Summary
Denne studien beskriver en detaljert metode for isolering og karakterisering av primære eggstokkreft celler fra solide kliniske prøver. Eggstokkreft kliniske prøver er utsatt for enzymatisk fordøyelse å få levedyktig, fibroblast-fri ovarialcancer (EOC) celler svært egnet for nedstrømsapplikasjoner.
Abstract
Pålitelige verktøy for å undersøke eggstokkreft initiering og progresjon er sterkt behov. Mens bruken av eggstokkreft cellelinjer er fortsatt et verdifullt verktøy for å forstå eggstokkreft, har deres bruk mange begrensninger. Disse inkluderer mangel på heterogenitet og overfloden av genetiske forandringer i forbindelse med utvidet in vitro aging. Her beskriver vi en fremgangsmåte som gjør det mulig for rask etablering av primære eggstokkreft celler danne faste kliniske prøver innsamlet ved tidspunktet for kirurgi. Metoden består i å underkaste kliniske prøver til enzymatisk fordøyelse i 30 min. Det isolerte cellesuspensjonen tillates å vokse og kan brukes til nedstrøms anvendelse inkludert medikament-screening. Fordelen med primære ovarian cancer cellelinjer med etablerte ovarian cancer-cellelinjer er at de er representative for de originale spesifikke kliniske prøver som de er avledet fra og kan være avledet fra forskjellige områder enten primary eller metastatisk eggstokkreft.
Introduction
Til tross for sin relativt lav forekomst, er eggstokkreft den dødeligste av de gynekologiske sykdommer og den femte største årsaken til kreft dødsfall blant kvinner 1,2. Dette er hovedsakelig på grunn av mangel på pålitelige verktøy og modeller som trofast rekapitulere initiering og progresjon av sykdommen tre. Mesteparten av kunnskapen i dag om eggstokkreft har vært mulig gjennom bruk av udødelig eggstokkene overflaten epitelceller (IOSEs), eggstokkreft cellelinjer og primære eggstokkreft celler utvinnes fra ascitesvæske 4-7. Dessverre har bruken av flere begrensninger, inkludert et antall genetiske og fenotypiske forandringer forbundet med immortalization prosess eller in vitro passasjer og heterogeniteten av befolkningen som skyldes ascitesvæske preparat.
Derfor primære eggstokkreft celler avledet fra identifiserbare og spesifikke solide eksemplarer av eggstokkreft representerer en unie verktøy for å studere eggstokkreft progresjon.
De største vanskeligheter som er involvert i å skaffe disse ondartede celler er på grunn av en overvekst av stromale celler eller fibroblaster sammen med tap av levedyktighet og for tidlig mangel på proliferative kapasitet i en kultur av disse cellene EOC. Flere metoder for å lage enkeltcellesuspensjoner av faste tumorer for tiden eksisterer, ved mekaniske midler eller enzymatisk dissosiasjon imidlertid visse teknikker gir en større mengde av den foretrukne utfall 8. Her kan vi vise at enzymatisk oppslutning med dispase II resulterer i en effektiv utvinning av levedyktige, fibroblast-fri EOC celler. De således erholdte EOC kulturer er svært utsatt for genetisk manipulasjon og er også anvendelige ved medikamentscreeningtester for å vise at disse EOC kulturer er egnet for mange nedstrøms applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Erklæring
Solid eksemplarer av eggstokkreft ble innhentet fra University of Minnesota Tissue Procurement Facility (TPF) etter Institutional Review Board Committee: Human Subject Board (IRB) godkjennelse.
En. Reagens Setup
- Forbered Komplett DMEM medium ved å supplere DMEM med 10% FBS, og 100 enheter penicillin-streptomycin. Oppbevar medium ved 4 ° C og varm til 37 ° C før bruk.
- Delmengde dispase II i separate volumer av 5-10 ml for å unngå flere fryse tiner og oppbevar ved -20 ° C i en nonfrost fritt fryser.
2. Vevsoppsamling
- Samle solide eksemplarer av eggstokkreft (~ 5 g i størrelse) på tidspunktet for kirurgi fra områder makroskopisk identifisert som kreft av en patolog. Kliniske prøver er avidentifisert og registrert i henhold til institusjonelle protokoller.
- Plasser prøvene i et sterilt, screw lokk, eksemplarer polypropylen container fylt med 30 ml iskald PBS. Transport prøvene fra det kirurgiske patologi laboratoriet til forskningslaboratorium for prosessering på is, og i løpet av 30 min fra prøvesamlingen (figur 1).
Tre. Tissue Processing
- Arbeide under sterile forhold, overføre prøvene bort på en petriskål (60 mm x 60 mm) som inneholder 10 ml frisk, iskald PBS og ved hjelp av en steril barberblad, ytterligere kutt i de minste bitene mulige (2 mm eller mindre) ( Figurene 2A og 2 B).
- Overfør hakket vev inn i et 15 ml konisk rør inneholdende 10 ml forvarmet (37 ° C i 30 min) dispase II (2,4 U / ml) i DMEM og inkuberes ved 5% CO2 og 37 ° C i 30 min. For å sikre optimal fordøyelse av prøvene, manuelt agitere cellen slurry hver 5 min.
- Etter 30 min inkubasjon overføring (ved hjelpen 10 ml serologisk pipette) i cellen oppslemmingen på en celle sil (70 mikrometer mesh) plassert på toppen av en 50 ml konisk rør og påføre et lett trykk mot nettingen ved hjelp av en sprøytestempelet. Forkast alle undissociated vev (som er igjen på toppen av mesh) og samle den oppnådde cellesuspensjonen i 50 ml sterilt konisk rør. Sentrifuger ved 320 x g i 7 min ved 4 ° C (figur 3).
- Kast supernatanten og cellepelleten suspenderes i 10 ml DMEM inneholdende 10% FBS.
- Inkuber cellesuspensjonen i en petriskål med 5% CO2 og 37 ° C (figur 4).
- Skift medium etter 24 timer fra den opprinnelige plettering. Dette gjør det mulig for fjerning av cellerester, og det meste av erytrocytter som er tilstede i kulturen.
- Endre medium hver tredje dag for de følgende to ukene, etter som de kulturer av primær EOC er klare for nedstrøms applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Friske kliniske prøver på eggstokkreft oppsamles etter operasjonen (figur 1) og kuttet i små biter (figurene 2A og 2B) som danner celle oppslemning. Dette gir mulighet for optimal eksponering av prøvene for den enzymatiske behandling. Cell oppslemming utsettes for enzymatisk fordøyelse og inkubert ved 37 ° C i 30 min. Under inkubasjonstiden slurryen stadig uklar (spesielt etter hvert agitering), og dette er et tegn på vev dekomponering. På slutten av inkubasjonstiden blir oppslemmingen overført til en celle sil for å skille EOC-celler fra en hvilken som helst undissociated vev (figur 3). Den utvunnede cellesuspensjon blir plassert i 5% CO2 og 37 ° C (F igure 4). På dette stadium morfologien av cellekulturer avslører tilstedeværelsen av begge EOC-celler som en enkeltcellesuspensjon, og i små klumper. Kulturen på dette punktet avslører også presenta ce av erytrocytter og lite avfall som vist i figur 5.. Viktigere mens EOC blir langsomt (over en periode på 1-3 dager) holder seg til plasten, erytrocytter og celleavfall vil ikke, og de vil til slutt, og progressivt "forsvinne fra kultur". Etter dag 3 fra innledende plating, viser EOC kulturer øker heft EOC celle klynger og gradvis mindre røde blodceller og rusk som vist i Figur 6. Etter dag 6-7, EOC cellene danner virvelliknende form (pil) og begynner å spre seg til plasten for å danne større aggregater flercellede fører til den typiske brostein morfologi EOC-celler som vist i Figur 7.. Ved dag 14, EOC celler vanligvis blir sammenflytende (Figur 8), og er nå klar for nedstrøms testing og applikasjoner.
pload/51581/51581fig1.jpg "/>
Figur 1. Innsamling av kliniske prøver. Faste prøver av eggstokkreft oppsamles ved tidspunktet for kirurgi og plassert i en steril, skruelokk, polypropylen prøvebeholder fylt med 30 ml iskald PBS.
Figur 2. Behandling av kliniske prøver. A) Solid prøven ble overført til en petriskål inneholdende 10 ml av frisk, iskald 1 x PBS. B) Kliniske prøver videre kuttet i biter omtrent 2 mm i størrelse.
Fig. 3. Separasjon av EOC-celler fra undissociated vev. Følge enzymatisk oppslutning, blir kliniske prøver overført til en celle sil og en mild trykk påføres på de fordøyd kliniske prøver ved hjelp av en sprøytestempelet. Dette gir mulighet for mekanisk avløsning av EOC fra bindevev og gjenvinning av EOC celler.
Fig. 4. Plating av resulterende EOC celler suspensjon. Etter fjerning eventuelle undissociated vev, blir cellesuspensjonen sentrifugert og på nytt oppslemmet i 10 ml DMEM fortsaining 10% FBS og inkubert i en petriskål med 5% CO2 og 37 ° C.
Figur 5. Morfologi EOC cellekulturer umiddelbart etter behandlingen. Cellesuspensjonen umiddelbart etter plating viser EOC som en enkelt cellesuspensjoner, og i klynger (både indikert ved pilene), erytrocytter og celleavfall fortsatt i overflod på dette stadiet. Original forstørrelse, 20X.
Figur 6. Morfologi EOC cellekulturer på dag tre etter plating. EOC cellekultur på dag tre etter plating viser semi-tilhenger EOC cell cluster (indikert med pil) og mindre erytrocytt forurensning. Original forstørrelse, 20X.
Figur 7. Etablerte EOC kulturer etter en uke fra platekledning. EOC cellekultur én uke etter første plating viser virvel-lignende klynger av celler som sprer på vevet kultur plast. Original forstørrelse, 20X.
Figur 8. Confluent EOC kulturer. Confluent monolayer av EOC celler som viser den typiske epiteliale brostein morfologi etter 14 dager i kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En bedre forståelse av eggstokkreft etiologi og utvikling er viktig for å bedre utfallet av kvinner rammet av denne ødeleggende sykdommen. I denne sammenheng, bruk av etablerte og "kommersielt tilgjengelig" eggstokkreft cellelinje har utvilsomt vært enormt nyttig. Men i dag vet vi at kreftcellelinjer ikke er representative for den menneskelige svulst de stammer fra i mange aspekter, inkludert mangel på heterogenitet 9,10.
Her rapporterer vi en rask og pålitelig metode for isolering og dyrking av primær eggstokkreft celler direkte fra kliniske prøver av eggstokkreft innenfor 30 min av kirurgisk prøven isolasjon.
Ettersom de primære cellene blir isolert fra et fast stoff prøven versus ascites fluid, har dette den fordel av å isolere celler fra tidlige stadier av sykdommen før det tidspunkt da ascites fluid dannelse inntreffer. Denne teknikken har også advantage isolere primære eggstokkreft celler fra et bestemt område. Suksessen med å få levedyktige primære eggstokkreft celler ved hjelp av denne protokollen er i stor grad avhengig av hvor raskt prøven kan bli behandlet etter operasjonen. For best resultat, bør prøvene være mottatt innen 30 min fra kirurgi. Hvis dette ikke er mulig, må prøven holdes ved 4 ° C (i PBS) over natten og behandlet neste dag. I vår erfaring, bearbeiding av prøver etter lagring over natten reduserer avkastningen. Eksponering for dispase II i mer enn 30 min også reduserer cellenes levedyktighet og ikke bør utføres. Et alternativ til dispase II-behandling kan være behandling med kollagenase eller hyaluronidase. Men dette resulterer i redusert utbytte 8.. På grunn av den store variasjon i kliniske prøver, kan noen av dem har større røde blodlegemer kontaminering sammenlignet med andre. Hvis det er tilfelle, foreslår vi "vaske" de hakket vev (trinn3,1) med PBS før å utsette dem for enzymatisk oppslutning. Dette vil redusere antallet av røde blodlegemer ved fremstillingen og derved lette adhesjon av primære epitelceller.
Fordi de kliniske prøver er ikke steril (de mister sterilitet så snart de kommer på kirurgisk patologi laboratorium), er det avgjørende å utføre alle trinnene under strengt sterile forhold. Mens kontaminering av kulturen er mulig, typisk det forekommer i mindre enn 10% av tilfellene. Den ovennevnte fremgangsmåten ble benyttet med en hvilken som helst konsistens av klinisk prøve.
Den største begrensningen av denne protokollen, er at antall celler gjenvunnet fra hver prøvene er sterkt avhengig av størrelsen på prøvene følger. En typisk eksemplar størrelse er ca 3 cm x 3 cm. En annen begrensning er representert ved det faktum at mens primær eggstokkreft celler vokse eksponensielt i opp til 10 passasjer in vitro (for således providing av muligheten til å gjøre levedyktige stocks) de til slutt senesce og dør, og dermed begrense tilgjengeligheten av celler fra en enkelt donor. Selv om vi ikke utfører noen separasjon av tumorceller fra fibroblaster, hypotese vi at den relativt høye (10%) konsentrasjon av serum i løpet av prosessen kan gi eggstokkreft celler en overlevelses fordel fremfor fibroblaster. Det er også sannsynlig at celler som er mindre utsatt for separering fra stromale rommet (fibroblaster) ikke kan disaggregate og vil forbli på filteret under separasjonen.
Celler oppnådd med denne protokollen er svært egnet for fremtidige bruksområder, inkludert undersøkelser som mål å forstå de prosesser som fører til eggstokkreft initiering og utvikling. Fremtidige søknader også inkluderer bruk av disse primære celler for in vitro og in vivo testing av nye kjemoterapi agenter for eggstokkreft samt biomarkører for tidlig deteksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke de ansatte på Tissue Procurement Facility ved University of Minnesota for å få hjelp med pasient vevsprøver samling. Dette arbeidet ble støttet av det amerikanske forsvarsdepartementet Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 til MB, av Randy Shaver kreftforskning og samfunn Fondet til MB, ved Minnesota Ovarian Cancer Alliance til MB og ved gynekologisk onkologi Avdelings fond til MB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
- Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
- Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
- Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
- Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
- Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
- Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
- Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
- Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
- Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).
