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Biology

इन विट्रो एकत्रीकरण assays में Hyperphosphorylated ताउ प्रोटीन का उपयोग

Published: January 2, 2015 doi: 10.3791/51537
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University
* These authors contributed equally

Summary

असंशोधित और hyperphosphorylated ताऊ प्रोटीन hyperphosphorylation निर्भर तेजी एकत्रीकरण कैनेटीक्स प्रकट करने के लिए दो में इन विट्रो एकत्रीकरण assays में इस्तेमाल किया गया। ये assays अल्जाइमर रोग की प्रगति को आबाद कि तंतुओं के लिए फार्म hyperphosphorylated ताऊ की प्रवृत्ति न्यूनाधिक कर सकते हैं कि यौगिकों के लिए भविष्य स्क्रीन के लिए मार्ग प्रशस्त हुआ।

Introduction

(ई) अल्जाइमर रोग tauopathies रूप में जाना जाता neurodegenerative विकारों का एक बड़ा संग्रह में से एक है। सर्वोत्कृष्ट विकृति अंतर्निहित tauopathy न्यूरॉन्स, astrocytes और microglia 1-4 में neurofibrillary tangles है, NFTs है। NFT घनत्व संज्ञानात्मक हानि 3,5 और न्यूरॉन हानि 6 के साथ संबद्ध करता है। NFT सीधे या बनती पेचदार तंतु (PHF) 7,8 कि रूपों (आगे से 'पी-ताऊ "के रूप में करने के लिए कहा गया है) मुख्य रूप से hyperphosphorylated ताऊ प्रोटीन होता है। ताउ न्यूरोनल संकेतन और तस्करी 9,10 के लिए आवश्यक है कि axonal परिवहन की सुविधा के लिए सोचा था कि एक सूक्ष्मनलिका जुड़े प्रोटीन होता है। प्रत्येक ताऊ अणु 2 से 3 सामान्य मस्तिष्क में फॉस्फेट, लेकिन tauopathy रोगियों 11 में कई परतों से phosphoryl सामग्री बढ़ गये हैं। एकाधिक kinases GSK3β (ग्लाइकोजन सिन्थेज़ काइनेज 3β) और CDK5 (cyclin-डे सहित ताऊ hyperphosphorylation के लिए योगदान करने की संभावना हैलटकता हुआ काइनेज 5) 12,13, लेकिन रोग फास्फारिलीकरण के लिए प्रत्यक्ष ट्रिगर मायावी 14 बनी हुई है। में या सूक्ष्मनलिका बाध्यकारी रूपांकनों के पास असामान्य फास्फारिलीकरण सूक्ष्मनलिका 15 से ताऊ विघटित, और पी-ताऊ अंततः NFT समावेशन में भाजन कर सकते हैं कि सीधे या बनती पेचदार तंतु में oligomerizes जहां somatodendritic डिब्बे, को ताऊ गलत स्थानीयकरण का कारण बनता है। ताऊ hyperphosphorylation, NFT गठन, और neurodegeneration के बीच करीब टाई पी-ताऊ tangles के apoptotic और अन्य साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना है, और इस प्रकार tauopathy neurodegeneration 16,17 के लिए अंतर्निहित कारण है कि एक प्रचलित परिकल्पना का नेतृत्व किया। इस आधार पर आधारित दवा स्क्रीन और जल्दी नैदानिक ​​परीक्षण 18 शुरू किया गया है। हालांकि, इस परिकल्पना चुनौतियों 19,20 चेहरे। उदाहरण के लिए, सांताक्रूज एट अल। ट्रांसजेनिक चूहों की संज्ञानात्मक कार्यों एक उत्परिवर्ती की अभिव्यक्ति को दबा द्वारा सुधार किया जा सकता है कि पता चलाNFTs मौजूदा ताऊ अणुओं 21 से फार्म जारी रखा, भले ही मानव ताऊ,। एक ड्रोसोफिला मॉडल में, NFT अंतर्निहित न्यूरॉन कोशिकाओं 22,23 की रक्षा के लिए विषाक्त साइटोसोलिक ताऊ पृथक करने के लिए दिखाया गया था। जाहिर है, NFT के रोगजनन भूमिका, यदि कोई हो, बहुत tauopathy चिकित्सा विज्ञान के विकास की दिशा को प्रभावित करेगा।

कई β पत्र वरीय फ्लोरोसेंट रंजक, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और रोशनी बिखरने स्पेक्ट्रोस्कोपी 24-27 के बंधन से संकेत के रूप में उच्च सांद्रता, पुनः संयोजक या सामान्य मस्तिष्क ताऊ प्रोटीन में अनायास लेकिन धीरे-धीरे, इन विट्रो में एक PHF जैसी संरचना में polymerizes। जोड़ना हेपरिन या arachidonic एसिड, मानव मस्तिष्क में एक प्रचुर मात्रा में फैटी एसिड, काफी ताऊ isoform- और inducer के एकाग्रता पर निर्भर शिष्टाचार 28-32 में PHF गठन accelerates। दिलचस्प, hyperphosphorylated ताऊ ई दिमाग से शुद्ध या एक विट्रो फास्फारिलीकरण प्रतिक्रियाओं में संपूर्ण द्वारा तैयारतेजी से ggregates और अधिक कुशलता से 26,33-35। इन परिणामों के पी-ताऊ के रोग भूमिकाओं के साथ उत्कृष्ट समझौते में हैं। पी-ताऊ के एकत्रीकरण के आधार पर इन विट्रो प्रणाली इस प्रकार ईस्वी दवा स्क्रीनिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में सेवा कर सकता है।

ताऊ एकत्रीकरण और विज्ञापन की प्रगतिशील neurodegeneration के बीच निकट सहयोग है, साथ ही Aβ पट्टिका को लक्षित दवा के विकास में हाल ही में विफलता, ई 36-38 की एक और महत्वपूर्ण ऊतकीय मार्कर, ताऊ एकत्रीकरण बढ़ रहा है कि नियंत्रण दवाओं की खोज में रुचि को देखते हुए। दरअसल, कई समूहों को पहले से ही प्राथमिक परख के रूप में इन विट्रो ताऊ एकत्रीकरण प्रतिक्रियाओं में उपयोग करते हुए, विभिन्न throughput में दवा स्क्रीन शुरू कर दिया है। रसायनों के एक नंबर के लिए इन विट्रो 39-42 में ताऊ एकत्रीकरण पर निरोधात्मक या उलट गतिविधियों प्रदर्शन करने के लिए पाए गए। हालांकि, सभी मौजूदा ताऊ एकत्रीकरण नियामक स्क्रीन भास्वर के प्रमुख रोग निशान याद करते हैं कि असंशोधित ताऊ का उपयोगylation, ई उपचार में इन यौगिकों का उपयोग करने की विशिष्टता और प्रभावकारिता के लिए एक चिंता का विषय बढ़ गई है।

जैव रासायनिक लक्षण वर्णन और ई दवा स्क्रीनिंग के लिए एकत्रीकरण assays के विकसित होने का प्रमुख बाधाओं में से एक pathophysiologically प्रासंगिक hyperphosphorylated ताऊ प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा का उत्पादन होता है। ताऊ की 1N4R isoform और जीएसके-3β काइनेज ई में व्यक्त सह रहे हैं, जिसमें जिपर-असिस्टेड कटैलिसीस प्रणाली का प्रयोग कोलाई leucine जिपर संलयन प्रोटीन के रूप में, हम इस चुनौती को दूर किया है। (सुई एट अल, प्रस्तुत, ताऊ और पी-ताऊ के अंतिम उत्पादों के लिए चित्रा 1 देखें, यह भी पी-ताऊ की प्रारंभिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री लक्षण वर्णन के लिए 43 देखें)। ताऊ के विभिन्न फास्फारिलीकरण साइटों के लिए विशिष्ट नौ एंटीबॉडी के एक पैनल से, सकारात्मक संकेतों के आठ पदों में देखा गया था (डेटा) नहीं दिखाया। नीचे, हम एकत्रीकरण गतिज डी अंतर कर सकते हैं कि प्रोटोकॉल और इंस्ट्रुमेन्टेशन्स का वर्णनअसंशोधित ताऊ और पी-ताऊ प्रजातियों के बीच ifferences। ये assays एमीलोयड (ताऊ समुच्चय) पर thioflavin टी (tht) या thioflavin एस (THS) के प्रतिदीप्ति की वृद्धि 26 से बाध्यकारी मापा कि प्रकाशित प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है। पहली "टर्मिनल" में, कोई डाई दृष्टिकोण, एकत्रीकरण प्रतिक्रियाओं इकट्ठा कर रहे हैं और एमीलोयड डाई के अभाव में incubated। अलग समय बिंदुओं पर, प्रत्येक प्रतिक्रिया का एक विभाज्य निकाल दिया जाता है और ताऊ समुच्चय बाध्य करने के लिए tht एकत्रीकरण रोकने के लिए और अनुमति देने के लिए tht युक्त बफर के बराबर मात्रा के साथ मिलाया। प्रतिदीप्ति एक आईएपी FluoroMax-2 fluorometer से मापा जाता है। "साथ-डाई" दूसरी में लगातार निगरानी परख, tht या ths एकत्रीकरण प्रतिक्रियाओं में शामिल है। प्रतिदीप्ति मैन्युअल रूप से पूरे प्रयोग के दौरान लगातार मापा या एक बहु-प्लेट रीडर का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, हम नित्य माप मो में एकत्रीकरण के लिए ताऊ और पी-ताऊ के पास शारीरिक एकाग्रता का उपयोग करता है कि एक परख का वर्णनडी। फास्फारिलीकरण के प्रभाव को आसानी से detectable बनी हुई है। नीचे, हम कदम-दर-कदम आपरेशन प्रक्रियाओं का वर्णन है, और इन assays के प्रतिनिधि परिणाम दिखाई देंगे। प्रत्येक दृष्टिकोण के पेशेवरों और विपक्ष में से कुछ की चर्चा है, साथ ही संभावित दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों का पालन करेंगे।

एक उच्च एकाग्रता में, ताऊ अनायास एमीलोयड संरचनाओं की तरह में समुच्चय। हालांकि, प्रयोगशाला में, ताऊ fibrillization आम तौर पर इस तरह के inducers के रूप में हेपरिन (औसत आणविक वजन, 6000 ग्राम / मोल) और arachidonic एसिड द्वारा त्वरित है। इस के साथ साथ दिखाया उदाहरण 30 माइक्रोन हेपरिन शामिल हैं। ताऊ एमीलोयड समुच्चय के गठन thioflavin टी (tht) द्वारा या एस (THS) thioflavin बाध्यकारी एमीलोयड से उत्पन्न प्रतिदीप्ति द्वारा नजर रखी है। (:;: 485 एनएम पीक उत्सर्जन 450 एनएम उत्तेजना) ताऊ समुच्चय के लिए बाध्य करने पर, tht प्रतिदीप्ति में एक लाल रंग की पारी दर्शाती है। Ths, दूसरे हाथ पर, एमीलोयड बाध्यकारी से पहले 510 एनएम (450 एनएम पर उत्तेजना) में कमजोर उत्सर्जन है, लेकिन इस fluorescencऐसे एकत्रित ताऊ 44 के रूप में काफी एक amyloid प्रोटीन की उपस्थिति में ई बढ़ जाती है। दोनों रंगों ताऊ और पी-ताऊ एकत्रीकरण का पता लगाने में अच्छी तरह से काम करते हैं। क्योंकि tht (देखें चित्र 2) के मजबूत और अपेक्षाकृत व्यापक उत्सर्जन चोटी के, 510 एनएम पर प्रतिदीप्ति इकाई में केवल 30% की कमी नहीं है। या तो डाई का उपयोग करते समय सुविधा के लिए, हम ताऊ एकत्रीकरण नजर रखने के लिए / उत्तेजना उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य (यानी, 450 एनएम / 510 एनएम) की एक ही संयोजन का उपयोग करें।

ताउ एकत्रीकरण परख के उद्देश्य और ताऊ प्रोटीन की उपलब्धता पर निर्भर करता है, डाई की उपस्थिति या अनुपस्थिति में किया जा सकता है। प्रतिक्रियाओं के दोनों मोड नीचे दिखाई जाती हैं। एक एकल नमूना fluorometer (ईसा-SPEX FluoroMax-2) और एक बहु-प्लेट रीडर (SpectraMax M2) - इसके अलावा, हम दो विभिन्न उपकरणों के संचालन प्रदर्शित करता है। पाठकों को उनकी विशिष्ट जरूरतों और साधन की उपलब्धता के अनुरूप करने के लिए इन प्रोटोकॉल अनुकूलित करने में सक्षम होना चाहिए।

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Protocol

अभिकर्मकों के 1. तैयारी

  1. एकत्रीकरण बफर तैयार (20 मिमी Tris, पीएच 7.4, 100 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA)। महीनों के लिए, आरटी पर स्थिर स्टोर। उपयोग करने से पहले 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) अनुपूरक।
    नोट: एक HEPES आधारित बफर (10 मिमी HEPES, पीएच 7.5, 0.1 मिमी EDTA, 5 मिमी डीटीटी) भी ताऊ एकत्रीकरण में इसी तरह के परिणाम पैदा करता है।
  2. टी thioflavin या 0.22 बाँझ फिल्टर यूनिट द्वारा एस शेयर (एकत्रीकरण बफर में भंग 3 मिमी,) समाधान है, और फिल्टर thioflavin तैयार करें। महीनों के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी से स्थिर कवर एक ट्यूब में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. (300 माइक्रोन, एकत्रीकरण बफर में भंग) हेपरिन शेयर समाधान तैयार है। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, महीने के लिए स्थिर।
  4. (पानी में भंग 1 एम) dithiothreitol (डीटीटी) स्टॉक तैयार करें। 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में विभाज्य। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। एकत्रीकरण assays के पहले, आरटी पर 1 एम समाधान पिघलना। इस 1,000x स्टॉक से, विआयनीकृत पानी के साथ शेयर काम कर रहे 100 मिमी की एक विभाज्य तैयार करते हैं। बर्फ पर छोड़ दोतैयार है जब तक।
  5. डिग्री सेल्सियस फ्रीजर -80 से ताऊ निकालें। बर्फ पर गला लें। एकत्रीकरण बफर के साथ पूर्व निर्धारित एकाग्रता के लिए ताऊ को समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,800 XG पर एक microcentrifuge में स्पिन पूर्व गठित बड़े समुच्चय को हटाने के लिए। इस पूर्व कताई कदम प्रोटीन प्रस्तुत करने के प्रत्येक बैच के बाद प्रतिदीप्ति माप में स्थिरता बढ़ जाती है। एक और ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण; एकत्रीकरण प्रतिक्रिया इकट्ठा करने के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर छोड़ दें।

2. कोई डाई, टर्मिनल परख

नोट: इस परख के एकत्रीकरण प्रतिक्रिया फ्लोरोसेंट रंजक के अभाव में किया जाता है। सभी घटकों के मिश्रण के बाद, प्रतिक्रिया पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति दी है। Aliquots तो एकत्रीकरण प्रतिक्रिया से बाहर ले जाया गया और tht या प्रतिदीप्ति पढ़ने से पहले बाध्यकारी एमीलोयड के लिए ths के साथ मिश्रित कर रहे हैं। एकत्रीकरण प्रतिक्रिया की प्रारंभिक मात्रा की जरूरत समय बिंदुओं की संख्या पर निर्भर करता है। यह दृष्टिकोण requ सकता हैताऊ प्रोटीन की एक बड़ी राशि का गुस्सा है, लेकिन स्पष्ट, तेज है, और एक fluorometer या एक बहु अच्छी तरह से थाली पाठक (चर्चा देखें) में किया जा सकता है। नीचे कदम-दर-कदम आपरेशन, है प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव के लिए ईसा SPEX FluoroMax-2 कॉम्पैक्ट spectrofluorometer इस्तेमाल करते हैं।

  1. तालिका 1 में के रूप में 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में एकत्रीकरण मिश्रण सेट करें। प्रत्येक स्तंभ एक समय बिंदु माप के लिए पर्याप्त है, जो एक 100 μl प्रतिक्रिया, के लिए आवश्यक सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है। विशेष रूप से प्रयोग के लिए आवश्यक समय बिंदुओं के आधार पर पूरे एकत्रीकरण मिश्रण के लिए राशि को समायोजित करें। त्रुटि pipetting के लिए कमरे देने के लिए प्रत्येक घटक के अतिरिक्त 10% जोड़ें। यहाँ दिखाया ठेठ प्रतिक्रिया युक्त हेपरिन arachidonic एसिड या एकत्रीकरण बफर द्वारा बदला जा सकता है। प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए 1 मिमी डीटीटी जोड़ें। पूरे प्रतिक्रिया एक दिन से अधिक समय तक रहता है, तो एक कम करने के वातावरण सुनिश्चित करने के लिए नए सिरे से डीटीटी हर रोज (1 मिमी) के पूरक है।
  2. मिश्रण करने के लिए ट्यूब कुछ बार पलटना। पीएलएएक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर या नहाने के पानी में प्रत्येक प्रतिक्रिया सीई। आंदोलन ताऊ एकत्रीकरण के लिए आवश्यक नहीं है।
  3. प्रतिदीप्ति मापने से पहले, (कंप्यूटर पहले, फिर दीपक) spectrofluorometer पर बारी।
    नोट: सही दूर किया जा सकता है कि क्सीनन चाप दीपक। हालांकि, के लिए सबसे अच्छा परिणाम मशीन प्रतिदीप्ति पढ़ने से पहले के बारे में 10 मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं।
  4. कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर शुरू करो।
    1. 510 एनएम (5 एनएम के लिए भट्ठा) करने के लिए साधन नियंत्रण केंद्र में वास्तविक समय प्रदर्शन मोड, (2 एनएम के लिए भट्ठा) 450 एनएम के लिए सेट उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य चुनें। बंद रीयल टाइम प्रदर्शन मोड खिड़की साधन नियंत्रण केंद्र पर लौटने के लिए।
    2. तरंग दैर्ध्य सेट जोड़ने के लिए ऊपरी फ्रेम में लगातार वेवलेंथ विश्लेषण, प्रेस जोड़ें >> कुंजी चुनें। एक करने के लिए मानक त्रुटि के सेट अधिग्रहण मापदंडों और 3 के लिए अधिकतम शुल्क परीक्षण, फिर जोड़ें क्लिक करें। ! जाएं पर क्लिक करें प्रदर्शन डेटा को खोलने के लिएविंडो।
    3. डाटा प्रदर्शन खिड़की में, नया नमूना संवाद बॉक्स खोलने के लिए प्रारंभ ACQ क्लिक करें। नमूना प्रकार के लिए "अज्ञात" चुनें।
  5. हर 100 μl एकत्रीकरण मिश्रण करने के लिए, 98 μl एकत्रीकरण बफर और टी Pipet कई बार मिश्रण करने के लिए 3 मिमी thioflavin 2 μl जोड़ें।
  6. एक क्युवेट (FCA3, बाहरी आयाम, wxlxh = 12.5 मिमी x 12.5 मिमी x 45 मिमी) के लिए पूरे मिश्रण स्थानांतरण। नमूना डिब्बे में नमूना धारक में क्युवेट प्लेस और ढक्कन बंद कर दें। प्रतिदीप्ति डेटा एकत्र करने के लिए चलाएँ क्लिक करें। डेटा रिकॉर्ड।
  7. क्युवेट निकालें और समाधान छानना। आसुत जल में 3 बार से क्युवेट कुल्ला। में और क्युवेट बाहर की हवा बह द्वारा सूखी।

साथ-डाई 3. एक SpectraMax M2 के प्लेट रीडर पर नित्य मोड परख

नोट: यह परख फ्लोरोसेंट रंजक tht या ths aggrega में शामिल है कि में पिछले एक से अलग हैtion के प्रतिक्रिया। इस प्रतिक्रियाओं का एक ही सेट का निरंतर माप की अनुमति देता है। (SpectraMax M2 के आपरेशन के नीचे दिखाया गया है) की वजह से प्रतिक्रिया का दोहराव उपयोग की, इस पद्धति बेहतर एक स्वत: बहु अच्छी तरह से थाली पाठक के साथ किया जाता है। एक नियमित रूप से fluorometer भी काम करता है, लेकिन तेजी से एकत्रीकरण प्रतिक्रियाओं की माप की आवृत्ति के कारण आपरेशन के मार्गदर्शन प्रकृति के कारण, कुछ हद तक सीमित है।

  1. (96 अच्छी तरह से काले ठोस थाली, अच्छी तरह से मात्रा 360 μl, फ्लैट नीचे) तालिका 2 में के रूप में एक 96 अच्छी तरह से थाली में एकत्रीकरण मिश्रण सेट करें। प्रत्येक स्तंभ एक के लिए पर्याप्त है, जो एक 200 μl प्रतिक्रिया, के लिए आवश्यक सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है समय बिंदु माप। कई बार pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। प्रयोगों के पाठ्यक्रम में हर दिन ताजा 1mm डीटीटी अनुपूरक।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह से थाली सेते हैं।
  3. प्रतिदीप्ति माप से पहले हर समय बिंदु पर, बहु मोड microplate रीडर और कंप्यूटर पर बारी। माँ के लिए पर्याप्त समय की अनुमतिसिलसिला, के बारे में 10 मिनट के स्थिर करने के लिए।
  4. कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर शुरू करो। 37 डिग्री सेल्सियस तापमान सेट और प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफआई टॉप पढ़ें) मोड, 510 एनएम पर 450 एनएम और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर सेट उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का चयन करें।
  5. दराज में 96 अच्छी तरह से थाली डालें और माप शुरू करने के लिए पढ़ें कुंजी दबाएँ।
  6. पढ़ने के बाद, थाली को हटाने और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के लिए इसे वापस लौट आते हैं। डेटा विश्लेषण और साजिश रचने के लिए एक एक्सेल स्प्रेडशीट में डेटा कॉपी और पेस्ट।

4 के साथ-डाई, नित्य मोड परख एक कॉम्पैक्ट Spectrofluorometer पर

  1. 3 टेबल के रूप में 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में एकत्रीकरण मिश्रण सेट करें। प्रत्येक स्तंभ एक समय बिंदु माप के लिए पर्याप्त है, जो एक 200 μl प्रतिक्रिया, के लिए आवश्यक सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है।
  2. मिश्रण करने के लिए ट्यूब कुछ बार पलटना।
  3. Spectrofluorometer पर मुड़ें और चरणों 2.3 और 2.4 में के रूप में सॉफ्टवेयर की स्थापना की।
  4. पूरे मिश्रण टी स्थानांतरणOA क्युवेट। नमूना डिब्बे में नमूना धारक में क्युवेट प्लेस और ढक्कन बंद कर दें। प्रतिदीप्ति डेटा एकत्र करने के लिए चलाएँ क्लिक करें। डेटा रिकॉर्ड।
  5. डेटा चलाएँ क्लिक करके और रिकॉर्डिंग से उपयुक्त अंतराल पर पढ़ने जारी रखें। एकत्रीकरण एक उच्च आवृत्ति (जैसे, हर 30 या 60 सेकंड) पर नजर रखी जा करने के लिए है, तो या तो माप समाप्त हो गया है जब तक मशीन क्युवेट में और में प्रतिक्रिया छोड़ दें, या प्रतिक्रिया या cuvettes स्वैप करने के लिए पर्याप्त समय है जब वहाँ।
  6. क्युवेट निकालें और समाधान छानना। आसुत जल में 3 बार से क्युवेट कुल्ला। में और क्युवेट बाहर की हवा बह द्वारा सूखी।

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Representative Results

पुनः संयोजक ताऊ और पी-ताऊ (चित्रा 1) का उपयोग करना, हम प्रोटीन समुच्चय amyloidal के लिए बाध्य करने पर tht और ths की मजबूत प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की, सहित ताऊ लाभ ले रही है, ताऊ और पी-ताऊ के एकत्रीकरण के कैनेटीक्स तुलना करने के लिए दो अलग अलग प्रोटोकॉल स्थापित और पी-ताऊ (चित्रा 2)। के साथ या एकत्रीकरण प्रतिक्रिया में फ्लोरोसेंट डाई के बिना, हम hyperphosphorylation (आंकड़े 3-5) द्वारा ताऊ एकत्रीकरण के अनुरूप वृद्धि मनाया। इस उत्तेजना हेपरिन से स्वतंत्र है (डेटा) नहीं दिखाया। (आंकड़े 3 और 5), पी-ताऊ प्रयोग के पाठ्यक्रम में उच्च प्रतिदीप्ति इकाइयों का प्रदर्शन के साथ काफी धीमा होने से पहले पहले 30 मिनट के भीतर तेजी से दरों पर एक ठेठ प्रतिक्रिया, ताऊ और पी-ताऊ oligomerize में। एकत्रीकरण प्रतिक्रियाओं में tht सहित एकत्रीकरण की दर (चित्रा 4) में महत्वपूर्ण मंदता का कारण बनता है। दोनों isoforms के पास पहुंचे बेनीप्रतिक्रियाओं के बाद Eau 160 घंटा शुरू की थी। Ths, दूसरे हाथ पर, एकत्रीकरण (चित्रा 5) की प्रशंसनीय मंदी का कारण नहीं है।

चित्रा 1

नमूने एक 10% एसडीएस पृष्ठ जेल के द्वारा हल किया है, और Coomassie नीले R250 (बाएं) द्वारा दाग या (ठीक एक विरोधी ताऊ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा जांच कर रहे थे। इस अध्ययन में इस्तेमाल चित्रा 1. ताऊ और hyperphosphorylated ताऊ (पी-ताऊ) शुद्ध पैनल)। लेन एम, आणविक वजन मार्कर; गलियों 1 और 3, unphosphorylated ताऊ; lane2 और 4, hyperphosphorylated ताऊ।

चित्रा 2

के साथ या ताऊ समुच्चय बाध्यकारी बिना tht (30 माइक्रोन) के लिए चित्रा 2 उत्सर्जन स्पेक्ट्रा। उत्सर्जन अधिग्रहण किया गया है 450 एनएम पर उत्तेजना, 600 एनएम (0.1 सेकंड एकीकरण, 5 एनएम भट्ठा चौड़ाई एक एनएम वेतन वृद्धि) के लिए 460 एनएम से डिब्बा बंद। ताउ समुच्चय 50 माइक्रोन ताऊ एकत्रीकरण 37 डिग्री सीओ / एन (विवरण के लिए प्रोटोकॉल 2 देखें) पर आगे बढ़ने के लिए अनुमति देकर प्राप्त किया गया।

चित्रा 3

टर्मिनल परख में ताऊ और पी-ताऊ के लिए चित्रा 3. एकत्रीकरण घटता। एकत्रीकरण 50 माइक्रोन के ताऊ और पी-ताऊ inducer के रूप में 30 माइक्रोन हेपरिन के साथ पूरा किया गया। प्रतिक्रिया की शुरुआत के बाद अलग अलग समय पर, प्रतिक्रिया के 100 μl हटा दिया गया था और प्रतिदीप्ति माप से पहले 60 माइक्रोन tht का एक ही मात्रा के साथ मिलाया। प्रतिदीप्ति 450 एनएम उत्तेजना, 510 एनएम उत्सर्जन पर मापा गया था। "औ", मनमाना इकाइयों। समय के पैमाने मिनट में है कि ध्यान दें।

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अकेले tht के लिए चित्रा 4. एकत्रीकरण घटता, tht की उपस्थिति में नित्य माप मोड में ताऊ और पी-ताऊ। प्रत्येक प्रतिक्रिया शून्य या 50 माइक्रोन ताऊ या पी-ताऊ, 30 माइक्रोन हेपरिन के शामिल है, और एकत्रीकरण बफर में 30 माइक्रोन tht । प्रतिक्रियाओं एक 96 अच्छी तरह से थाली में 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थे। अलग समय बिंदुओं पर, थाली इनक्यूबेटर से हटा दिया गया था और प्रतिदीप्ति पढ़ने (उत्तेजना 450 एनएम, उत्सर्जन 510 एनएम) के लिए थाली पाठक को भरा हुआ है। रीडिंग के बीच, थाली एक कवर के तहत आंदोलन के बिना इनक्यूबेटर में रखा गया था। tht की उपस्थिति काफी अपने असंशोधित समकक्ष की तुलना में महत्वपूर्ण बात, hyperphosphorylated ताऊ अभी भी एकत्रीकरण की एक तेज दर का प्रदर्शन किया, एकत्रीकरण धीमा है, लेकिन। समय के पैमाने घंटों में है कि ध्यान दें।

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Thioflavin सूचक डाई के रूप में एस के साथ चित्रा ths की उपस्थिति में 5. छोटे पैमाने पर ताऊ एकत्रीकरण assays के। 6 माइक्रोन ताऊ और पी-ताऊ की इन विट्रो हेपरिन प्रेरित एकत्रीकरण नित्य माप मोड में मूल्यांकन किया गया था। प्रोटीन के अलावा, प्रत्येक प्रतिक्रिया 30 माइक्रोन हेपरिन और HEPES के एकत्रीकरण बफर (10 मिमी HEPES पीएच 7.5, 5 मिमी डीटीटी, 0.1 मिमी EDTA) में 20 माइक्रोन ths निहित। हेपरिन के अलावा सभी सामग्री मिलाया और आरटी पर equilibrated थे। हेपरिन जोड़ने के बाद, प्रतिक्रिया क्युवेट करने के लिए स्थानांतरित किया गया था और नमूना धारक में रखा। प्रतिदीप्ति टी 0 के रूप में तुरंत दर्ज की गई है, और के बारे में 2 घंटे के लिए या प्रतिदीप्ति वृद्धि के पास शून्य करने के लिए धीमा तक जारी किया गया था। क्योंकि अपेक्षाकृत कम प्रतिक्रिया अवधि के पूरे प्रतिक्रिया वही क्युवेट में आरटी पर बाहर किया गया था।

ताऊ पी-ताऊ
60-100 माइक्रोन ताऊ 50 μl 0 μl
60-100 माइक्रोन पी-ताऊ 0 μl 50 μl
300 माइक्रोन हेपरिन 10 μl 10 μl
एकत्रीकरण बफर 39 μl 39 μl
100 मिमी डीटीटी 1 μl 1 μl

टेबल नहीं-डाई के लिए 1. एकत्रीकरण मिश्रण घटकों, टर्मिनल परख।

ताऊ पी-ताऊ अकेले डाई
60-100 माइक्रोन ताऊ 50 μl 0 μl 0 μl
60-100 माइक्रोन पी-ताऊ 0 μl 50 μl
300 माइक्रोन हेपरिन 20 μl 20 μl 20 μl
टी thioflavin 3 मिमी 2 μl 2 μl 2 μl
एकत्रीकरण बफर 126 μl 126 μl 176 μl
100 मिमी डीटीटी 2 μl 2 μl 2 μl

एक प्लेट रीडर पर साथ-डाई, नित्य परख के लिए तालिका 2 एकत्रीकरण मिश्रण घटकों।

ताऊ पी-ताऊ अकेले डाई
60-100 माइक्रोन ताऊ 5 μl 0 μl 0 μl
60-100 माइक्रोन पी-ताऊ 0 μl 5 μl 01, एल
300 माइक्रोन हेपरिन 20 μl 20 μl 20 μl
एस thioflavin 3 मिमी 1.5 μl 1.5 μl 1.5 μl
एकत्रीकरण बफर 171.5 μl 171.5 μl 176.5 μl
100 मिमी डीटीटी 2 μl 2 μl 2 μl

एक कॉम्पैक्ट spectrofluorometer पर साथ-डाई, नित्य परख के लिए तालिका 3. एकत्रीकरण मिश्रण घटकों।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल अलग परख की स्थिति और फास्फारिलीकरण निर्भर तेजी ताऊ एकत्रीकरण कैनेटीक्स कि पता लगाने के साधन को दर्शाता है। टर्मिनल परख में, प्रतिदीप्ति डाई tht हर समय बिंदु पर मास्टर मिश्रण से हटा प्रतिक्रिया के एक हिस्से को जोड़ा गया है। Amyloid प्रतिदीप्ति तो 26 मापा जाता प्रेरित बाध्यकारी। दूसरे में, के साथ-डाई मोड, ताऊ एकत्रीकरण ताऊ समुच्चय के विकास की वास्तविक समय स्वत: मूल्यांकन के लिए उपयुक्त प्रतिक्रिया के इस प्रकार के प्रतिपादन, tht या ths की उपस्थिति में किया जाता है। इन तरीकों में से प्रत्येक अपने पेशेवरों और बुरा है।

टर्मिनल-मोड प्रतिक्रिया ताऊ एकत्रीकरण के लिए आवश्यक केवल उन अवयवों के साथ आयोजित किया जाता है। गिराए और thioflavin टी के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण काफी अनिवार्य रूप से प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव के लिए प्रतिक्रिया बंद हो जाता है, प्रतिदीप्ति वृद्धि की दर को धीमा। इस विधि इस प्रकार भी मैनुअल आपरेशन के साथ संगत है। हालांकि, reactio क्योंकिएन व्यावहारिक रूप से tht अलावा पर समाप्त होता है, ताऊ की एक बड़ी राशि एक एकत्रीकरण वक्र साजिश रचने के लिए आवश्यक हो सकता है। इस विधि के लिए एक अन्य संभावित चेतावनी प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए लगातार पहुंच माइक्रोबियल या प्रोटियोलिटिक संदूषण, या प्रोटीन ऑक्सीकरण शुरू हो सकता है। इसके विपरीत, के साथ-डाई मोड tht या ths की उपस्थिति में amyloid की पीढ़ी की अनुमति देता है। एकत्रीकरण की उन्नति कभी प्रतिक्रिया परेशान बिना लगातार नजर रखी जा सकती है। एक स्वचालित परख मंच की स्थापना जब यह सुविधा विशेष रूप से आकर्षक है। हालांकि, विभिन्न रंगों विशिष्ट प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना हो सकता है। दरअसल, tht काफी ताऊ और पी-ताऊ एकत्रीकरण अवरूद्ध है, लेकिन ths थोड़ा प्रभाव (आंकड़े 3 और 5 तुलना) है। PHF गठन के लिए ऊतकीय और कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है, जो कांगो लाल और thiazines, सहित कई अन्य प्रतिदीप्ति रंजक, कर रहे हैं। कम से कम एक रिपोर्ट में इन रंगों के कुछ ऊतकों में ताऊ एकत्रीकरण उत्पन्न हो सकता है कि कहा गया हैसंस्कृति कोशिकाओं 45। Amyloidogenesis कैनेटीक्स अध्ययन के लिए इन यौगिकों को चुनने इसलिए, जब सतर्कता का अभ्यास किया जाएगा और विभिन्न रंगों की तुलना में किया जा सकता है कि।

साधन के चुनाव के लिए सम्मान के साथ, पहले दृष्टिकोण में इस्तेमाल एकल नमूना fluorometer अत्यंत विश्वसनीय है, लेकिन अधिक से अधिक कुछ प्रतिक्रियाओं तुलना में किया जा करने के लिए कर रहे हैं जब आपरेशन श्रमसाध्य हो सकता है। इन नाजुक क्वार्ट्ज cuvettes के लागत से कुछ के लिए निषेधात्मक हो सकता है, हालांकि कई cuvettes, प्रतिक्रियाओं के बीच पार संदूषण से बचने में मदद कर सकते हैं। इसके विपरीत, बहु अच्छी तरह से microplate रीडर एक ही समय में कई प्रतिक्रियाओं की जांच कर सकते हैं। डिस्पोजेबल 96 अच्छी तरह से प्लेटों के उपयोग के रूप में अच्छी तरह से फायदेमंद है। एक हीटिंग तत्व के साथ, एक microplate पाठक समय की एक विस्तारित अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कई प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए एक समर्पित डिवाइस हो सकता है। हालांकि, वाष्पीकरण एक चिंता का विषय हो सकता है। DiNitto एट अल। रोकने के लिए खनिज तेल के साथ एक समान प्रतिक्रिया मढ़ावाष्पीकरण 46।

कुछ सावधानियों सुसंगत और मात्रात्मक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए ऊपर प्रोटोकॉल के लिए उठाए जाने के लिए कर रहे हैं। सबसे पहले, ताऊ और पी-ताऊ अनायास विशेष रूप से जब एक उच्च एकाग्रता में, समय के साथ amyloid के समुच्चय के रूप में। यह प्रोटीन preps के सभी aliquots फ्रीज, और प्रयोगों से पहले ही जरूरत मात्रा पिघलना करने के लिए इस प्रकार आवश्यक है। फिर भी, tht 47 द्वारा detectable बारीक मध्यवर्ती सहित कुछ समुच्चय, पुनः संयोजक प्रोटीन की तैयारी के दौरान का गठन हो सकता है। एक ठेठ एकत्रीकरण प्रतिक्रिया का एक बड़ा प्रारंभिक प्रतिदीप्ति पढ़ने इस प्रकार आम है। बहरहाल, एक पूर्व कताई कदम जोड़ने और यहां तक ​​कि एक दृश्य प्रोटीन गोली के बिना, एक अलग ट्यूब करने के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरित करने, कम करने, और ताऊ और पी-ताऊ प्रस्तुत करने का एक ही बैच के अनुरूप, प्रारंभिक प्रतिदीप्ति बनाए रख सकते हैं। दूसरे, tht का काम कर शेयर समाधान (यानी, 60 माइक्रोन) वें से पहले कम से कम एक सप्ताह के लिए आरटी पर स्थिर हैई प्रतिदीप्ति घटता है। यह इस प्रकार 60 माइक्रोन tht हर कई दिनों को फिर से बनाने की सलाह दी है।

पी-ताऊ एकत्रीकरण की पढ़ाई अंतर्निहित एक प्रमुख कारण यह है कि उपन्यास ई निदान और चिकित्सा विज्ञान का विकास है। पुनः संयोजक ताऊ एकत्रीकरण रोकना या वापस लौटने यौगिकों कि उच्च throughput स्क्रीन और लक्षित परीक्षण 18,40,41,48 से पहचान की गई है। पी-ताऊ एकत्रीकरण के लिए इन यौगिकों की प्रभावकारिता elucidated जाना बना रहता है। ये स्क्रीन विभिन्न यौगिकों के साथ अलग-अलग multiplate वेल्स को डाई के बिना एक आम एकत्रीकरण मिक्स वितरण से टर्मिनल मोड में किए गए। आमतौर पर हे / एन ऊष्मायन के बाद, tht या ths कई यौगिकों के निरोधात्मक शक्ति खुलासा, प्रतिदीप्ति माप के लिए जोड़ा गया है। साथ-डाई दृष्टिकोण से ऊपर और रैनकिन एट अल द्वारा उल्लेख किया है। 49 अभी तक उच्च throughput स्क्रीन करने के लिए शामिल किया जा सके। अब बनती की गतिज और दवा के अध्ययन के लिए उपलब्ध hyperphosphorylated ताऊ के साथपेचदार रेशा गठन, अल्जाइमर रोग दवाओं की खोज आगे अग्रिम करने के लिए की संभावना है।

अंत में, यह पी-ताऊ एकत्रीकरण का अध्ययन न केवल tauopathies के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है, लेकिन यह भी एक भी व्यापक आबादी को प्रभावित कर सकता है कि ध्यान देने योग्य है। उदाहरण के लिए, neurofibrillary tangles को ऐसे पेशेवर अमेरिकी फुटबॉल खिलाड़ियों और मुक्केबाज 50-52 के रूप में पुराने घाव मस्तिष्क विकृति के कुछ रोगियों में detectable हैं कि खबरें हैं। इसी प्रकार के सहसंबंध भी सैनिकों को 53 सहित एकल या दोहराए घाव मस्तिष्क की चोट के मरीजों के लिए सूचित किया गया है। इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल इस प्रकार neuronal कोशिकाओं में पी-ताऊ समुच्चय को लक्षित नई चिकित्सा विज्ञान की खोज और विकास में मदद कर सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizma base Sigma T1503
NaCl Macron Fine Chemicals MAL-7581-06
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Invitrogen 15576-028
Thioflavin T Sigma T3516 Stored in dark
Thioflavin S Sigma T1892 Stored in dark
heparin Sigma H3393
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma D9779 Stored at 4 °C
96-well plate Corning 3917
ISA SPEX FluoroMax-2 Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader Molecular Devices
Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody R&D Systems MAB3494 Stored at –80 °C

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बायोकैमिस्ट्री अंक 95 ताऊ अल्जाइमर रोग tauopathy फास्फारिलीकरण amyloid कटैलिसीस जिपर की मदद से प्रोटीन एकत्रीकरण neurofibrillary tangles
<em>इन विट्रो</em> एकत्रीकरण assays <em>में</em> Hyperphosphorylated ताउ प्रोटीन का उपयोग
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Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In… More

Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein. J. Vis. Exp. (95), e51537, doi:10.3791/51537 (2015).

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