Summary
Deze studie beschrijft een gedetailleerde methode voor de isolatie en karakterisering van primaire eierstokkanker cellen van vaste klinische monsters. Eierstokkanker klinische monsters worden onderworpen aan enzymatische vertering om levensvatbare, fibroblast gratis ovariumcarcinoom (EOC) cellen zeer geschikt voor verdere toepassingen te verkrijgen.
Abstract
Betrouwbare instrumenten voor het onderzoeken van eierstokkanker initiatie en progressie zijn dringend nodig. Hoewel het gebruik van eierstokkanker cellijnen een waardevol hulpmiddel voor het begrijpen van eierstokkanker, het gebruik ervan heeft vele beperkingen. Deze omvatten het gebrek aan heterogeniteit en de overvloed aan genetische veranderingen geassocieerd met uitgebreide in vitro passage. Hier beschrijven we een werkwijze die zorgt voor een snelle vaststelling van primaire eierstokkanker cellen vormen vaste klinische monsters verzameld op het moment van de operatie. De methode worden klinische specimens enzymatische digestie gedurende 30 minuten. De geïsoleerde celsuspensie wordt toegestaan om te groeien en kan worden gebruikt voor stroomafwaartse toepassing waaronder drug discovery. Het voordeel van primaire eierstokkanker cellijnen vastgesteld eierstokkanker cellijnen is dat ze representatief zijn voor de oorspronkelijke specifieke klinische monsters die afkomstig zijn van en kunnen worden afgeleid van verschillende locaties of primary of uitgezaaide eierstokkanker.
Introduction
Ondanks de relatief lage incidentie, eierstokkanker is de dodelijkste van de gynaecologische aandoeningen en de vijfde belangrijkste oorzaak van sterfgevallen door kanker onder vrouwen 1,2. Dit is voornamelijk te wijten aan het gebrek aan betrouwbare instrumenten en modellen die trouw recapituleren de initiatie en progressie van de ziekte 3. De meeste van onze huidige kennis over eierstokkanker is mogelijk door het gebruik van geïmmortaliseerde ovariële oppervlak epitheelcellen (IOSEs), eierstokkanker cellijnen en primaire eierstokkanker cellen gewonnen uit ascitisvloeistof 4-7. Helaas is het gebruik ervan heeft verschillende beperkingen waaronder een aantal genetische en fenotypische veranderingen in verband met immortalisatie proces of in vitro passages en de heterogeniteit van de bevolking voortvloeien uit ascitisvloeistof bereiding.
Daarom primaire eierstokkanker cellen afkomstig van herkenbare en specifieke stevige exemplaren van eierstokkanker vertegenwoordigen een unique hulpmiddel voor het bestuderen van de eierstokken progressie van kanker.
De belangrijkste moeilijkheden bij het verkrijgen van deze kwaadaardige cellen zijn te wijten aan een overmatige groei van stromale cellen of fibroblasten, samen met het verlies van levensvatbaarheid en voortijdige gebrek aan proliferatieve capaciteit in de cultuur van deze EOC cellen. Verschillende methoden om eencellige suspensies Om vanaf solide tumoren bestaat, door mechanische middelen of enzymatische dissociatie, maar bepaalde technieken leveren een grotere hoeveelheid van de gewenste uitkomst 8. Hier laten we zien dat enzymatische digestie met dispase II resulteert in een effectief herstel van levensvatbare,-fibroblast gratis EOC cellen. De aldus verkregen EOC culturen zeer gevoelig voor genetische manipulatie en zijn ook bruikbaar in drug tests; die EOC culturen zijn geschikt voor vele verdere toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring
Solid exemplaren van eierstokkanker werden verkregen van de Universiteit van Minnesota Tissue Procurement Facility (TPF) na Institutional Review Board Committee: Human Onderwerp Board (IRB) goedkeuring.
1. Reagens Setup
- Bereid volledige DMEM medium aan te vullen DMEM met 10% FBS en 100 eenheden penicilline-streptomycine. Bewaar het bij 4 ° C en opwarmen tot 37 ° C vóór gebruik.
- Aliquot dispase II in afzonderlijke volumes van 5-10 ml meerdere bevriezing te voorkomen ontdooit en bewaar bij -20 ° C in een nonfrost gratis vriezer.
2. Tissue Collection
- Verzamel vaste specimens van eierstokkanker (~ 5 g in grootte) en het moment van de operatie uit gebieden macroscopisch aangeduid als kanker door een patholoog. Klinische monsters-en, worden geïdentificeerd en geregistreerd volgens de institutionele protocollen.
- Plaats exemplaren in een steriele, screw deksel, polypropyleen exemplaren container gevuld met 30 ml ijskoude PBS. Vervoer de monsters uit de chirurgische pathologie laboratorium naar het onderzoekslaboratorium voor verwerking op ijs, en binnen 30 minuten van specimeninzameling (figuur 1).
3. Weefsel bewerken
- Werken onder steriele omstandigheden, breng de monsters op een petrischaal (60 mm x 60 mm) met 10 ml verse ijskoude PBS en met een steriel scheermesje, verder gesneden in de kleinst mogelijke (2 mm of minder) delen ( Figuren 2A en 2 B).
- Breng het gehakt weefsel in een 15 ml conische buis met 10 ml voorverwarmde (37 ° C gedurende 30 min) dispase II (2,4 U / ml) in DMEM en incubeer bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 30 minuten. Om optimale vertering van de specimens waarborgen handmatig roeren de cel suspensie elke 5 minuten.
- Na 30 min incubatie, overdracht (met behulp van10 ml serologische pipet) de cel suspensie op een cel zeef (70 um mesh) bovenop een 50 ml conische buis en een lichte druk tegen het gaas met een zuiger toepassen. Gooi niet gedissocieerde weefsel (nog op de bovenkant van de mesh) en verzamel de verkregen celsuspensie in 50 ml steriele conische buis. Centrifugeer bij 320 xg gedurende 7 minuten bij 4 ° C (Figuur 3).
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml DMEM met 10% FBS.
- Incubeer de celsuspensie in een petrischaal op 5% CO2 en 37 ° C (Figuur 4).
- Verander het medium na 24 uur van de eerste plateren. Dit maakt het verwijderen van celafval en de meerderheid van de aanwezige cultuur erytrocyten.
- Vervang het medium elke drie dagen de volgende twee weken, waarna de culturen van primaire EOC klaar voor verdere toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verse klinische monsters van eierstokkanker verzameld na operatie (figuur 1) en in stukjes (Figuren 2A en 2B) die de cel suspensie. Dit zorgt voor een optimale belichting van de specimens aan de enzymatische behandeling. Cel suspensie wordt blootgesteld aan enzymatische digestie en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Tijdens de incubatietijd de suspensie steeds troebel (vooral na elke roeren) en dit is een teken van weefsel disaggregatie. Aan het einde van de incubatietijd wordt de suspensie overgebracht naar een cel zeef EOC cellen gescheiden van gedissocieerde weefsel (Figuur 3). De teruggewonnen celsuspensie wordt geplaatst op 5% CO2 en 37 ° C (F igure 4). In dit stadium van de morfologie van de celkweken onthult de aanwezigheid van zowel EOC cellen als een enkele celsuspensie en kleine groepjes. De cultuur op dit punt onthult ook de presentatie ce erytrocyten en gruis zoals getoond in figuur 5. Belangrijk terwijl de EOC langzaam (over een periode van 1-3 dagen) hechten aan de kunststof, erytrocyten en celresten niet en ze uiteindelijk en geleidelijk "verdwijnen uit de kweek". Per dag 3 van de eerste plating, tonen de EOC culturen toenemende hechtende EOC cel clusters en steeds minder erytrocyten en puin zoals weergegeven in figuur 6. Overdag 6-7, EOC cellen vormen krul-achtige vormen (pijl) en beginnen te verspreiden om de plastic groter multicellulaire aggregaten leidt tot de typische geplaveide morfologie van EOC cellen zoals getoond in figuur 7 te vormen. Op dag 14, EOC cellen meestal samenvloeiing (figuur 8) geworden en zijn nu klaar voor downstream testen en toepassingen.
pload/51581/51581fig1.jpg "/>
Figuur 1. Verzameling van klinische monsters. Solid specimens van eierstokkanker worden verzameld op het moment van de operatie en geplaatst in een steriele, schroefdeksel, polypropyleen specimen container gevuld met 30 ml ijskoude PBS.
Figuur 2. Verwerking van klinische monsters. A) Solid monster overgebracht naar een petrischaal met 10 ml verse ijskoude 1x PBS. B) klinische specimens verder gesneden in stukjes van ongeveer 2 mm.
Figuur 3. Scheiding van EOC cellen uit ongedissocieerde weefsels. Na enzymatische vertering, zijn klinische monsters overgebracht naar een cel zeef en een zachte druk wordt uitgeoefend op de verteerde klinische monsters met behulp van een zuiger van de spuit. Deze zorgen voor mechanische detachement van EOC uit bindweefsel en het herstel van EOC cellen.
Figuur 4. Plating van EOC resulterende celsuspensie. Na het verwijderen van niet gedissocieerde weefsel, de celsuspensie wordt gecentrifugeerd en geresuspendeerd in 10 ml DMEM containing 10% FBS en geïncubeerd in een petrischaal op 5% CO2 en 37 ° C.
Figuur 5. Morfologie EOC celkweken onmiddellijk na de verwerking. Celsuspensie onmiddellijk na plateren toont EOC als enkele celsuspensies en in groepjes (beide aangeduid door de pijlen), erytrocyten en celresten nog overvloed in dit stadium. Originele vergroting, 20X.
Figuur 6. Morfologie van EOC celculturen op dag 3 na plating. EOC celkweek op dag 3 na plating toont semi-hechtende EOC cell cluster (aangegeven door de pijl) en minder vervuiling erytrocyten. Originele vergroting, 20X.
Figuur 7. Opgericht EOC culturen na een week van plating. EOC celkweek een week na de eerste plating toont swirl-achtige clusters van cellen verspreiding op de weefselkweek plastic. Originele vergroting, 20X.
Figuur 8. Confluente EOC culturen. Confluente monolaag van EOC cellen waaruit de typische epitheliale kasseien morfologie na 14 dagen in kweek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een beter begrip van eierstokkanker etiologie en ontwikkeling is cruciaal voor het verbeteren van de uitkomst van de vrouwen die door deze verwoestende ziekte. In deze context is het gebruik van gevestigde en "commercieel verkrijgbaar" eierstokkanker cellijn ongetwijfeld enorm nuttig. Echter, vandaag weten we dat kanker cellijnen zijn niet representatief voor de menselijke tumor ze afkomstig zijn uit in vele aspecten, waaronder het gebrek aan heterogeniteit 9,10.
Hier melden wij een snelle en betrouwbare methode voor het isoleren en kweken van primaire eierstokkanker cellen direct uit klinische monsters van eierstokkanker binnen 30 min van chirurgische specimen isolement.
Omdat de primaire cellen worden geïsoleerd uit een massief model versus ascitesvloeistof dit het voordeel van het isoleren van cellen van de vroege stadia van de ziekte vóór het tijdstip ascitesvocht vorming optreedt. Deze techniek heeft ook de advantage isoleren primaire eierstokkanker cellen van een bepaalde plek. Het succes bij het verkrijgen van levensvatbare primaire eierstokkanker cellen met dit protocol is grotendeels afhankelijk van hoe snel het monster kan worden verwerkt na chirurgie. Voor het beste resultaat moet de specimens worden ontvangen binnen 30 minuten van een operatie. Indien dit niet mogelijk het specimen worden bij 4 ° C (in PBS) gedurende een nacht en verwerkt de volgende dag. In onze ervaring, de verwerking van de monsters na een nacht bewaren vermindert de opbrengst. Blootstelling aan dispase II langer dan 30 min vermindert ook de levensvatbaarheid van de cellen en mag niet worden uitgevoerd. Een alternatief voor behandeling Dispase II kan behandeling met collagenase en hyaluronidase. Dit resulteert echter in een verminderde opbrengst 8. Vanwege de grote variatie in klinische monsters, kunnen sommige grote rode bloedcellen besmetting in vergelijking met anderen. Als dat het geval is, raden wij "wassen" het gehakt weefsels (stap3.1) met PBS voorafgaand blootstellen van hen aan enzymatische digestie. Dit zal het aantal rode bloedcellen in het preparaat te verminderen en uiteindelijk hechting van de primaire epitheliale cellen te vergemakkelijken.
Omdat de klinische monsters niet steriel (ze steriliteit verliezen zodra ze aankomen bij de chirurgische pathologie laboratorium), is het essentieel om alle stappen onder strikt steriele omstandigheden. Terwijl verontreiniging van de kweek mogelijk zal doorgaans bij minder dan 10% van de gevallen. Het bovenstaande protocol kan gebruikt worden met elke consistentie van klinisch monster.
De belangrijkste beperking van dit protocol is dat het aantal cellen gewonnen uit elke monsters is sterk afhankelijk van de grootte van de specimens ontvangen. Een typisch voorbeeld van de grootte is ongeveer 3 cm x 3 cm. Een andere beperking wordt vertegenwoordigd door het feit dat de primaire eierstokkanker cellen groeien exponentieel tot 10 passages in vitro (dus bepading de mogelijkheid om levensvatbare voorraden maken) zij uiteindelijk senesce en sterven, waardoor de beschikbaarheid van cellen van een donor te beperken. Hoewel wij geen scheiding van tumorcellen uit fibroblasten voeren, veronderstellen we dat de relatief hoge (10%) concentratie van serum gedurende het proces eierstokkankercellen een overlevingsvoordeel boven fibroblasten kunnen geven. Het is ook waarschijnlijk dat cellen die minder gevoelig voor scheiding van het stromale compartiment (fibroblasten) niet kunnen splitsen en op het filter achterblijven tijdens scheiding.
Cellen verkregen met dit protocol zijn zeer geschikt voor toekomstige toepassingen waaronder onderzoek gericht op de processen die leiden tot eierstokkanker initiatie en ontwikkeling te begrijpen. Toekomstige toepassingen zijn het gebruik van deze primaire cellen in vitro en in vivo testen van nieuwe chemotherapeutische middelen tegen eierstokkanker als biomarkers voor vroege detectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag de medewerkers van de Tissue Procurement Facility van de Universiteit van Minnesota bedanken voor hulp met de patiënt weefselmonsters collectie. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Defensie eierstokkanker Research Program (OCRP) OC093424 naar MB, door Randy Shaver Kankeronderzoek en de communautaire Fonds MB, door de Minnesota eierstokkanker Alliance MB en door de Gynaecologische Oncologie Departementale fonds MB. De financiers hadden geen rol in onderzoeksopzet, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
- Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
- Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
- Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
- Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
- Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
- Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
- Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
- Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
- Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).
