Summary
توضح هذه الدراسة طريقة مفصلة لعزل وتوصيف خلايا سرطان المبيض الأولي من العينات السريرية الصلبة. تخضع سرطان المبيض العينات السريرية للهضم الأنزيمية للحصول قابلة للحياة، وخالية من الخلايا الليفية سرطان المبيض الظهاري (EOC) الخلايا مناسبة تماما للتطبيقات المصب.
Abstract
هناك حاجة ماسة إلى أدوات موثوقة للتحقيق في المبيض بدء السرطان والتقدم. في حين أن استخدام خطوط الخلايا السرطانية في المبيض لا يزال يشكل أداة قيمة لفهم سرطان المبيض، واستخدامها يملك الكثير من القيود. وتشمل هذه عدم وجود التجانس وعدد كبير من التعديلات الجينية المرتبطة ممتدة الركض في المختبر. نحن هنا وصف الأسلوب الذي يسمح لسرعة إنشاء خلايا سرطان المبيض الأساسي تشكيل العينات السريرية الصلبة التي تم جمعها في وقت الجراحة. يتكون أسلوب إخضاع العينات السريرية للهضم الأنزيمية لمدة 30 دقيقة. ولا يسمح للتعليق خلية معزولة للنمو ويمكن استخدامها لتطبيق المصب بما في ذلك فحص المخدرات. الاستفادة من خطوط الخلايا السرطانية في المبيض الأولية على خطوط الخلايا السرطانية في المبيض أنشأت هي أنها ممثل العينات السريرية محددة الأصلي يتم استخلاصها من ويمكن الحصول عليها من مواقع مختلفة سواء الوجاهةسرطان المبيض راي أو النقيلي.
Introduction
على الرغم من الإصابة به منخفضة نسبيا، وسرطان المبيض هو الأكثر دموية من الأمراض النسائية والسبب الرئيسي الخامس للوفيات السرطان بين النساء 1،2. ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود الأدوات والنماذج التي يمكن الاعتماد عليها ألخص بأمانة بدء وتطور المرض 3 هذا. وكان معظم معرفتنا اليوم عن سرطان المبيض ممكن من خلال استخدام الخلايا خلد المبيض الظهاري السطح (IOSEs)، وخطوط الخلايا السرطانية في المبيض وخلايا سرطان المبيض الأساسي تعافى من الاستسقاء السوائل 4-7. للأسف، واستخدامها لديها العديد من القيود بما في ذلك عدد من التغيرات الجينية والمظهرية المرتبطة عملية تخليد أو في الممرات المختبر، وعدم تجانس السكان الناجمة عن إعداد سائل الاستسقاء.
وبالتالي، خلايا سرطان المبيض الأولية المستمدة من العينات الصلبة القابلة للتحديد ومحددة من سرطان المبيض تمثل UNIQUأداة ه لدراسة تطور سرطان المبيض.
الصعوبات الرئيسية التي تشارك في الحصول على هذه الخلايا الخبيثة هي نتيجة لفرط نمو الخلايا اللحمية أو الخلايا الليفية جنبا إلى جنب مع فقدان الجدوى وعدم وجود سابقة لأوانها القدرة التكاثري في ثقافة هذه الخلايا EOC. توجد حاليا العديد من الطرق لخلق وحيدة الخلية تعليق من الأورام الصلبة، من خلال وسائل ميكانيكية أو تفارق الأنزيمية، ولكن تقنيات معينة تنتج كمية أكبر من نتائج المفضل 8. هنا، وتبين لنا أن الهضم الأنزيمي مع dispase الثاني النتائج في الانتعاش الفعال، والخلايا الليفية EOC خالية قابلة للحياة. ثقافات EOC حتى الحصول هي عرضة للتلاعب الجيني ومفيدة أيضا في اختبارات فحص المخدرات، مشيرا إلى أن هذه الثقافات EOC هي مناسبة للعديد من التطبيقات المصب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق
وتم الحصول على عينات الصلبة من سرطان المبيض من جامعة مينيسوتا مرفق الأنسجة المشتريات (TPF) عقب اجتماع للجنة مجلس المراجعة المؤسساتي: المجلس موضوع الإنسان (IRB) موافقة.
1. إعداد كاشف
- إعداد كاملة DMEM المتوسطة من خلال استكمال DMEM مع FBS 10٪، و 100 وحدات البنسلين الستربتوميسين. تخزين المتوسطة في 4 درجات مئوية والحارة إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها.
- قسامة dispase الثاني في مجلدات منفصلة من 5-10 مل لتجنب تجميد متعددة يذوب وتخزينها في -20 درجة مئوية في الفريزر خالية من nonfrost.
2. الأنسجة كوكتيل
- جمع العينات الصلبة من سرطان المبيض (~ 5 ز في الحجم) في وقت الجراحة من المجالات المحددة ظاهريا كما السرطان من قبل الطبيب الشرعي. يتم إلغاء تحديد العينات السريرية ومسجلة وفقا لبروتوكولات المؤسسية.
- وضع العينات في العقيمة، والشوريغطاء REW، والبولي بروبيلين حاوية العينات مليئة 30 مل من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. نقل العينات من مختبر علم الأمراض الجراحية إلى مختبر أبحاث للتجهيز على الجليد، وخلال 30 دقيقة من جمع العينات (الشكل 1).
3. معالجة الأنسجة
- العمل تحت ظروف معقمة، ونقل العينات على طبق بيتري (60 ملم × 60 ملم) تحتوي على 10 مل من الطازجة، PBS الجليد الباردة وباستخدام شفرة حلاقة معقمة، وقطع الى مزيد من أصغر قطعة ممكنة (2 ملم أو أقل) ( أرقام 2A و 2 ب).
- نقل الأنسجة المفروم إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على 10 مل من prewarmed (37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) dispase الثاني (2.4 U / مل) في DMEM واحتضان عند 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لضمان الهضم الأمثل للعينات، تستنهض الهمم يدويا الطين خلية كل 5 دقائق.
- بعد 30 دقيقة الحضانة، ونقل (باستخدام10 مل ماصة المصلية) الطين خلية على مصفاة الخلية (70 ميكرومتر شبكة) وضعت على رأس أنبوب 50 مل المخروطية وتطبيق ضغط لطيف على شبكة باستخدام المكبس المحاقن. تجاهل أي نوع من الأنسجة undissociated (المتبقية على الجزء العلوي من شبكة) وجمع تعليق خلية تم الحصول عليها في 50 مل العقيمة أنبوب مخروطي. أجهزة الطرد المركزي في 320 x ج لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية (الشكل 3).
- تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية في 10 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS.
- احتضان تعليق خلية في طبق بتري في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية (الشكل 4).
- تغيير المتوسطة بعد 24 ساعة من الطلاء الأولي. وهذا يسمح لإزالة الحطام الخلوي والغالبية العظمى من كريات الدم الحمراء موجودة في الثقافة.
- تغيير المتوسطة كل ثلاثة أيام لمدة أسبوعين التالية، وبعد ذلك ثقافات EOC الأولية مستعدون للتطبيقات المصب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم جمع العينات السريرية جديدة من سرطان المبيض بعد الجراحة (الشكل 1) ومقطعة لأجزاء صغيرة (أرقام 2A و 2B) تشكل الطين الخلية. وهذا يسمح للتعرض الأمثل للعينات لعلاج الأنزيمية. تتعرض الخلية إلى الطين الهضم الأنزيمي والمحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال فترة الحضانة يصبح الطين غائم بشكل متزايد (وخصوصا بعد كل التحريض)، وهذا هو علامة على تفصيل الأنسجة. في نهاية فترة حضانة، يتم نقل الطين على مصفاة الخلية لفصل الخلايا EOC من أي نوع من الأنسجة undissociated (الشكل 3). يتم وضع تعليق خلية تعافى بنسبة 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية (F igure 4). في هذه المرحلة مورفولوجية الثقافات الخلية يكشف وجود كل من الخلايا EOC كما تعليق خلية واحدة وكتل صغيرة. الثقافة في هذه المرحلة أيضا يكشف حاضرا م من الكريات الحمراء والحطام صغيرة كما هو مبين في الشكل 5. في حين أن الأهم EOC سوف ببطء (على مدى فترة من 1-3 أيام) التمسك البلاستيك وكرات الدم الحمراء والحطام الخلية سوف لا وأنها في نهاية المطاف وتدريجيا "تختفي من الثقافة". بعد يوم 3 من الطلاء الأولي، والثقافات EOC تظهر زيادة تمسكا مجموعات الخلايا EOC وأقل تدريجيا كرات الدم الحمراء والحطام كما هو مبين في الشكل (6). بعد يوم 6-7، وخلايا EOC تشكيل الأشكال مثل دوامة (السهم) ويبدأ في الانتشار إلى البلاستيك لتشكيل مجاميع متعددة الخلايا أكبر مما يؤدي إلى مورفولوجيا الحصوه نموذجية من الخلايا EOC كما هو مبين في الشكل 7. بعد يوم 14، وعادة ما تصبح خلايا متكدسة EOC (الشكل 8)، ونحن الآن على استعداد لاختبار المصب والتطبيقات.
pload/51581/51581fig1.jpg "/>
يتم جمع الرقم 1. جمع العينات السريرية. العينات الصلبة من سرطان المبيض في وقت الجراحة، ووضعها في العقيمة، المسمار غطاء، والحاويات البولي بروبلين عينة مليئة 30 مل من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
الشكل 2. تجهيز العينات السريرية. أ) العينة الصلبة نقلها إلى طبق بتري تحتوي على 10 مل من الطازجة والثلج الباردة برنامج تلفزيوني 1X. ب) خفض مزيد من العينات السريرية إلى قطع حوالي 2 ملم في الحجم.
الحمار = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الرقم 3. فصل الخلايا من الأنسجة EOC undissociated. بعد الهضم الأنزيمية، يتم نقل العينات السريرية على مصفاة الخلية ويتم تطبيق ضغط لطيف على العينات السريرية هضمها باستخدام المكبس المحاقن. هذا يسمح للمفرزة الميكانيكية EOC من الأنسجة الضامة والخلايا EOC الانتعاش.
الشكل 4. تصفيح الناتجة EOC خلايا تعليق. بعد إزالة أي أنسجة undissociated، يتم طرد تعليق خلية ومعلق في 10 مل من DMEM تابعaining 10٪ FBS وحضنت في طبق بتري في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية.
الرقم 5. مورفولوجيا الثقافات الخلية EOC مباشرة بعد تعليق المعالجة. الخليوي مباشرة بعد الطلاء يظهر EOC بمثابة تعليق خلية واحدة وكتل (سواء التي أشار إليها السهام)، الكريات الحمراء والحطام الخلية لا تزال كثيرة في هذه المرحلة. التكبير الأصلي، 20X.
الرقم 6. مورفولوجيا الثقافات الخلية EOC في يوم 3 بعد الطلاء ثقافة الخلية. EOC في يوم 3 بعد يظهر الطلاء شبه ملتصقة EOC جكتلة الذراع (الذي يشير إليه السهم) وأقل تلوث كرات الدم الحمراء. التكبير الأصلي، 20X.
الرقم 7. أنشئت الثقافات EOC بعد أسبوع من الطلاء الثقافة. خلية EOC أسبوع واحد بعد الطلاء الأولي يظهر مجموعات مثل دوامة من الخلايا تنتشر على البلاستيك زراعة الأنسجة. التكبير الأصلي، 20X.
الرقم 8. الثقافات متموجة EOC. مندمج أحادي الطبقة من الخلايا EOC تبين نموذجية مورفولوجيا الحصوه الظهارية بعد 14 يوما في الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فهم أفضل لمسببات سرطان المبيض والتنمية أمر حاسم لتحسين نتائج النساء المتضررات من هذا المرض المدمر. في هذا السياق، واستخدام المنشأة و"المتاحة تجاريا" لقد كان المبيض خط الخلايا السرطانية بلا شك مفيدة بشكل هائل. ومع ذلك، واليوم نحن نعرف أن خطوط الخلايا السرطانية ليست ممثلة للورم الإنسان التي نشأت من في العديد من الجوانب بما في ذلك عدم وجود التجانس 9،10.
هنا، ونحن التقرير طريقة سريعة وموثوق بها لعزل وزراعة الخلايا السرطانية في المبيض الأولية مباشرة من العينات السريرية لسرطان المبيض في غضون 30 دقيقة من العزلة الجراحية العينة.
لأنه يتم عزل الخلايا الأولية من عينة السائل الصلبة مقابل استسقاء، وهذا له ميزة عزل الخلايا من المراحل المبكرة من المرض قبل الوقت عند حدوث استسقاء تشكيل السوائل. لديه هذه التقنية أيضا أدفantage من عزل خلايا سرطان المبيض الأولية من موقع معين. النجاح في الحصول على خلايا سرطان المبيض الأولية قابلة للحياة باستخدام هذا البروتوكول يعتمد إلى حد كبير على مدى سرعة يمكن معالجتها العينة بعد الجراحة. للحصول على أفضل النتائج، يجب أن يتم استلام العينات في غضون 30 دقيقة من عملية جراحية. إذا لم يكن هذا ممكنا، يجب أن تبقى العينة في 4 درجات مئوية (في برنامج تلفزيوني) بين عشية وضحاها ومعالجتها في اليوم التالي. في تجربتنا، وتجهيز العينات التالية بين عشية وضحاها التخزين يقلل من العائد. التعرض لdispase الثاني لمدة أطول من 30 دقيقة يقلل أيضا من بقاء الخلية، وينبغي ألا يقوم به. بديل لdispase العلاج الثاني يمكن أن يكون العلاج مع كولاجيناز أو هيالورونيداز. ومع ذلك، وهذا يؤدي إلى انخفاض في العائد 8. بسبب التباين الكبير في العينات السريرية، قد يكون لها بعض التلوث خلايا الدم الحمراء أكبر بالمقارنة مع الآخرين. إذا كان هذا هو الحال، فإننا نقترح "غسل" الأنسجة المفروم (الخطوة3.1) مع برنامج تلفزيوني قبل تعريضهم لعملية الهضم الأنزيمي. هذا سوف يقلل من عدد خلايا الدم الحمراء في نهاية المطاف إعداد وتسهيل التصاق الخلايا الظهارية الأولية.
لأن العينات السريرية ليست عقيمة (فإنها تفقد العقم بمجرد وصولهم إلى مختبر علم الأمراض الجراحية)، فمن الأهمية بمكان لتنفيذ كافة الخطوات تحت ظروف معقمة بشكل صارم. بينما تلوث ثقافة الممكن، وعادة ما يحدث ذلك في أقل من 10٪ من الحالات. ويمكن استخدام بروتوكول أعلاه مع أي اتساق العينة السريرية.
القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هو أن عدد الخلايا تعافى من كل العينات تعتمد بشكل كبير على حجم العينات المقدمة. حجم عينة نموذجية من حوالي 3 سم × 3 سم. ويمثل الحد أخرى من حقيقة أنه في حين أن خلايا سرطان المبيض الأساسي تنمو باطراد لمدة تصل إلى 10 ممرات في المختبر (لذلك ال Øقرع الفرصة لجعل الأسهم قابلة للحياة) أنها senesce في نهاية المطاف وتموت، مما يحد من توافر خلايا من متبرع واحد. في حين أننا لا يؤدون أي فصل الخلايا السرطانية من الخلايا الليفية، ونحن نفترض أن مرتفعة نسبيا (10٪) تركيز المصل في جميع مراحل العملية قد تعطي خلايا سرطان المبيض ميزة البقاء على قيد الحياة أكثر من الخلايا الليفية. فمن المرجح أن الخلايا التي هي أقل عرضة للفصل من المقصورة اللحمية (الليفية) قد لا تصنف وستبقى على مرشح خلال فصل أيضا.
الخلايا التي تم الحصول عليها مع هذا البروتوكول هي مناسبة للغاية لتطبيقات المستقبل بما في ذلك التحقيقات الرامية إلى فهم العمليات التي تؤدي إلى سرطان المبيض البدء والتنمية. وتشمل التطبيقات المستقبلية أيضا باستخدام هذه الخلايا الأولية للفي المختبر والمجراة في اختبار وكلاء العلاج الكيميائي لسرطان المبيض رواية فضلا عن المؤشرات الحيوية للكشف المبكر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نود أن نشكر موظفي مرفق الأنسجة المشتريات التابعة لجامعة مينيسوتا للحصول على المساعدة في جمع عينات الأنسجة المريضة. وأيد هذا العمل من قبل برنامج بحوث سرطان المبيض وزارة الدفاع (OCRP) OC093424 لMB، من قبل راندي آلة الحلاقة لأبحاث السرطان وصندوق الجماعة لMB، من خلال مينيسوتا سرطان المبيض التحالف لMB والصندوق أمراض النساء الأورام الإدارات لMB. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
- Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
- Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
- Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
- Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
- Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
- Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
- Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
- Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
- Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).
