Stufen der viralen Genexpression in einem Format mit hohem Durchsatz zu ermöglichen. Dies wird durch die Verwendung von spektral unterschiedlichen fluoreszierenden Proteine als Reporter für jede der drei Phasen der Virusreplikation ermöglicht. Diese Viren einen hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnis unter Beibehaltung Stufe spezifische Expressionsmuster, wodurch plattenbasierten Assays und mikroskopische Beobachtungen der Virus Vermehrung und Replikation. Diese Tools verwendet haben für antivirale Entdeckung, Studien der Virus-Wirt-Interaktion, und evolutionäre biologie.
Introduction
Traditionell wird Virus-Expressions mit molekularbiologischen Techniken (zB Northern Blot, Western Blot, Microarray-Hybridisierung, etc.) 1 untersucht. Diese Verfahren sind in der Lage, detaillierte Informationen in Bezug auf die Kategorisierung Expressionsänderungen der einzelnen mRNAs bzw. Proteine, sind sie typischerweise nicht zugänglich Echtzeit-und Hochdurchsatzverfahren. Alternative Ansätze mit Fluoreszenz-basierten Reporter haben bisher bei der Arbeit mit Pockenviren angewandt worden; hat jedoch ihre Entwicklung und Nutzung durch abwechslungsreiche Ziele motiviert. Mehrere solche Verfahren wurden zur Selektion von rekombinanten Viren 2,3 entwickelt. Diese Techniken auszudrücken EGFP auf ordnungsgemäße Einbau und die Expression von exogener DNA aus rekombinanten Vaccinia-Klonen. Ebenso mehrere Vacciniastämme stabil exprimieren EGFP löslich oder GFP-markierten Proteine unter einer nativen Vaccinia-Promotor exprimiert sind weit verbreitet. Diese sind typ.tisch verwendet werden, um das Eindringen von Viren und die Replikation während Antikörper-basierten Neutralisationstests, chemische Hemmung oder Vergleich der antiviralen Wirksamkeit 4-6 quantifizieren. Obwohl diese Viren nützlich erwiesen haben, sind sie in ihrer Fähigkeit, Informationen über den Punkt der Inhibition durch ihre Nutzung eines einzelnen mehrdeutigen frühen / späten viralen Promotor bereitzustellen begrenzt. Bisherige Verfahren haben auch die Verwendung von EGFP Protein gemacht mit suboptimalen Signal-zu-Rauscheigenschaften.
Aufgrund der Komplexität des Pockenvirus-Replikation und der Mangel an vorhandenen Werkzeugen zur Verfügung, um Echtzeit-Änderungen in der viralen Genexpression zu untersuchen, haben wir eine Reihe von Einzel-und Mehrstufen-Reporter Viren 7,8 entwickelt. Wie bereits in früheren Veröffentlichungen beschrieben, diese Viren Ausdruck ein, zwei, oder drei spektral unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinen aus nativen Vaccinia-Promotoren in der frühen, mittleren oder späten Stadien der Infektion. Diese Viren können unsed als Indikatoren für die Virusreplikation Fortschritte mit einem Fluoreszenzmikroskop und die sie für Hochdurchsatz-Platte-basierte Assays Leser gleich gut geeignet sind. Diese Viren sind einfach anstelle des Wildtyp-Virus verwenden, wachsen mit ähnlichen Kinetik gleichwertige Titer 7 zu erreichen. Bei der Planung und Erstellung dieser Viren wurde viel Sorgfalt bei der Auswahl der Fluorophore, die hohen Signal-zu-Hintergrund-Merkmale mit überlegener Effizienz Klapp müssen zuverlässige Quantifizierung mit schneller Rückmeldung an Veränderungen in der Expression (Venus, mCherry und TagBFP) Erleichterung aufgenommen. Zusätzlich Kombinationen von viralen Promotoren wurden ausgewählt, die eine hohe Wiedergabetreue, eindeutige Phase-spezifische Expression, die Bereitstellung von Informationen über das gesamte Spektrum der früh (C11R-Promotor), Mittelstufe (G8R Promotor) und späten (F17R Promotor) Genexpression zu produzieren, im Gegensatz zu zweideutig frühen / späten Veranstalter.
Diese Viren können als ein Werkzeug verwendet werden, für investigating den Lebenszyklus des prototypischen Pockenvirus, Vaccinia-Virus. Vieles ist noch nicht bekannt über die Wirt-Virus-Interaktion trotz seiner langen Geschichte der Studie. Vaccinia ist komplex, produziert mehr als 200 einzigartige Proteine, von denen viele immunmodulatorische und hosten antagonistisch. Bei Infektion beginnt Vaccinia-Virus sofort frühen mRNA-Transkription. Dies wird durch eine RNA-Polymerase und Transkriptionsfaktoren, die auf der viralen Genoms während der Virion Verpackungs geladen und in einem angehaltenen Zustand, bis nachfolgende Infektion gehalten wurden, erleichtert. Diese frühe Ausdruck produziert vor allem Proteine für die Unterdrückung der das Immunsystem des Wirts (mRNA Decapping, dsRNA-Sequestrierung und Köder Rezeptorproteine sowie Inhibitoren der Apoptose, Stressantwort und Toll, IL, und NF-kB-Signalisierung) und Genom-Replikation erforderlich. Frühe Ausdruck produziert auch Transkriptionsfaktoren für Zwischenausdruck erforderlich. Zwischen Ausdruck schließt die Expression von Transkriptionsfaktoren spät. DiesAusdruck Kaskade führt zur Produktion von strukturellen und enzymatischen Virusproteine während der späten Stadien der Infektion, die für die komplette Montage des reifen Virions Vaccinia notwendig sind.
Unsere Gruppe von fluoreszierenden Reporter-Viren ermöglicht rasche Fortschritte im Verständnis der Biologie Pockenvirus hergestellt werden. Eine der häufigsten und zeitraubenden Methoden auf dem Gebiet der Virologie ist die Wachstumstest. Dies beinhaltet typischerweise Infizieren von Zellen, Festlegung einer Reihe von Behandlungen, Virus-Ernte durch Lyse von infizierten Zellen und der Quantifizierung des erhaltenen Virustiter durch Plaque-Assay. Mit den hier beschriebenen Reporter Viren ermöglicht Echtzeit-Messung der Viruswachstum, die leicht untersucht und verglichen zwischen zahlreichen Behandlungen, die parallel ausgeführt werden können. Wir sehen dieses Set von Reagenzien werden in verschiedenen Protokollen für die Identifizierung Veränderungen im viralen Genexpression in Reaktion auf Medikamente, RNAi-k verwendet werdennockdown oder Wirtsspektrum Einschränkung.
Diese Methode ermöglicht auch High-Content-Analyse in einem größeren Maßstab als bisher zur Verfügung, so dass für Hochdurchsatz-Anti-Virus-Drogen-Bildschirme für speziell definierte Zielstufen von Interesse. Während zahlreiche mögliche Behandlungen zur Bekämpfung von Pockenvirus-Infektion identifiziert worden sind, die einzige von der FDA zugelassenen Therapien wirksam zur Behandlung von Pockenvirusinfektion sind die acyclischen Nucleosid-Phosphonats, Cidofovir, und Behandlung mit Vaccinia-Immunglobulin 9,10. Trotz der Ausrottung der Pocken im Jahr 1977 11, bleiben Pockenviren eine erhebliche Bedrohung für die menschliche Gesundheit 12. Einstellung der weit verbreiteten Impfung gegen Variola-Virus hat zu einer erhöhten Anfälligkeit für andere Pockenviren 13 geführt. Zum Beispiel werden die Regionen Zentralafrikas zuvor durch Impfung geschützt erleben einen Anstieg der Affenpocken-Virus-Infektionen 14. Erhebliche Bedenken hat auchhob in Bezug auf die latente Anfälligkeit für vorsätzliche Freisetzung von Variola-Virus. Aufgrund der begrenzten Therapien derzeit zur Verfügung, es besteht ein dringender Bedarf für die Entwicklung von neuartigen Behandlungen. Diese Reporterviren erlauben eine schnelle und Hochdurchsatz-Screening niedermolekularer Inhibitor zur Hemmung einer spezifischen Phase der Virusreplikation. Identifizierung von Inhibitoren, die viralen Expressions Stufen Ziel derzeit nicht das Ziel der Hemmung wird die Entwicklung von Kombinationstherapien mit erhöhter Potenz zu erleichtern.
Man kann viel über Vaccinia Zellbiologie durch Beobachtung von Veränderungen in jeder Stufe der Genexpression zu entnehmen. Dämpfung durch chemische oder genetische Manipulation einer infizierten Wirtszelle wird in der Regel in Form von geringeren Virustiter ausgedrückt. Doch beim Vergleich der Entwicklung in den einzelnen Phasen des viralen Expressionskaskade, kann man ein vollständigeres Verständnis der Virus-Fitness ist Auswirkungen zu erhaltendurch eine besondere Behandlung ed. Diese Daten haben gezeigt, dass auch mit der traditionellen Virustiter Ausgangs korrelieren, aber detailliertere mechanistische Informationen sowie hohe Durchsatzkapazitäten 7.
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Protocol
1. Platte Cells
- Distanzieren HeLa-Zellen von der Platte und in Wachstumsmedium (DMEM, 2 mM L-glut, 10% FBS) zu verdünnen, um etwa 2,0 x 10 5 Zellen / ml. Pipettieren von 100 ul / Vertiefung in einem schwarzen Wänden, klare Flachboden-96-Well-Platte (20.000 Zellen / Vertiefung).
- Zellen für 24 Stunden inkubieren, bis Konfluenz in einer 37 ° C-Inkubator + 5% CO 2.
2. Zellen infizieren
- Verdünnen Virus und Zellen infizieren.
- Tauwetter TRPV (Dreibett-Virus, Früh Venus, Intermediate mCherry, Spät TagBFP) und PLV (Promoter-less Venus) Fluoreszenz-Virus und zerlegen mit Beschallung für 5 Minuten. Alternativ können rohen Virusvorräte mit 0,25 mg / ml Trypsin in Infektionsmedium gemischt 1:1 und bei 37 ° C für 30 min inkubiert.
- Verdünnen rohen Virusvorräte in 37 °-C-Infektion Medien (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). Bei hohen MOI-Infektionen (10 PFU / Zelle), verdünnte Virus Lager bis 1,0 x 10 7 PFU / ml unter der Annahme, 5 x 10 4Zellen / Vertiefung und ein Inokulum von 50 ul. Plan zu infizieren 3 Wiederholungsvertiefungen für jede Behandlung mit TRPV und weitere 3 Wiederholungsvertiefungen für die gleiche Behandlung mit PLV auf Hintergrundfluoreszenz spezifisch für jede Behandlung zu berücksichtigen.
- Infizieren Vertiefungen durch Zugabe von 50 &mgr; l / Vertiefung verdünnt Virus in Infektionsmedium. Dies wird als Zeit = 0 h nach Infektion (hpi 0) definiert.
- Verdünnen gewünschten Behandlungs Verbindungen in Infektion Medien. Für alle Behandlungen sollte eine einzige Master-Mix 2x Verdünnung hergestellt werden und auf Brunnen (z. B. 350 ul Gesamtvolumen von sechs 96-Brunnen mit jeweils 50 ul) zu replizieren.
- Verdünnen experimentelle Infektion Verbindungen in Medien.
- Verdünnen Fahrzeug-Steuer Lösungsmittel (zB PBS, DMSO) in Infektions Medien. Hinweis: Ähnliche Endkonzentrationen von Fahrzeug-Steuerlösemittel sollten wie für experimentelle Verbindungen (z. B. angewendet werden, wenn Ihr IBT Lager ist mit DMSO hergestellt und in einem abschließenden concentratio verwendetns von 1 ul / ml, dann mit DMSO allein bei 1 ul / ml auf der Fahrzeugsteuerung).
- Verdünnen Steuer Verbindungen in Infektion Medien. Empfohlene Kontrollverbindungen umfassen: 3,6 um (1 ug / ml) 1-β-D-arabinofuranosylcytosin (AraC), 50 uM (11,7 ug / ml) β-thiosemicarbazon Isatin (IBT), 60 uM (50 ug / ml) Rifampicin, oder 5 &mgr; m (1,9 &mgr; g / ml) ST-246 8,15,16. Siehe Repräsentative Ergebnisse für die erwarteten Effekte. Hinweis: machen diese Verdünnung zu zweimal (2x) der gewünschten Endkonzentration da diese im Verhältnis 1:1 auf das Volumen bereits in die Vertiefung gegeben.
- Unmittelbar nach Zugabe des Virus, 50 &mgr; l Medium, das gewünschte Infektion Behandlungen und Kontrollen wie in Schritt 2.2 verdünnt. Hinweis: Um für die Hemmung vor frühzeitig Ausdruck zu testen, Verbindung (en) kann entweder direkt zu der verdünnten Virusinokulum (Schritt 2.1.2) oder hinzugefügt werden, um Zellen vor der Infektion zu hosten (vor Schritt 2.1.3).
- Inkubieren 24.06 h in einem 37 & #176; + C-Inkubator mit 5% CO 2.
3. Fix Cells
- Fix Zellen durch Zugabe von 100 ul 8% Para für Infektionen Medien bereits in jedes Well. Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min vor Licht geschützt. Hinweis: Es wird empfohlen, 2x PFA (8%), die direkt auf eine Infektion Medien zu Vernebelung von Infektions Vaccinia die auftreten können, zu vermeiden, wenn mit hohem Titer Medien direkt in die Abfallschale vor der Fixierung invertiert.
- Entfernen Fixiermittel durch Umdrehen der Platte in den Abfall Gericht.
- 100 l Raumtemperatur PBS.
- Dichtungsplatte mit optisch klare Klebstoff-Film. Hinweis: Die Platten können bei 4 ° C gelagert werden, wenn nicht sofort gelesen werden. Achten Sie darauf, versiegelten Platten auf Raumtemperatur vor dem Lesen, um Kondensation zu verzerren Spektralphotometer Messungen verhindern zurückzukehren.
4. Quantifizierung Virus Wachstum
- Messen Endpunkt Fluoreszenz bei 515:530 für Venus, 587:610 für mCherry und 415:457 foder TagBFP (Anregung: Emissionswellenlänge in nm). Vier Messungen sollten pro Vertiefung mit optimierten Verstärkungseinstellungen für jeden Kanal gemittelt werden. Hinweis: Die entsprechenden Emissionswellenlänge kann je nach Modell und Filtereigenschaften des Plattenlesegerät. Dies kann empirisch durch die Durchführung einer Emissionswellenlängen-Scan, um den Punkt, wo es den größten Unterschied zwischen TRPV und PLV für jeden Kanal bestimmen, bestimmt werden.
- Normalisieren Sie die Rohdaten zum Vergleich zwischen den Experimenten zu erleichtern.
- Für jeden Kanal die mittlere von Wiederholungs TRPV und PLV Brunnen.
- Subtrahieren Sie die Mittel PLV-infizierten Hintergrundmessungen aus den Mittel TRPV-infizierten experimentellen Messungen für jede Behandlung.
- Normalisieren Sie die Daten, indem jede Hintergrund subtrahiert Wert vom Fahrzeug-only-Wert auch.
- Sobald ein Experiment wurde mehrmals, eine Einweg-Varianzanalyse (one-way ANOVA) Test-und Mehrfach c wiederholtERGLEICH Post-Test durchgeführt, um zu bestimmen, ob jede der Behandlungen zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied von der Fahrzeug einzige Behandlung für jeden Kanal werden.
. 5 Alternative Protokoll: Kinetic Plattentests
- Führen Sie alle Schritte durch Zugabe von Behandlungen (Schritt 2.3).
- Seal Platte mit Haftklebefolie abdecken und in Plattenleseraum auf 37 ° C ins Gleichgewicht Hinweis: Besondere Sorgfalt ist auf Platten bei 37 ° C konstant zu halten, um übermäßige Zellstress und Kondensation zu verhindern. Kinetischen Assays ist es besonders wichtig, einen gepufferten Medium (Natriumbicarbonat und HEPES), um richtigen pH ohne Zusatz von 5% CO 2 erhalten.
- Set-Plattenlesegerät manuell zu gewinnen, um die Sättigung des späteren Zeitpunkten zu verhindern. Anmerkung: Die genaue Verstärkungsoptimierung kann durch Durchführen einer Endpunkt-Assays unter ähnlichen Bedingungen erhalten werden.
- Erwerben Stundenwerte für 8-24 hpi und normalisieren mit ähnlar Verfahren wie in Endpunkt-Assay (Schritt 4.2).
- Individuelle Zeitpunkte für die statistische Signifikanz unter Verwendung ähnlicher Verfahren wie das zuvor beschriebene Endpunkt-Assay analysiert werden.
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Representative Results
Als ein Beispiel für die typische Verwendung dieser Viren wurde das dreifache Fluoreszenz-Reportervirus verwendet, um den Punkt der Hemmung von mehreren wohldefinierten Pockenvirus-Inhibitoren zu vergleichen.
HeLa-Zellen wurden in Gewebekultur behandelt vergoldet schwarz-mauert klar Flachboden-96-Well-Platten und über Nacht inkubiert. Konfluente Monolayer wurden bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 unter Verwendung von entweder dreifache Reporter Virus (TRPV, Tabelle 1) oder promotorlose Venus (PLV), wie auf der Platte Karte (Fig. 1) beschrieben. Medien, die Infektion Behandlungen wurde zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,1% DMSO, 3,6 &mgr; M (1 ug / ml) erhalten wurden AraC, 50 uM (11,7 ug / ml) IBT, 5 &mgr; m (1,9 &mgr; g / ml), ST-246 oder 60 &mgr; M (50 ug / ml) Rifampicin in dreifacher Ausführung. 0,1% DMSO als Vehikelkontrolle verwendet, da alle Inhibitorstammlösungen wurden mit 1 ul / ml in DMSO verwendet. Die Platte wurde in eine 37 ° C incubato zurückr bis 18 hpi. Zellen wurden für 15 Minuten durch Zugabe von 100 ul 8% PFA in alle Vertiefungen fixiert und in PBS lichtgeschützt gelagert, bis auf einem Plattenleser ausgelesen. Fluoreszenz-Messungen wurden mit einem Tecan Infinite M1000-Plattenlesegerät und i-Steuersoftware (v1.5.14.0) Bottom-Lese 4 Punkte pro Vertiefung bei Anregungs: Emissionswellenlängen von 515:530, 587:610, 415:457 nm für Venus , mCherry und TagBFP Fluorophore sind. Vor der endgültigen Messungen wurde optimiert, um eine maximale Verstärkung Signal ohne Sättigung der Sensoren ermöglichen (Gewinn war in der Regel 235, 255, 235 für Grün, Rot und Blau Messungen, beziehungsweise).
Abbildung 1. Vertreter Layout von Infektionen und medikamentöse Behandlungen auf 96-Well-Platte. Diagramm der 96-Well-Platte Infektion und kleines Molekül zusätzlich Schema für cr verwendetEssen repräsentative Ergebnisse. Dreifach-Fluoreszenz Virus (TRPV; helleren Grau) Expression frühen Venus, Zwischen mCherry und spät TagBFP oder Promotor weniger Venus (PLV, dunkler grau) sind in dreifacher Ausfertigung Säulen verwendet. 1-β-D-Arabinofuranosylcytosin (AraC), β-Isatin thiosemicarbazone (IBT), Rifampicin, ST-246 und DMSO Fahrzeugsteuerung mit geprüften Konzentration im rechten angezeigt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) für jede Wiederholung wurden für jeden Kanal normalisiert. Zuerst wurde die mittlere Fluoreszenzintensität für PLV Vertiefungen von der mittleren Intensität der TRPV Vertiefungen für jede Behandlung, um für die Hintergrundintensität durch jedes Medikament beigetragen Konto subtrahiert. Anschließend wurde dieser Wert durch den Hintergrund unterteilt abgezogen mittlere Intensität der DMSO-behandelten TRPV Brunnen (Wildtyp-Wachstum). Die nach der Behandlung mit bekannten po Ergebnissexvirus Inhibitoren war konsistent mit den zuvor veröffentlichten Ergebnisse und deren Wirkmechanismus verstanden. Die Einstellung der frühen Transkription und Übergang Zwischen Genexpression wurde gezeigt, dass die DNA-Replikation 17 erforderlich. In Übereinstimmung damit, AraC, einem Inhibitor der DNA-Replikation, zeigte einen dramatischen Anstieg in der frühen Genexpression (210% DMSO behandelt frühe Expression, Fig. 2) und das völlige Fehlen von Zwischen-und späte Expression (0,4% und 0,3% DMSO behandelt mittleren und späten Expression bzw. Abbildung 2). Obwohl der genaue Wirkmechanismus ist nicht für IBT definiert, wird angenommen, dass Durchlese-Transkription zu fördern, was zu erhöhten Mengen an dsRNA, die Aktivierung der RNase L-Weg und Apoptose 18-20. In Reaktion auf eine Behandlung IBT schrittweise schweren Phänotyp wurde in dem beobachteten mittleren und späten Expression signifikant weniger als DMSO allein (24,7% warenund 2,9% DMSO zu mittleren und späten Ausdruck behandelt sind; Abbildung 2). Eine konsistente, aber nicht statistisch signifikanten Abnahme frühen Fluoreszenz wurde auch beobachtet; aber dies ist wahrscheinlich auf IBT-induzierte Apoptose zu diesem späteren Zeitpunkt (74,0% DMSO bei 18 hpi). Im Gegensatz zu AraC und IBT, die Pockenvirus Drogen ST-246 und Rifampicin beide hemmen nach späten Genexpression während der Virionen und Reifung 15,16. Keine Änderungen in der Genexpression wurden in allen Phasen beobachtet, wenn Zellen wurden entweder mit ST-246 (100,9%, 98,5% und 94,5% DMSO behandelt früh, mittleren und späten Expression bzw. Abbildung 2) behandelt oder Rifampicin (107,6% 104,2% und 106,5% DMSO frühzeitig behandelt, mittleren und späten Ausdruck, beziehungsweise).
Historisch gesehen, eine Kombination aus niedrigen MOI (0,01-0,1 PFU / Zelle) und hohen MOI (5-10 PFU / Zelle) Wachstumstests werden verwendet, wenn die Erkundung der hemmende Effekt von einem neuen kleinen Molekül oder Virus-Mutante. Bei einer niedrigen MOI, sind insgesamt hemmende Wirkung oft von selbst geringfügige Hemmung übertrieben, da nur ein Teil der Zellen wird zunächst infiziert. Beim Versuch, den Punkt während einer Infektion Zyklus, bei dem ein Virus gehemmt zu definieren, ist ein hohes Trägheitsmoment Infektion wahrscheinlich besser geeignet, da alle Zellen werden durch Ihre primäre Inokulum infiziert. Die in Fig. 3 gezeigte Experiment wurde wie in Fig. 2 mit dem Zusatz von einem Satz von Vertiefungen, die an einem unteren MOI = 1 durchgeführt. Als Inhibitor, post-transkriptionell Funktionen sollten die ST-246 betrifft nicht das Stadium der Genexpression ; es ist jedoch klar, dass, wenn nur eine Untergruppe von Zellen ist infected (Fig. 3, MOI = 1) ist ersichtlich Hemmung aller Stufen des Ausdrucks (38,4%, 48,9% und 52,9% DMSO verglichen mit 100,9%, 98,5% und 94,5% bei MOI = 1 gegen MOI = 10 Befall der frühen, mittleren und späten Ausdruck sind; Abbildung 3). Annahme einer 100% igen Hemmung der Bildung von reifen Virionen ST-246, bedeutet dies 100% der Zellen wurden durch das MOI = 10 Infektionen und irgendwo zwischen 50 und 70% der Zellen produktiv während der Infektion MOI = 1 infiziert.
Abbildung 3. Effekt der Befall offensichtlich auf ST-246-Hemmung. HeLa-Zellen, wie in Abbildung 2 sowohl mit hohen infiziert (MOI = 10) und niedrig (MOI = 1) TRPV mit ST-246 behandelt. Relative Fluoreszenzeinheiten (RFU, Hintergrund abgezogen jeden Kanal auf der Basis on PLV Wachstum für jede Behandlung und normalisiert auf TRPV + DMSO) für Anfang (grün), Zwischen-(rot) und späten (blau) virale Expression in Zellen entweder MOI = 1 oder MOI = 10 und mit 20 &mgr; M ST behandelt 246. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
| Name | Beschreibung | Ref. |
| TRPV | Triple-Virus; C11R (Early) gefördert Venus, G8R (Mittel) gefördert mCherry, F17R (Ende) gefördert mTagBFP | 7 |
| PLV | Promoter lose Venus | |
| EV | C11R (Early) gefördert Venus | |
| IV | G8R (Mittel) gefördert Venus | |
| LV | F17R (Ende) gefördert Venus | |
| IREV | G8R (Mittel) gefördert mCherry und C11R (Early) gefördert Venus | |
| LREV | F17R (Ende) gefördert mCherry und C11R (Early) gefördert Venus | |
| LR | F17R (Ende) gefördert mCherry | |
| mCherry-A4L | N-terminale Fusion des VENUS Fluorophor des spät exprimierte virale Kernprotein A4L |
Tabelle 1. Liste der Vaccinia-Virus-Stämme Reporter. Tabelle beschreibt Fluoreszenz-Reporter-Viren.
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Discussion
Hier haben wir den praktischen Einsatz eines mehrstufigen Vaccinia-Reportervirus (TRPV), die reproduzierbar ist, Echtzeit-Feedback Maßnahmen der Virusreplikation liefert beschrieben. Durch die Verwendung von gut definierten Pockenvirus-Inhibitoren, konnten wir zeigen, dass TRPV reagiert in einer Weise, die mit dem Wirkmechanismus verstanden, für jeden Inhibitor. Während die TRPV Virus bietet die umfassendsten Informationen über Viren Bühne Progression, zweistufig (IREV, LREV) und einstufigen (EV, IV, LV)-Viren können auch in ähnlicher Weise verwendet werden, unter Ausnutzung der optimalen Proteinfaltung, Stabilität, und überlegene Signal-zu-Rausch-Verhältnis der Venus Fluorophors.
Die proof-of-concept-Assay in diesem Protokoll zeigt die Möglichkeit zum Identifizieren der Phase der viralen Genexpression durch bekannte Inhibitoren Pockenvirus in einer einfachen, mit hohem Durchsatz Plattentest erfolgen. Dieser Test kann um schnelle, umfassende Screening vervollständigenvon unbekannten chemischen Bibliotheken auch. Die Viren können verwendet werden, um kleine Moleküle behandelten Zellen bei niedrigen MOI infizieren, so dass für die spezifische Identifizierung von Verbindungen, die jede Phase des viralen Lebenszyklus zu blockieren. Die Inhibitoren können dann mit TRPV an mehreren MOIs auf die Bühne des Virus gehemmt Lebenszyklus zu bestimmen, von der Eingabe (keine Gen-Expression), zu früh, mittel oder spät Genexpression oder Montage (Voll Genexpression aber kein Virus Spread) zu sehen sein. Wir haben diese Technik verwendet, um eine neue Anti-Pockenvirus-Inhibitor mit Aktivität gegen mehrere Pockenviren, einschließlich Monkeypox 8 erfolgreich zu identifizieren.
Während wir Details für die Verwendung dieser Viren in einem Plattenleser-Format vorgesehen ist, ist es ebenso gut für die mikroskopische Untersuchung geeignet. Infektion und Beobachtung über Fluoreszenzmikroskop (siehe Fig. 2B) können für eine Zelle für Zelle Untersuchung der viralen Progression Stufe, welche nützlich sein könneneine gemischte Zellkultur-Einstellung, z. B. Infektion von einem Gewebe oder in viralen oder bakteriellen Koinfektion Bedingungen. Darüber hinaus, während diese Viren wurden für den Zweck der antiviralen Screening 8 erzeugt, erwarten wir, dass sie von gleicher Nützlichkeit in der Grundlagenforschung Untersuchung des Lebenszyklus von Vaccinia-Virus sein. Beispielsweise können diese Viren können leicht mit herkömmlichen Techniken oder modifiziert werden, um entweder fehlende virale Proteine überexprimieren; die Kinetik der Virus-Genexpression und Ausbreitung kann dann in Echtzeit für alle Stufen der viralen Transkription kontrolliert werden.
Untersuchungen von Virus-Wirt-Wechselwirkung kann durch die Verwendung von diesen Reporterviren profitieren. Diese Reporter ermöglichen schnelle Identifizierung der Phase der Virusreplikation während der Infektion von nicht-permissiven Zelltypen, wie beispielsweise bestimmte primäre Zelllinien, peripheren Blutleukozyten oder abweichende Spezies 21,22 abgeschlossen. Die gesammelten Informationen aus der Nutzung dieserWerkzeug wäre unser Wissen über Pockenvirus Wirtsspektrum Restriktionsfaktoren und die Funktion der viralen immunmodulatorischen Proteinen fördern. Die Viren sind auch nützlich, um das Stadium der Virusreplikation durch Knockdown von Wirtsfaktoren für eine Infektion erforderlich, entweder in einer Gesamtgenom-Skala oder in einem kleine Bibliothek gerichtet Bildschirm gesperrt identifizieren.
Mehrere Schritte in diesem Protokoll sollte als kritisch werden, wenn zu Beginn diese Viren in einem neuen System zu verwenden. Unterschiede in Plattenformat, Wachstumsmedien und Zelltyp kann Veränderung der MOI, Impfung Zeit oder Dauer der Inkubation benötigen. Es wird besonders wichtig, Endpunkt Inkubationszeit vor der Skalierung bis zu Hochdurchsatz-Format zu optimieren. Um die ideale Inkubationszeit zu ermitteln, sollte ein Pilot kinetische Plattentest durchgeführt werden (siehe Schritt 5). Während eines kinetischen Assay werden Fluoreszenzmessungen stündlich 12-24 Stunden und kann verwendet werden, um die Zeit festzulegen, auf der der grißt Unterschied zwischen Kontrolle und Behandlung Virus-Expressions beobachtet. Die Bedeutung dieser Schritt kann bei der Behandlung mit IBT, bei dem die Inhibierung aufgrund der erhöhten Apoptoseraten führen zu einer deutlich wird, obwohl nicht statistisch signifikante Abnahme der Expression früher. Sehen Wenn früheren Zeitpunkten (4-8 hpi) beobachtet würde es wahrscheinlich kein Unterschied sein. Darüber hinaus testet eine neuartige inhibitorischen Verbindung sollten mehrere Verbindungskonzentrationen enthalten. Während diese Fluoreszenz-Reporter-Viren sind in der Lage, minimale Veränderungen in der Genexpression zu erkennen, werden die zusätzlichen Informationen, die von mehreren Konzentrationen erhalten zu einem besseren Verständnis ihrer Gesamtwirkung führen.
Bei der Planung und Erstellung dieser Viren wurde viel Sorgfalt bei der Auswahl der Fluorophore, die hohen Signal-zu-Hintergrund-Eigenschaften haben 7 übernommen. Die Venus-Protein wurde als deutlich besser als alle anderen getesteten Fluor identifiziertophore, und deshalb wurde während der Entwicklung von Dreibett-, Doppel-, und Einzel fluoreszierenden Reporter-Viren eingesetzt. Eine Einschränkung der Verwendung dieses Fluorophor ist, dass sie nicht verwendet werden, um jede Zelllinie ein grün fluoreszierendes Reporterfusionsprotein enthält bereits infizieren. Analyse unter diesen Bedingungen anzusprechen, wurden mehrere alternative Viren mit rot fluoreszierenden Proteinen (Tabelle 1) erstellt. Durch die entweder lösliche mCherry aus der F17R späten Promotor oder ein mCherry-A4L Fusionsprotein aus dem natürlichen A4L späten Promotor sind wir in der Lage, ähnliche Messungen ohne Venus erreichen. Obwohl die Verwendung von mCherry nicht den zusätzlichen Vorteil von der Venus-Protein bereitgestellt sind wir nun in der Lage, Mess grün-exprimierenden Zelllinien unterzubringen.
Zusammenfassend haben wir eine Reihe von Reporter Vaccinia-Viren mit verschiedenen Anwendungen, einschließlich Hochdurchsatz-Plattenlesegerät oder hohen Gehalt Bildgebung entwickelt assays. Diese Viren werden Prüfung des viralen Lebenszyklus wesentlich schneller als mit herkömmlichen Methoden zu machen, und kann für die Grundlagenforschung als auch angewandte antivirale Forschung verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren und keine Patente auf Viren oder Screening-Verfahren anhängig.
Acknowledgments
Wir danken SIGA Technologies (Corvallis, OR) für die Bereitstellung von ST-246. DKR wurde durch ein NIH Ausbildungsförderung in der Immunologie an der Universität Boston (5T32AI 7309) unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil von P41 086180 unterstützt, NIH RO1AI1096159-01 und RO3 (bis JHC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
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