Summary
Descreve-se a utilização de um vírus vaccinia repórter fluorescente que permite a medição em tempo real da infectividade viral e a expressão do gene através da expressão específica da fase de fluoróforos espectralmente distintos repórter. Detalhamos um método baseado em placa para identificar com precisão a fase em que a replicação do vírus é afetada em resposta a pequena inibição molécula.
Abstract
Poxviruses são uma família de vírus de DNA fita dupla que incluem patógenos ativos humanos, tais como macacos, molusco contagiousum e vírus Contagalo. A família também inclui o vírus da varíola, da varíola. Devido à complexidade da replicação de poxvírus, muitas questões ainda permanecem em relação à sua estratégia de expressão gênica. Neste artigo, descreve-se a concepção e utilização de vírus vaccinia recombinantes que permitem a medição em tempo real das fases únicas e múltiplas de expressão de genes virais em um formato de alto rendimento. Esta é activada através da utilização de proteínas fluorescentes espectralmente distintos como repórteres para cada uma das três fases da replicação viral. Estes vírus proporcionar uma razão elevada de sinal-para-ruído de fase, mantendo padrões específicos de expressão, permitindo ensaios baseados em placas e as observações microscópicas de propagação de vírus e de replicação. Estas ferramentas têm usos para descoberta antiviral, os estudos sobre a interação vírus-hospedeiro, e bio evolutivologia.
Introduction
Tradicionalmente, a expressão do vírus é estudada, utilizando técnicas de biologia molecular (por exemplo, transferência de Northern, transferência de western, de microarray de hibridação, etc) 1. Enquanto estes métodos são capazes de fornecer a informação detalhada com respeito à categorização mudanças de mRNAs individuais ou de proteínas de expressão, que não são normalmente passíveis de processos em tempo real e de alto rendimento. Abordagens alternativas usando os repórteres à base de fluorescência foram aplicadas anteriormente ao trabalhar com poxvírus; no entanto, o seu desenvolvimento e uso foi motivado por objetivos variados. Vários destes métodos foram concebidos para a selecção de vírus recombinantes 2,3. Estas técnicas expressar EGFP com a incorporação apropriada e expressão de ADN exógena a partir de clones de vaccinia recombinantes. Da mesma forma, várias estirpes de vaccinia que expressam estavelmente EGFP solúveis ou proteínas GFP expressos sob um promotor de vacina nativa tem sido amplamente usado. Estes são typcamente utilizadas para quantificar a entrada do vírus e replicação durante ensaios de neutralização com base em anticorpos, inibição química, ou a comparação da eficácia antiviral 4-6. Embora esses vírus têm se mostrado útil, eles são limitados em sua capacidade de fornecer informações detalhadas sobre o ponto de inibição devido ao seu uso de um único promotor viral início / final ambíguo. Métodos anteriores também fizeram uso da proteína EGFP com características sub-ótimos sinal-ruído.
Devido à complexidade da replicação de poxvírus ea falta de ferramentas existentes disponíveis para analisar mudanças em tempo real na expressão genética viral, desenvolvemos um conjunto de vírus repórter fase única e multi 7,8. Conforme descrito em publicações anteriores, esses vírus expressar um, dois, ou três proteínas fluorescentes espectralmente distintas de promotores vaccinia nativas durante o início, etapas intermediárias, ou no final infecção. Esses vírus podem ser nósed como indicadores de andamento da replicação do vírus, utilizando um microscópio de fluorescência e que são igualmente adequados para a placa-e-leitor de ensaios à base de alto rendimento. Estes vírus são fáceis de usar no lugar do vírus de tipo selvagem, crescendo com cinética similar para alcançar títulos equivalentes 7. Durante o planejamento e criação desses vírus, muito cuidado foi tomado na seleção de fluoróforos que têm altas características de sinal-para-fundo com eficiência dobradura superiores para facilitar a quantificação confiável, com feedback rápido às mudanças na expressão (Vênus, mCherry e TagBFP). Além disso, as combinações de promotores virais foram escolhidos que produzem alta fidelidade, a expressão específica do estágio inequívoca, fornecendo informações sobre a gama completa de início (C11R promotor), intermediária (promotor G8R) e tardia (F17R promotor) a expressão do gene, em contraste com a ambígua promotores de início / final.
Estes vírus podem ser utilizados como uma ferramenta para a investigating o ciclo de vida do poxvírus, vírus vaccinia prototípico. Muito ainda não se sabe sobre a interação hospedeiro-vírus, apesar da sua longa história de estudo. Vaccinia é complexo, produzindo mais de 200 proteínas específicas, muitas das quais são imunomoduladores e hospedar antagônicos. Após a infecção, o vírus vaccinia imediatamente começa a transcrição do mRNA precoce. Isto é facilitado por uma RNA polimerase e transcrição fatores que foram carregados no genoma viral durante a embalagem virion e mantidas em um estado pausado até que a infecção subseqüente. Esta expressão precoce produz principalmente proteínas necessárias para a supressão do sistema imunológico hospedeiro (decapping mRNA, dsRNA seqüestro e proteínas receptoras chamariz, bem como inibidores de apoptose, resposta ao estresse, e Toll, IL, e sinalização NF-kB) e replicação do genoma. A expressão precoce também produz fatores necessários para a expressão intermediário de transcrição. Expressão intermédio inclui a expressão de fatores de transcrição fase final. Esteexpressão cascata leva à produção de proteínas de vírus estruturais e enzimáticas durante a fase tardia da infecção, que são necessários para a montagem completa do virião maduro vaccinia.
Nosso conjunto de vírus repórter fluorescentes permite um rápido progresso a ser feito na compreensão da biologia poxvírus. Um dos métodos mais comuns e demoradas no campo da virologia é o ensaio de crescimento. Isto tipicamente envolve a infecção de células, promulgação de uma série de tratamentos, o vírus da colheita por lise das células infectadas, e quantificando o título viral resultante por ensaio de placas. Usando os vírus repórter descritos aqui permite a medição em tempo real do crescimento do vírus que pode ser facilmente ensaiada e comparada entre os vários tratamentos realizados em paralelo. Prevemos este conjunto de reagentes serão utilizados em vários protocolos para a identificação de alterações na expressão de genes virais, em resposta a tratamento medicamentoso, o RNAi knockdown ou restrição gama de hospedeiros.
Este método também permite a análise de alto conteúdo em uma escala maior do que anteriormente disponível, permitindo a de alto rendimento telas de drogas anti-virais para estágios alvo bem definidas de interesse. Enquanto numerosos potenciais tratamentos para combater a infecção poxvírus têm sido identificadas, a FDA aprovou apenas terapias eficazes para o tratamento de infecção por poxvírus são o nucleosídeo acíclico fosfonato, Cidofovir, e tratamento com vaccinia imune 9,10 globulina. Apesar da erradicação da varíola em 1977 11, poxvírus continuam a ser uma ameaça significativa para a saúde humana 12. Cessação da vacinação generalizada contra o vírus da varíola levou a um aumento da susceptibilidade a outros poxvírus 13. Por exemplo, as regiões da África Central anteriormente protegidos pela vacinação está enfrentando um surto de infecções por vírus Monkeypox 14. Preocupação significativa também foilevantadas em relação a susceptibilidade latente a libertação intencional de vírus da varíola. Devido às terapias limitados actualmente disponíveis, há uma necessidade urgente de desenvolvimento de novos tratamentos. Estes vírus repórter permitir rastreio pequena molécula inibidora rápido e de alta produtividade para a inibição de um determinado estádio da replicação viral. Identificação de inibidores que visam estágios de expressão virais atualmente não alvo de inibição irá facilitar o desenvolvimento de terapias de combinação com o aumento da potência.
Muito pode ser adquirida sobre biologia celular vaccinia observando mudanças na expressão gênica de cada etapa. Atenuação por manipulação química ou genética de uma célula hospedeira infectada é normalmente expressa em termos de redução dos títulos virais. No entanto, comparando as alterações em cada fase da cascata de expressão viral, pode-se obter uma compreensão mais completa da forma como a aptidão do vírus é impactoed por um tratamento em particular. Estes dados foram mostrados para correlacionar bem com a saída título do vírus tradicional, mas fornecer informações mecanicista mais detalhada, bem como capacidades de alto rendimento 7.
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Protocol
1. Placa Células
- Dissociar células HeLa a partir de chapa e dilua em meio de crescimento (DMEM, 2 mM de L-glut, FBS a 10%) para aproximadamente 2,0 x 10 5 células / ml. Distribuir 100 ^ l / poço de uma, claro placa de 96 poços de fundo plano com paredes pretas (20000 células / poço).
- Incubar as células durante 24 horas até à confluência em uma incubadora a 37 ° C + 5% de CO 2.
2. Infectar as células
- Diluir vírus e infectar as células.
- Thaw TRPV (vírus Triplo; Precoce Vênus, Intermediário mCherry, Late TagBFP) e PLV (Promotor-less Vênus) vírus fluorescente e desagregar utilizando sonicação por 5 minutos. Alternativamente, os estoques de vírus em bruto pode ser misturado a 1:1 com 0,25 mg / ml de tripsina em meio de infecção e incubados a 37 ° C durante 30 min.
- Diluir stocks de vírus bruto em 37 ° C media de infecção (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). Para infecções de alto MOI (10 UFP / célula), diluir stock de virus para 1,0 x 10 7 PFU / ml assumindo 5 x 10 4células / poço e um volume de inoculo de 50 ul. Plano de infectar 3 poços réplicas para cada tratamento com TRPV e outros 3 poços idênticas para o mesmo tratamento com PLV para explicar a fluorescência de fundo específico para cada tratamento.
- Infect poços por adição de 50 ul / cavidade diluída em meio de infecção do vírus. Esta é definida como a infecção tempo = 0 hr post (0 hpi).
- Dilui-se os compostos de tratamento desejados para o meio de infecção. Para todos os tratamentos, uma única diluição 2x mestre mistura deve ser feita e aplicada a replicar poços (volume total de 350 ul, por exemplo para seis placas de 96 poços com 50 mL de cada).
- Dilui-se os compostos experimentais em meios de infecção.
- Dilui-controlo com o veículo solvente (por exemplo, PBS, DMSO) para o meio de infecção. Nota: parecidos concentrações finais de solventes de controle de veículo deve ser usado como aplicado para compostos experimentais (por exemplo, se o seu estoque IBT é feito com DMSO e utilizado numa concentratio finaisns de 1 ul / ml, em seguida, utilizar apenas DMSO a 1 mL / mL como o controlo do veículo).
- Dilui-se os compostos em meios de controlo de infecção. Compostos de controlo recomendadas incluem: 3,6 uM (1 ug / ml) 1-β-D-arabinofuranosilcitosina (AraC), 50 ^ M (11,7 mg / ml) de isatina β-tiossemicarbazona (TBI), 60 uM (50 ug / ml), rifampicina, ou 5 uM (1,9 ug / ml) de ST-246 8,15,16. Veja resultados representativos para efeitos esperados. Nota: certifique-esta diluição em duas vezes (2x), a concentração final desejada, desde que este é adicionado numa proporção de 1:1 para o volume já no poço.
- Imediatamente após a adição do vírus, adicionar 50 ul de meios de infecção contendo tratamentos e controles desejados como diluída no passo 2.2. Nota: Para ensaiar a inibição de expressão antes fase inicial, o composto (s) pode ser adicionado directamente à suspensão de inóculo de vírus diluído (passo 2.1.2) ou a células hospedeiras antes da infecção (antes do passo 2.1.3).
- Incubar 6-24 hr em um 37 & #176; incubadora C + 5% de CO 2.
3. Corrigir Células
- Fixar as células por adição de 100 ul de paraformaldeido a 8% mídia infecção já em cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos ao abrigo da luz. Nota: Recomenda-se adicionar 2x PFA (8%) diretamente para a mídia de infecção para evitar aerosolization de vaccinia infecciosa que pode ocorrer se a mídia de alta titulação é invertida diretamente no prato resíduos previamente à sua fixação.
- Remover fixador invertendo a placa para o prato de resíduos.
- Adicionar 100 ul de PBS temperatura ambiente.
- Selar placa com película adesiva opticamente clara. Nota: As placas podem ser armazenadas a 4 ° C se não for lida imediatamente. Certifique-se de retornar placas seladas à temperatura ambiente antes de ler para evitar a condensação de distorcer as medições espectrofotômetro.
4. Quantificar Vírus Crescimento
- Meça endpoint fluorescência em 515:530 para Vênus, 587:610 para mCherry, e 415:457 fou TagBFP (Excitação: comprimento de onda de emissão em nm). Quatro medidas devem ser em média por poço usando ajustes de ganho otimizados para cada canal. Nota: O comprimento de onda de emissão apropriado pode ser diferente, dependendo do modelo e do filtro características específicas do seu leitor de placas. Isto pode ser determinado empiricamente através da realização de um comprimento de onda de emissão de verificação para determinar o ponto em que não é a maior diferença entre TRPV e VLP para cada canal.
- Normalizar os dados brutos para facilitar a comparação entre experimentos.
- Para cada canal, determinar a média de TRPV replicar e poços PLV.
- Subtrair os médios medições de fundo PLV-infectados a partir das medições experimentais médios TRPV infectados para cada tratamento.
- Normalizar os dados pela divisão de cada fundo valor subtraído pelo valor somente veículo bem.
- Uma vez que um experimento foi repetido várias vezes, a análise de um teste de variância (one-way ANOVA) e vários cOMPARAÇÃO pós-teste pode ser executado para determinar se qualquer um dos tratamentos reflecte uma diferença estatisticamente significativa relativamente ao tratamento apenas com veículo, para cada canal.
. 5 Protocolo Alternativa: Ensaios de Placa cinéticos
- Execute todas as etapas através da adição de tratamentos (passo 2.3).
- Placa de vedação com película adesiva e coloque na câmara leitor de placas equilibrada a 37 ° C. Nota: Cuidado especial deve ser tomado para manter as placas de forma consistente a 37 ° C para prevenir o stress celular indevida e condensação. Para os ensaios cinéticos, é particularmente importante a utilização de um meio tamponado (bicarbonato de sódio e HEPES) para manter o pH adequado sem a adição de 5% de CO 2.
- Conjunto leitor de placas de ganhar manualmente para evitar a saturação de pontos de tempo posteriores. Nota: optimização ganho exacta pode ser obtida através da realização de ensaios de um ponto de extremidade, sob condições semelhantes.
- Adquirir leituras de hora em hora para 8-24 hpi e normalizar usando simiprocedimento lar como no ensaio endpoint (passo 4.2).
- Os pontos de tempo individuais podem ser analisadas para a significância estatística usando métodos semelhantes como o ponto final do ensaio anteriormente descrito.
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Representative Results
Como exemplo do uso típico destes vírus, o vírus da fluorescência repórter triplo foi utilizada para comparar o ponto de inibição de vários inibidores de poxvírus bem definidas.
As células HeLa foram colocadas em cultura de tecidos tratados claras placas de 96 poços de paredes pretas de fundo plano e incubadas durante a noite. As monocamadas confluentes foram infectadas a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 usando um triplo vírus repórter (TRPV; Tabela 1) ou o promotor menos Vénus (VLP), como detalhado no mapa da placa (Figura 1). Meios de infecção contendo os tratamentos foi adicionado para obter uma concentração final de DMSO de 0,1%, 3,6 uM (1 ug / ml) de AraC, 50 uM (11,7 ug / ml) IBT, 5 mM (1,9 ug / ml) de ST-246 ou 60 uM (50 ug / ml), rifampicina, em triplicado. 0,1% de DMSO foi usado como controlo do veículo uma vez que todos os stocks de inibidores foram utilizadas em 1 ul / ml em DMSO. A placa foi devolvido à temperatura de 37 ° C incubator até 18 hpi. As células foram fixadas durante 15 minutos por adição de 100 ul de 8% PFA a todos os poços e armazenado em PBS protegido da luz até ser lida num leitor de placas. As leituras de fluorescência foram realizadas utilizando um leitor de placas Tecan Infinito M1000 e software i-controle (v1.5.14.0) pela leitura de fundo 4 pontos por bem em comprimentos de onda de excitação: emissão de 515:530, 587:610, 415:457 nm para Vênus , fluoróforos mCherry, e TagBFP, respectivamente. Antes de medições finais, o ganho foi otimizado para permitir que o sinal máximo sem saturação de sensores (ganho era tipicamente 235, 255, 235 para verde, vermelho e medições Azul, respectivamente).
Figura 1. Disposição representativas de infecção e de tratamentos com drogas em placa de 96 poços. Diagrama do esquema de adição molécula de 96 poços infecção placa e pequeno usado para crcomer resultados representativos. Vírus fluorescente Triplo (TRPV; cinza mais claro) expressando cedo Vênus, mCherry intermediário e tarde TagBFP ou promotor menos Venus (PLV; cinza escuro) são utilizados em colunas triplicadas. 1-β-D-arabinofuranosilcitosina (AraC), isatina β-tiosemicarbazona (IBT), rifampicina, ST-246 e controle do veículo DMSO com concentração testada são indicadas à direita. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Unidades de fluorescência relativas (RFU) para cada replicado foram normalizados para cada um dos canais. Em primeiro lugar, a intensidade de fluorescência média de poços VLP foi subtraída da intensidade média dos poços TRPV para cada tratamento representam a intensidade de fundo contribuiu por cada fármaco. Em seguida, este valor foi dividido pelo fundo subtraído intensidade média de poços TRPV tratado com DMSO (crescimento de tipo selvagem). Os resultados obtidos após o tratamento com po conhecidoinibidores xvirus era consistente com os resultados publicados anteriormente e seu mecanismo de ação entendido. A cessação da transcrição do gene precoce e de transição para a expressão do gene intermediário tem sido demonstrado que requerem a replicação de DNA de 17. Consistente com isto, AraC, um inibidor de replicação de ADN, mostrou um aumento dramático na expressão do gene precoce (210% de expressão precoce tratado com DMSO; Figura 2) e uma completa ausência de intermediário e expressão tardia (0,4% e 0,3% de DMSO tratada expressão intermediária e tardia, respectivamente; Figura 2). Embora o mecanismo exato de ação não está definido para IBT, é pensado para promover a transcrição de leitura através de, resultando em aumento da quantidade de dsRNA, a ativação da via L e apoptose 18-20 RNase. Em resposta ao tratamento IBT um fenótipo progressivamente grave foi observada em que a expressão intermédia e final foram significativamente menos do que apenas DMSO (24,7%e 2,9% de DMSO tratada para expressão intermédio e final, respectivamente), Figura 2. Uma diminuição de fluorescência início consistente, mas não estatisticamente significativa também foi observada; no entanto, isto provavelmente devido à apoptose induzida por IBT neste ponto de tempo posterior (74,0% de DMSO a 18 hpi). Em contraste com AraC e TBI, os medicamentos de poxvírus ST-246 e rifampicina ambos inibem após a expressão do gene tardio, durante a montagem do virião e maturação 15,16. Não há alterações na expressão de genes foram observados durante todas as fases, quando as células foram tratadas com ST-246 (100,9%, 98,5%, e 94,5% de DMSO tratada precocemente, expressão intermédio e final, respectivamente; Figura 2) ou rifampicina (107,6%, 104,2% e 106,5% de DMSO tratada precocemente, a expressão intermediária e tardia, respectivamente).
Historicamente, uma combinação de baixa MOI (0,01-0,1 UFP / célula) e alto MOI (5-10 UFP / célula) ensaios de crescimento são usadas quando está a explorar o efeito inibidor de uma nova molécula pequena ou mutante do vírus. Uma baixa MOI, efeitos inibitórios globais são frequentemente exagerada por inibição, mesmo menor uma vez que apenas um subconjunto de células é inicialmente infectado. Quando se tenta definir o momento durante um ciclo de infecção pelo qual um vírus é inibida, uma infecção alta MOI é provavelmente mais adequado, tal como todas as células são infectadas pelo inoculo primário. A experiência apresentada na Figura 3 foi efectuada tal como na Figura 2, com a adição de um conjunto de cavidades que foram infectadas a uma MOI = 1 inferior. Como um inibidor que funciona pós-transcricionalmente, ST-246 não deve afectar qualquer fase da expressão do gene ; No entanto, é evidente que, quando apenas um subconjunto de células é infected (Figura 3, MOI = 1) há inibição aparente de todas as fases de expressão (38,4%, 48,9%, e 52,9% de DMSO, em comparação com 100,9%, 98,5%, e 94,5% para MOI = 1 vs MOI = 10 nível de infecção de expressão precoce, intermédio e tardio, respectivamente, e a figura 3). Assumindo 100% de inibição da formação do virião maduro por ST-246, isto significa que 100% das células foram infectadas com a MOI = 10, infecções e algures entre 50 e 70% das células foram infectadas de forma produtiva durante a infecção MOI = 1.
Figura 3. Efeito do nível de infecção em aparente inibição ST-246. Células HeLa infectadas como na Figura 2, com tanto alta (MOI = 10) e de baixo (MOI = 1) TRPV tratada com ST-246. Unidades de fluorescência relativa (RFU; fundo subtraído cada base o canaln crescimento de VLP para cada tratamento e normalizada para TRPV + DMSO) para precoce (verde), intermédia (vermelha) e tardia (azul) a expressão virai em células infectadas a uma MOI = 1 ou ou MOI = 10 e tratou-se com 20 ^ M-ST 246. Clique aqui para ver imagem ampliada.
| Nome | Descrição | Ref. |
| TRPV | Vírus triplo; C11R (início) promoveu Vênus, G8R (Intermediário) promoveu mCherry, F17R (Final) promoveu mTagBFP | 7 |
| PLV | Promotor-less Vênus | |
| EV | C11R (início) promoveu Vênus | |
| IV | G8R (Intermediário) promoveu Vênus | |
| LV | F17R (Final) promoveu Vênus | |
| IRev | G8R (Intermediário) promoveu mCherry e C11R (início) promoveu Vênus | |
| LREV | F17R (Final) promoveu mCherry e C11R (início) promoveu Vênus | |
| LR | F17R (Final) promoveu mCherry | |
| mCherry-A4L | Fusão N-terminal do fluoróforo VENUS para o final-viral expressa a proteína do núcleo A4L |
Tabela 1. Lista de estirpes de vírus de vaccinia repórter. Tabela descrevendo vírus fluorescência repórter.
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Discussion
Aqui, nós descrevemos o uso prático de um multi-estágio vírus vaccinia repórter (TRPV), que fornece em tempo real reprodutíveis medidas, feedback de replicação do vírus. Ao utilizar inibidores poxvírus bem definidos, fomos capazes de mostrar que TRPV responde de uma maneira consistente com o mecanismo entendido de ação para cada inibidor. Embora o vírus TRPV fornece as informações mais abrangentes sobre vírus progressão etapa, em duas etapas (iRev, LREV) e de fase única (EV, IV, LV) vírus também pode ser usado da mesma forma, aproveitando o enovelamento de proteínas ideal, estabilidade, e superior, a relação sinal-ruído do fluoróforo Vénus.
O ensaio de prova-de-conceito, neste protocolo indica a possibilidade de identificação da fase de expressão de genes virais efectuada por inibidores conhecidos de poxvírus num ensaio de placa de transferência simples, de alta. Este ensaio pode ser estendida para completar a triagem rápida e abrangentede bibliotecas químicas desconhecidas. Os vírus podem ser utilizados para infectar as células tratadas com moléculas pequenas em baixo MOI, que permite a identificação específica de compostos que bloqueiam qualquer fase do ciclo de vida viral. Os inibidores podem ser rastreados usando TRPV em vários MOIs para determinar a fase do ciclo de vida do vírus inibida, de entrada (sem a expressão do gene), até o início, intermediário ou tarde a expressão do gene ou conjunto (expressão do gene completo, mas não propagação do vírus). Nós temos usado essa técnica para identificar com sucesso um novo inibidor anti-poxviral com atividade contra vários poxvírus, incluindo Monkeypox 8.
Enquanto nós fornecemos detalhes para a utilização desses vírus em um formato de leitor de placas, é igualmente adequado para exame microscópico. Infecção e observação através de microscópio de fluorescência (ver figura 2B) permite um exame célula-por-célula de progressão fase viral, o que poderia ser útil nasum ambiente de cultura de células mista, tal como a infecção de um tecido, ou em condições de co-infecção virais ou bacterianas. Além disso, embora esses vírus foram criados com a finalidade de triagem antiviral 8, esperamos que eles sejam de igual utilidade em pesquisa básica investigar o ciclo de vida do vírus vaccinia. Por exemplo, estes vírus pode ser facilmente modificado usando técnicas tradicionais de qualquer falta ou sobre-expressam proteínas virais; a cinética da expressão do gene do vírus e propagação pode ser monitorado em tempo real para todos os estágios de transcrição virais.
As investigações sobre a interacção do vírus-hospedeiro podem beneficiar da utilização destes vírus, bem repórter. Estes repórteres permitem a rápida identificação da fase de replicação vírica durante a infecção completado de tipos de células não permissivas tais como certas linhas de células primárias, leucócitos de sangue periférico, ou de espécies diferentes 21,22. As informações recolhidas de utilizar esteferramenta seria ainda mais nosso conhecimento de fatores de restrição de faixa de acolhimento poxvírus ea função de proteínas imuno-moduladores virais. Os vírus também serão úteis para identificar a fase de replicação do vírus inibida por knockdown de factores do hospedeiro necessários para a infecção, em qualquer uma tela escala de todo o genoma, ou em uma tela de biblioteca pequena dirigida.
Diversas etapas deste protocolo deve ser considerado crítico quando começar a usar estes vírus em um novo sistema. Diferenças em formato de placa, meios de crescimento e tipo de célula pode exigir alteração de MOI, tempo de inoculação, ou duração da incubação. Torna-se particularmente importante para otimizar o tempo de incubação endpoint antes ampliação para o formato de alta taxa de transferência. Para determinar o tempo de incubação ideal, um ensaio em placa cinética piloto deve ser executada (ver o passo 5). Durante um ensaio cinético, as medições de fluorescência são feitas a cada hora durante 12-24 horas e pode ser usada para identificar o tempo em que o grcomes diferença é observada entre o controle e expressão tratamento vírus. A importância deste passo pode ser visto no tratamento com IBT, em que a inibição devido a um aumento das taxas de apoptose conduzem a uma aparente, embora não estatisticamente significativa diminuição na expressão inicial. Se houve momentos anteriores (4-8 IPH), que provavelmente haveria diferença observada. Além disso, o ensaio de um composto inibidor da novela deve incluir várias concentrações de compostos. Embora estes vírus fluorescência repórter é capaz de detectar pequenas alterações na expressão genética, a informação adicional obtida por vários concentrações podem levar a uma melhor compreensão do seu efeito geral.
Durante o planejamento e criação desses vírus, muito cuidado foi tomado na seleção de fluoróforos que têm altas características de sinal-para-fundo 7. A proteína foi identificada como Vénus significativamente melhor do que qualquer outro fluor testadosophore e, portanto, foi usado durante todo o desenvolvimento de vírus repórter fluorescentes triplos, duplos e individuais. Uma limitação para o uso deste fluoróforo é que ele não pode ser utilizado para infectar qualquer linha de células já contendo um repórter fluorescente verde da proteína de fusão. Para abordar análise sob estas circunstâncias, vários vírus alternativos foram criados usando as proteínas fluorescentes vermelhas (Tabela 1). Ao expressar ou mCherry solúvel a partir do promotor tarde F17R ou uma proteína de fusão mCherry-A4L do promotor tarde A4L natural que é capaz de realizar medições semelhantes sem Vênus. Embora o uso de mCherry não tem o benefício adicional fornecido pela proteína Vênus estamos agora em condições de acomodar medição em linhas de células verdes expressando.
Em resumo, temos desenvolvido um conjunto de vírus vaccinia repórter com várias aplicações, incluindo leitor de placas de alto rendimento ou de alta assa imagem conteúdoys. Estes vírus vai fazer exame do ciclo de vida viral muito mais rápido do que os métodos tradicionais, e pode ser usado para a ciência básica, bem como a pesquisa aplicada antiviral.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar e sem patentes estão pendentes de vírus ou métodos de rastreio.
Acknowledgments
Agradecemos SIGA Technologies (Corvallis, OR) para a prestação de ST-246. DKR foi apoiado por uma bolsa de formação NIH em imunologia para Boston University (5T32AI 7309). Este trabalho foi financiado em parte pelo P41 086.180, NIH RO1AI1096159-01, e SR3 (a JHC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
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